一种基于固相凝集技术的汇检式红细胞血型不规则抗体检测试剂盒及制备方法与流程

本发明涉及一种基于固相凝集技术的汇检式红细胞血型不规则抗体检测试剂盒及制备方法，属于试剂盒制备技术领域。

背景技术：

红细胞血型系统不规则抗体是指在人体内除了抗-a和抗-b以外的血型抗体。人红细胞除了abo抗原外，常见的抗原还有d、c、e、c、e、jk^a、jk^b、m、n、s、s、fy^a、fy^b、lu^b等。相应的，针对这些抗原所产生的抗体属于不规则抗体范畴。

不规则抗体多数属于免疫性抗体，其产生途径主要有：输血、妊娠、接触天然免疫性抗原物质等。这些抗体以igg型为主。对于受血者而言，体内存在不规则抗体时，一旦输入对应抗原阳性的红细胞，轻则引起溶血性输血反应，重则危及患者的生命安全；对于献血者而言，如果其体内含有不规则抗体，该抗体一旦被输入含有相应抗原的受血者，同样容易引起输血反应甚至危及生命；对于孕产妇而言，igg型的不规则抗体透过胎盘进入胎儿体内，则可引发胎儿/新生儿溶血病。因此，国家卫计委在《临床输血技术规范》中，明确规定输血前检查必须包括不规则抗体筛检试验，以降低受血者发生输血反应的风险；在临床产科实践中，也在不断的强化对多次妊娠的孕妇，将不规则抗体的筛查作为孕期保健的常规检测，以降低胎儿/新生儿发生溶血病的风险。

目前国内各级医疗机构和采供血机构检测不规则抗体的方法主要是试管法和抗人球蛋白微柱凝胶卡法。试管法主要基于igm型抗体与相应抗原在盐水介质中的反应进行试验，但不能检出igg型的不规则抗体。且试管法需要手动振摇观察，容易受操作者个人经验的影响，导致结果判读差异较大。因此，近年来，抗人球蛋白微柱凝胶卡法得到了广泛的应用。其原理主要是利用凝胶介质的分子筛作用，将凝胶颗粒悬浮在缓冲液中，灌入微柱卡中制得。实验时，在反应腔中分别加入抗筛细胞和待检血清，孵育一定时间后，再离心观察结果。如果受检标本含有不规则抗体，则形成的凝集块不能通过凝胶柱的分子筛而滞留在凝胶柱的上层或分散于柱中；若受检血清中无不规则抗体，离心后游离的试剂红细胞可以通过分子筛而沉积在微柱的底部。该方法受试剂红细胞浓度、离心力和离心时间、凝胶粒径大小、悬浮介质中抗凝剂浓度等因素影响，检测的灵敏度容易受到影响，如kidd血型系统抗体和中国人群的高频不规则抗体抗-mur等具有剂量效应的抗体，用微柱凝胶卡法检验时，容易漏检造成输血反应[briankay,jessical.poisson,chirstopherw.tuma,等.anti-jk^athataredetectedbysolid-phaseredbloodcelladherencebutmissedbygeltestingcancausehemolytictransfusionreactions.transfusion,2016,56:2973-2979.]。另一方面，微柱凝胶卡价格相对较高，需要配套的孵育和离心设备，限制了其在多数医疗机构的应用。

固相法是80年代初期由plappfv等发明的一种技术[plappfv,sinorlt,racheljm，等.asolidphaseantibodyscreen.amjclinpathol,1984,82:179.]。将特定的有机吸附剂包被于96孔微板，利用电荷吸附作用将需要吸附的抗原物质包被于微板孔中，最后用其检测相关的抗体物质。一方面，由于传统的吸附剂包被时间较长，且细胞铺板后还需要进行固定、保湿等步骤，相对耗时耗力；另一方面，包被的红细胞没有经过冻干步骤，使用期限只有24小时。因此，上述的缺陷影响了其在临床中的实际应用。但该法灵敏度高，通过对包被基质、包被后细胞的长期保存技术、指示系统等进行一系列的创新后，其效果将会得到极大改善。

现有的常规检测方法均需要以悬浮于红细胞保存液中的抗体筛选细胞来完成实验。一方面，受制于红细胞本身的寿命和保存液的质量，试剂红细胞的保存期一般小于3个月，如果不及时使用，容易造成浪费；另一方面，试剂红细胞在保存过程中，随着红细胞的衰老，不断的会发生抗原丢失和溶血，可能导致假阴性实验结果出现。

综上所述，为克服目前不规则抗体检测技术的缺陷，临床实际检测工作中迫切需要一种操作简便、能够长期保存抗原物质、减少抗体漏检且成本适当的红细胞不规则抗体检测试剂盒。

红细胞作为一种特殊的细胞，其表面分布有大量的血型抗原分子，这些抗原分子具有高度特异性，即只能够与相应的抗体发生免疫反应。当一种固相载体的表面包被了特异性的抗体分子时，红细胞表面所携带的抗原分子就会被特异性的免疫结合，这种抗原抗体之间的结合可以将红细胞强有力的固定在固相载体表面。在红细胞冷冻保护液的作用下，这种固定在固相载体表面的红细胞可以突破常规液体保存液的三个月期限，进行长期保存，且膜抗原能够长期保持稳定。

本发明拟将针对红细胞抗原的单克隆抗体包被于96孔微板的内表面，利用其高度的特异性将红细胞吸附至微板孔底，经过裂解、加入细胞保护液冷冻干燥后实现长期保存；在冻干后的微板孔中加入待检测的血浆和促进反应的低离子液，就可以快速实现红细胞抗原与待检测血浆抗体之间的免疫性结合，最后通过高灵敏度的指示系统进行指示，阳性反应将在微板孔底面呈现出均匀一致的指示红细胞单层；阴性反应则将在微板孔中央底面呈现出一个圆形的指示红细胞扣。本发明创新性的利用单克隆抗体对红细胞抗原的特异性反应将红细胞固定在固相载体内表面、利用冷冻干燥技术替代常规红细胞的保养液保存、利用高灵敏度的二步法指示系统，可以切实解决目前临床不规则抗体检测方法中灵敏度低、红细胞难以保存、常规方法漏检抗体等难题，为临床一线检测工作提供一种高性价比的红细胞血型不规则抗体检测试剂盒。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一种基于固相凝集技术的汇检式红细胞血型不规则抗体检测试剂盒，该试剂盒能够解决现有检测方法中红细胞保存期短、抗体漏检、操作繁琐、成本较高等问题。

本发明的另一个目的是提供一种基于固相凝集技术的汇检式红细胞血型不规则抗体检测试剂盒的制备方法。

本发明提供一种基于固相凝集技术的汇检式红细胞血型不规则抗体检测试剂盒，该试剂盒包括：固相凝集反应微板、低离子溶液、阴性对照血清、阳性对照血清、指示系统。

上述的汇检式固相凝集反应微板由96孔u型底可拆卸式微板条组成，微板条材质优选聚苯乙烯，其作用是包被抗红细胞单克隆抗体、固定汇检式红细胞抗原膜、容纳受检血浆、低离子液和指示系统等，本身不参与化学反应；在包被了单克隆的基础上，将汇集后的抗筛细胞固定在微板条u型孔底，经过裂解、洗涤后加入细胞膜冷冻保护液，经过冷冻干燥，即为已包被抗筛细胞膜的96孔u型底固相反应微板，可用于固相反应实验；与传统固相法不同的是，本发明采用对红细胞具有高度特异性的单克隆抗体作为包被基质，非传统固相所用的有机包被介质(如美兰)，对铺板的抗筛红细胞具有高度的吸附作用，从而将红细胞固定在u型微板孔底，形成均匀的红细胞分子单层，经过冷冻干燥后保存，不需要保湿过夜等，节省了包被时间，提高了红细胞的铺板效率；

上述微板中的汇检式抗筛红细胞膜是指3个单人份o型红细胞等量汇集后包被于u型板单个孔底内表面，其互补抗原谱至少包括：d，c，e，c，e，jk^a，jk^b，lu^b，k，m，n，s，s，fy^a，p1，mur，di^a抗原,单孔内汇集的细胞经裂解后形成的细胞膜即为汇检式抗筛细胞膜单层,可用于检测上述抗原对应的不规则抗体；3个单人份红细胞的rh抗原表型应分别为：ccdee，ccdee，ccdee；

上述的低离子强度溶液是包含了甘氨酸和0.10％叠氮化钠的缓冲液；

上述的指示系统包括指示红细胞和抗人球蛋白试剂，具体的，指示红细胞是指igg抗-d致敏的o型rhd(+)红细胞悬液，浓度为0.2～0.6％；抗人球蛋白试剂是指1:1～1:128倍稀释的羊抗人或者兔抗人igg抗体；

上述的阴性对照血清是指与上述抗筛红细胞无凝集反应的人血清并加入一定量的防腐剂，具体的，阴性对照血清是未含有不规则抗体且加入0.10％叠氮化钠的健康人血清；

上述的阳性对照血清是指与上述的筛选红细胞有凝集反应的人血清并加入一定量的防腐剂，具体的，阳性对照血清是包含有igg抗-d且加入0.10％叠氮化钠的健康人血清。

本发明提供了一种基于固相凝集技术的汇检式红细胞血型系统不规则抗体检测试剂盒制备方法，包括以下步骤：

1.组建不规则抗体筛选谱细胞系采用单克隆抗体对o型红细胞进行筛选，根据抗原互补原则，组建由3个o型红细胞组成的抗体筛选细胞系并将其等量汇集,形成汇检式的抗筛细胞群集，具体的抗原分型谱见表1：

表1拟汇集的不规则抗体筛选细胞抗原谱

2.汇检式固相凝集反应微板的制备空白微板材质优选为聚苯乙烯，其作用是包被抗红细胞单克隆抗体、固定抗筛红细胞膜、容纳受检血浆、低离子液和指示系统等，本身不参与化学反应，更具体的，微板的条与条可拆卸；抗红细胞单克隆抗体用碳酸盐缓冲液稀释后，每孔中加入100μl，室温包被16小时，在此基础上，将上述步骤(1)中的抗筛红细胞等量汇集后制备为0.1％浓度的悬液，每个微孔中加入100μl，离心5分钟后，洗涤5次，加入红细胞裂解液进行裂解；洗涤板条后，加入含8％蔗糖的冷冻保护液，50μl/孔，然后去掉孔中液体，并用吸水纸吸干残液，放入冷冻干燥机中冻干2小时，取出后装入铝箔袋中，加热密封即可；

3.低离子强度溶液的制备称取18克甘氨酸和1克叠氮钠用纯化水溶解后，定容至1l，再加入适量的溴甲酚紫溶液，直至溶液颜色由透明无色变为深紫色，调节溶液ph至6.8；

4.指示系统的制备指示系统包括指示红细胞和兔或羊抗人球蛋白试剂，指示红细胞的制备过程如下：洗涤后制成压积的o型红细胞，加入等体积的igg抗-d，37℃孵育50分钟，制得igg抗-d致敏的红细胞，生理盐水洗涤5次后，用红细胞保存液保存，抗人球蛋白试剂的制备过程如下：将兔或羊抗人球蛋白试剂用抗体稀释液进行稀释，与致敏红细胞反应，以离心后显微镜下观察至不凝集管作为抗人球蛋白试剂的稀释倍数，该稀释倍数的抗人球试剂与已致敏的o型红细胞悬液构成本发明的指示系统；

5.阴性对照血清的制备筛选出与本发明所述的抗筛细胞均无凝集反应的人血清，加入叠氮化钠，终浓度为为0.10％；

6.阳性对照血清制备是指包含有igg抗-d且加入0.10％叠氮化钠的人血清。

本发明所述的用于红细胞血型不规则抗体检测的试剂盒提供了一种新型的检测理念和技术；其优势如下：

1.本发明采用针对o型红细胞膜抗原的单克隆抗体进行板条的包被，取代目前进口同类产品中用非特异的传统吸附试剂对板条进行包被的方法，对铺板的抗筛红细胞具有高度的特异性，通过包被的抗体与抗筛红细胞的抗原发生免疫反应，从而将红细胞固定在u型微板孔底，形成均匀的红细胞分子单层，大大提高了红细胞的包被效率，传统的低性能包被基质(如美兰等)容易造成铺板的红细胞的缺边和趋中现象，导致红细胞分子单层厚薄不均，干扰后续的实验结果(图1)；

2.对ⅰc、ⅱc、ⅲc号抗筛细胞采用汇集后再铺板,实现了单个检测孔对单人份血浆含有的多种不规则抗体检测，便于降低检测成本，提高检测通量；

3.针对中国人群比较高频抗-mur抗体进行设计，特别加筛了mur(+)的红细胞(ⅰc号谱细胞)作为入选筛选细胞之一，避免了目前市面上抗筛细胞缺乏上述抗原而导致对应的抗-mur抗体漏检的问题(图4)；

4.发明中所述的包被了汇检式红细胞膜的微板条保存周期长达6个月，是常规红细胞保存时间的2倍，储存方便，避免了因红细胞保存时间短而造成的试剂浪费；制备特殊的两步法指示系统进行终点指示，提高了检测灵敏度，避免了低效价抗体的漏检(图5、图6)；同时，本发明所述的检测方法，操作过程简单且不需要特殊设备，微板条可以灵活拆卸，即可实现单人份检测，也可实现规模检测，无论是灵敏度、稳定性还是对低效价不规则抗体的检出均优于目前常用的抗人球微柱凝胶卡法，具有较好的临床应用价值。

本发明通过将抗红细胞单克隆抗体包被于96孔微板中，利用其对红细胞抗原的高度特异性反应将特定的红细胞吸附至微板孔底，经过裂解、冷冻干燥后实现长期保存；在冻干后的微板孔中加入待检测的血浆和促进反应的低离子液，就可以快速实现红细胞抗原与待检测血浆抗体之间的免疫性结合，最后通过高灵敏度的指示系统进行指示，阳性反应将在微板孔底面呈现出均匀一致的指示红细胞单层；阴性反应则将在微板孔中央底面呈现出一个圆形的指示红细胞扣。本发明通过创新性的利用抗原抗体之间特异性的免疫反应对红细胞产生高强度的吸附固定、利用冷冻干燥技术替代常规红细胞的保养液保存、利用高灵敏度的二步法指示系统，可以切实解决目前临床不规则抗体检测方法中包被铺板步骤繁琐、灵敏度低、红细胞难以保存、常规方法漏检不规则抗体等难题，为临床检测工作提供一种高性价比的分检式不规则抗体检测试剂盒。

附图说明

图1固相凝集法不同基质材料制备红细胞单层的效果对比图，微板条①和②分别为抗红细胞单克隆抗体基质与美兰基质包被，板条①制备的细胞单层均匀一致，无裂隙或缺边；板条②制备的细胞单层厚薄不均，有缺边和细胞趋中现象；

图2固相凝集法和微柱凝胶卡法凝集强度判断标准图示；

图3汇检式固相凝集反应微板冷冻干燥前后红细胞膜抗原性测试图，图中①、②分别为冷冻干燥前(h前)、后(h后)的微板条；从上至下依次用抗-d、-e、-jk^a、-jk^b、-fy^a抗体、normal(正常血浆)、neg(阴性对照)、pos(阳性对照)检测红细胞膜单层抗原；冻干前、后抗原检测均呈现4+凝集、正常血浆和阴性对照呈阴性、阳性对照呈现4+凝集；

图4汇检式红细胞血型不规则抗体检测试剂盒与常规市售抗筛细胞检测中国人群高频抗体抗-mur效果对比图，试剂盒微板条从上至下检测的血浆依次为normal(正常血浆)、抗-mur、抗-d、normal(正常血浆)、抗-mur、抗-d、neg(阴性对照)、pos(阳性对照)；常规市售抗筛细胞汇集后在微柱凝胶卡中从左至右检测的血浆依次为normal(正常血浆)、抗-mur、抗-d、normal(正常血浆)、抗-mur、抗-d。汇检式固相凝集法试剂盒可以检出低效价的抗-mur，凝集强度达到1+～2+，而常规市售抗筛细胞未检出抗-mur；

图5汇检式红细胞血型不规则抗体检测试剂盒保存期内红细胞膜抗原稳定性测试图(与微柱凝胶卡法对比)，①图：采用低效价人源抗体测试冻干后保存2个月的试剂盒红细胞膜抗原。图中试剂盒微板条从上至下依次采用效价为4和2的抗-jk^b、-jk^a、-fy^a抗体测试相应抗原，凝集强度均达到4+。微柱凝胶卡从左至右依次采用效价为4和2的抗-jk^b、-jk^a、-fy^a抗体测试新鲜红细胞的相应抗原，凝集强度介于w+～2+^s之间；②图：采用低效价人源抗体测试冻干后保存4个月的试剂盒红细胞膜抗原。图中试剂盒微板条从上至下依次采用效价为2和1的抗-jk^b、-jk^a、-fy^a抗体测试相应抗原，凝集强度均达到4+。微柱凝胶卡从左至右依次采用效价为2和1的抗-jk^b、-jk^a、-fy^a抗体测试新鲜红细胞的相应抗原，凝集强度介于w+～4+之间；③图：采用低效价人源抗体测试冻干后保存6个月的试剂盒红细胞膜抗原。图中试剂盒微板条从上至下依次采用效价为2和1的抗-jk^b、-jk^a、-fy^a抗体测试相应抗原，凝集强度均达到4+。微柱凝胶卡从左至右依次采用效价为2和1的抗-jk^b、-jk^a、-fy^a抗体测试新鲜红细胞的相应抗原，凝集强度介于w+～3+之间；

图6汇检式红细胞血型不规则抗体检测试剂盒保存期内灵敏度测试图(与微柱凝胶卡法对比)；①图：采用倍比稀释的人源igg抗-d测试冻干后保存2个月的试剂盒灵敏度。图中试剂盒微板条从上至下依次测试稀释度为2、4、8、16、32、64倍的人源抗-d，凝集强度均达到3+～4+，可测及的末管抗-d稀释度为64。微柱凝胶卡从左至右依次采用新鲜o型rhd(+)红细胞测试稀释度为2、4、8、16、32、64倍的人源抗-d，凝集强度介于2+～2+^s之间，可测及的末管igg抗-d稀释度为32；②图：采用倍比稀释的人源igg抗-d测试冻干后保存4个月的试剂盒灵敏度。图中试剂盒微板条从上至下依次测试稀释度为2、4、8、16、32、64倍的人源抗-d，凝集强度均达到4+，可测及的末管igg抗-d稀释度为64。微柱凝胶卡从左至右依次采用新鲜o型rhd(+)红细胞测试稀释度为2、4、8、16、32、64倍的人源抗-d，凝集强度介于2+～1+之间，可测及的末管igg抗-d稀释度为16；③图：采用倍比稀释的人源igg抗-d测试冻干后保存6个月的试剂盒灵敏度。图中试剂盒微板条从上至下依次测试稀释度为2、4、8、16、32、64倍的人源抗-d，凝集强度均达到3+～4+，可测及的末管igg抗-d稀释度为64。微柱凝胶卡从左至右依次采用新鲜o型rhd(+)红细胞测试稀释度为2、4、8、16、32、64倍的人源抗-d，凝集强度介于2+～1+之间，可测及的末管igg抗-d稀释度为16；

图7汇检式红细胞血型不规则抗体检测试剂盒与进口同类产品的灵敏度比较图；图中①和②微板条分别为本发明试剂盒与进口试剂盒微板条，从上至下依次测试效价为2和1的人源抗-jk^a、效价为32和16的人源抗-d，neg(阴性对照)、pos(阳性对照)。两者均能检出上述人源抗体，且凝集强度一致；图中③和④微板条分别为本发明试剂盒与进口试剂盒微板条，从上至下依次测试normal(正常血浆)、效价为8和4的人源抗-mur，neg(阴性对照)、pos(阳性对照)。本发明试剂盒能够较强的检出效价为8和4的人源抗-mur，凝集强度分别为4+和3+s，进口同类产品的凝集强度为w+，两者的检测效能有明显差异。

具体实施方式

下面结合附图及实施的实例对本发明做进一步的解释。应当理解：所举的实施例仅用于解释本发明，而不是限于本发明的保护范围。

实施例1汇检式红细胞血型不规则抗体检测试剂盒的制备

1.组建不规则抗体筛选谱细胞系采用单克隆抗体对o型红细胞进行筛选，根据抗原互补原则，组建由3个o型红细胞组成的抗体筛选细胞系，具体的抗原分型谱见表1；

2.汇检式固相凝集反应微板的制备

(1)将抗红细胞单克隆抗体用碳酸盐包被液稀释至100ug/ml，取出空白的96孔反应微板，每孔中加入100μl，室温包被16小时，甩干微孔中的液体后，用纯化水洗涤3次，最后一次用吸水纸吸干微孔中的残液；

(2)将编号为ⅰc、пc、шc号的抗筛细胞用生理盐水洗涤3次后等体积汇集制备成0.1％的抗筛红细胞悬液，已包被单克隆抗体的微板条反应孔中加入上述汇集抗筛细胞，每个微孔中加入100μl，平板离心机离心5分钟后，用生理盐水洗涤5次，甩干板条中的液体，最后一次用吸水纸吸干微孔中的残液；

(3)于上述包被红细胞单层的微板条加入0.45％的低渗盐水，50μl/孔，进行红细胞单层的裂解，甩干微孔中的液体，用生理盐水洗涤板条5次，甩干板条中的液体，最后一次用吸水纸吸干微孔中的残液；

(4)于上述微板条中加入红细胞抗原膜保护液(8％的蔗糖溶液)，50μl/孔，甩干，并用吸水纸吸干微孔中的残液，放入冷冻干燥机冻干2小时，取出后，装入铝箔袋中，加热密袋口后，放在4℃冰箱备用；

2.低离子溶液的制备

称取18克甘氨酸和1克叠氮钠用纯化水溶解后，定容至1l，再加入适量的溴甲酚紫溶液，直至溶液颜色由透明无色变为深紫色，调节溶液ph至6.8；

3.指示系统的制备

(1)致敏红细胞的制备：在洗涤后的o型压积红细胞中加入等体积的igg抗-d，37℃孵育50分钟，制得igg抗-d致敏的红细胞，生理盐水洗涤5次后，用红细胞保存液配制成0..2-0.6％的悬浮液，即为致敏红细胞；

(2)抗人球蛋白试剂：兔或羊抗人球蛋白试剂用抗体稀释液进行梯度倍比稀释(如：1:1、1:16、1:32、1:64、1:128等)，与上述的致敏红细胞反应，以离心后显微镜下观察至不凝集管作为抗人球蛋白试剂的稀释倍数，该稀释倍数的抗人球试剂与已致敏的o型红细胞构成本发明的指示系统；

4.阴性对照血清的制备：筛选出与本发明所述的抗筛细胞均无凝集反应的健康人血清，加入叠氮化钠，终浓度为0.10％；

5.阳性对照血清制备：筛选出包含有igg抗-d的健康人血清，加入0.10％叠氮化钠即可。

实施例2汇检式固相凝集反应微板冻干前后红细胞膜抗原性测试

选取有剂量效应的d、e、jk^a，jk^b、fy^a抗原作为目标抗原，用本发明中的试剂盒对含上述抗体的人血浆进行检测，以评估冷冻干燥后红细胞膜的抗原性是否发生变化。实验结果表明，冻干前后的微板条对上述抗体的检出结果一致，均为4+，表明红细胞膜的抗原性在冻干前后没有发生任何变化，结果见图3。具体操作方法如下：

1.将实施例1中制备的试剂盒取出1条微板条后，平衡至室温，从上至下将第1-8孔分别标记为-d、-e、-jk^a，-jk^b、-fy^a、normal、neg(阴性对照)、pos(阳性对照)，此冻干条为实验条。另外制备1条微板，按实施例1的步骤(2)进行，去除第4步，即不进行冻干步骤，其余标记同实验条；

2.在上述各孔中分别加入2滴(100μl)低离子溶液，并分别加入1滴(50μl)待检标本和阴、阳性对照血清至相应的孔中。低离子强度溶液有紫色变为青绿色或浅绿色，如仍为紫色则可能漏加了待检标本；

3.将微板条用封口胶封好，轻轻混匀后，置于37℃水浴箱中孵育15分钟；

4.取出孵育完毕的微板条，撕去封口胶，甩干孔中液体，用生理盐水洗涤5次。最后一次洗涤后，将微板条倒置于吸水纸上吸干残余液体；

5.加入1滴(50μl)羊/兔抗人igg后，即刻加入1滴(50μl)指示红细胞，轻轻振荡混匀；

6.将微板条放入平板离心机中，200g离心5分钟，判定结果。

实施例3汇检式红细胞血型不规则抗体检测试剂盒检测中国人群高频抗体抗-mur与常规抗筛细胞比较

以中国人群中的高频抗体抗-mur为目标检测抗体，与常规抗筛细胞进行对比。结果，本发明试剂盒能够较好的检测出抗-mur抗体，而常规抗筛细胞未能检出，见图4。具体操作方法如下：

1.将实施例1中制备的试剂盒取出1条微板条后，平衡至室温，从上至下将第1-8孔分别标记为normal(正常血浆)、-mur、-d、normal(正常血浆)、-mur、-d、neg(阴性对照)、pos(阳性对照)；

2.在上述各孔中分别加入2滴(100μl)低离子溶液，并分别加入1滴(50μl)与标记相对应的待检标本和阴、阳性对照血清至相应的孔中。低离子强度溶液有紫色变为青绿色或浅绿色，如仍为紫色则可能漏加了待检标本；

3.将微板条用封口胶封好，轻轻混匀后，置于37℃水浴箱中孵育15分钟；

4.取出孵育完毕的微板条，撕去封口胶，甩干孔中液体，用生理盐水洗涤5次，最后一次洗涤后，将微板条倒置于吸水纸上吸干残余液体；

5.加入1滴(50μl)羊/兔抗人igg后，即刻加入1滴(50μl)指示红细胞，轻轻振荡混匀；

6.将微板条放入平板离心机中，200g离心5分钟，判定结果。

实施例4汇检式红细胞血型不规则抗体检测试剂盒细胞膜抗原的稳定性和灵敏度对比测试

1.红细胞膜抗原稳定性测试：实施例1中制备的试剂盒放置于2～8℃冰箱保存，分别于保存期内的2个月、4个月、6个月取样进行试剂盒的抗原稳定性测试测试；抗原稳定性测试选择jk^a、jk^b、fy^a抗原作为目标抗原，采用常规微柱凝胶卡法容易漏检的低效价人源抗-jk^a、-jk^b、-fy^a抗体进行测试，结果显示：本发明制备的试剂盒在保存6个月内，能够被最低效价为1的人源抗-jk^a、-jk^b、-fy^a抗体检测出相应的jk^a、jk^b、fy^a抗原，凝集强度均在4+，优于常规微柱凝胶卡法，充分显示了试剂盒红细胞膜抗原良好的稳定性。具体结果见图5；

固相凝集法具体操作：

(1)将保存期内的试剂盒取出1条微板条后，平衡至室温，从上至下将第1-8孔分别标记为-jk^b、-jk^a、-fy^a、neg(阴性对照)、pos(阳性对照)，并注明相应抗体的效价；

(2)在上述各孔中分别加入2滴(100μl)低离子溶液，并分别加入1滴(50μl)与标记相对应的待检标本和阴、阳性对照血清至相应的孔中。低离子强度溶液有紫色变为青绿色或浅绿色，如仍为紫色则可能漏加了待检标本；

(3)将微板条用封口胶封好，轻轻混匀后，置于37℃水浴箱中孵育15分钟；

(4)取出孵育完毕的微板条，撕去封口胶，甩干孔中液体，用生理盐水洗涤5次，最后一次洗涤后，将微板条倒置于吸水纸上吸干残余液体；

(5)加入1滴(50μl)羊/兔抗人igg后，即刻加入1滴(50μl)指示红细胞，轻轻振荡混匀；

(6)将微板条放入平板离心机中，200g离心5分钟，判定结果。

微柱凝胶卡法具体操作：

(1)取出微柱凝胶卡，使用前应肉眼观察卡内凝胶有无干裂、气泡或异物现象，如有，则视为无效卡；若反应腔部分或封口处有气泡或液滴时，必须在使用前离心2分钟；

(2)在微柱卡下方依次标记为-jk^b、jk^a、-fy^a和所用抗体的效价(如2和1)，向上述标记好的微柱管中分别加入0.8％的o型红细胞50ul；

(3)上述各管中分别加入与标记相对应的人源抗体25ul；

(4)置于专用孵育器中37℃孵育15分钟后取出，置于专用离心机中，1030rpm离心10分钟；

(5)离心结束后，取出微柱凝胶卡观察，判定结果并记录；

2.灵敏度测试：实施例1中制备的试剂盒放置于2～8℃冰箱保存，分别于保存期内的2个月、4个月、6个月取样进行试剂盒的灵敏度对比测试；采用人源抗-d进行梯度倍比稀释后检测；结果发现，本发明制备的试剂盒在保存6个月内，各测试时间段的灵敏度无差异，且优于常规的微柱凝胶卡法2个梯度，对比检测结果见图6；具体操作方法如下表述：

固相凝集法：

(1)取试管6支，分别标记为2、4、8、16、32、64，每支试管中加入200μl抗体稀释液。将离心好的人源igg抗-d吸取200μl加入标记为2的试管中，轻轻吹打混匀，然后转移200μl该试管中的稀释液至标记为4的试管中，重复上述操作，依次转移直至最后一管(即标记为64的试管)；上述操作完成后所制备的液体即为梯度倍比稀释的人源抗-d，稀释倍数分别为2、4、8、16、32、64倍；

(2)将保存期内的试剂盒取出1条微板条后，平衡至室温，从上至下将第1-8孔分别标记为-d2、-d4、-d8、-d16、-d32、-d64、neg(阴性对照)、pos(阳性对照)；

(3)在上述各孔中分别加入2滴(100μl)低离子溶液，并分别加入1滴(50μl)对应的待检标本和阴、阳性对照血清至相应的孔中。低离子强度溶液有紫色变为青绿色或浅绿色，如仍为紫色则可能漏加了待检标本；

(4)将微板条用封口胶封好，轻轻混匀后，置于37℃水浴箱中孵育15分钟；

(5)取出孵育完毕的微板条，撕去封口胶，甩干孔中液体，用生理盐水洗涤5次。最后一次洗涤后，将微板条倒置于吸水纸上吸干残余液体；

(6)加入1滴(50μl)羊/兔抗人igg后，即刻加入1滴(50μl)指示红细胞，轻轻振荡混匀；

(7)将微板条放入平板离心机中，200g离心5分钟，判定结果；

微柱凝胶卡法具体操作如下：

(1)取出微柱凝胶卡，使用前应肉眼观察卡内凝胶有无干裂、气泡或异物现象，如有，则视为无效卡；若反应腔部分或封口处有气泡或液滴时，必须在使用前离心2分钟；

(2)在卡微柱下方依次标记为2、4、8、16、32、64，向上述标记好的微柱管中分别加入0.8％的o型rhd(+)红细胞50ul；

(3)上述各管中分别加入与标记相对应试管中的igg抗-d稀释液25ul；

(4)置于专用孵育器中37℃孵育15分钟后取出，置于专用离心机中，1030rpm离心10分钟；

(5)离心结束后，取出微柱凝胶卡观察，判定结果并记录。

实施例5汇检式红细胞血型不规则抗体检测试剂盒与进口同类产品的检测结果比较

选取中国人群中较常见且容易被漏检的不规则抗体抗-jk^a、-d、-mur等作为目标检测抗体，用本项目发明的固相凝集法汇检式检测试剂盒与同类进口产品进行平行对比检测，以测试两者之间的检测效能是否有差异；结果表明，本发明采用两步法终点指示系统对低效价不规则抗体的检测优于同类进口产品的一步法终点指示系统，见图7；具体操作方法如下：

1.固相凝集法汇检式红细胞血型不规则抗体检测试剂盒

(1)将保存期内的试剂盒取出2条微板条后，平衡至室温，将其中1条的第1-8孔分别标记为-jk^a2、-jk^a1、neg(阴性对照)、pos(阳性对照)、-d32、-d16、neg(阴性对照)、pos(阳性对照)。另一条的第1-8孔分别标记为normal(正常血浆)、normal(正常血浆)、neg(阴性对照)、pos(阳性对照)、-mur8、-mur4、neg(阴性对照)、pos(阳性对照)；

(2)在上述各孔中分别加入2滴(100μl)低离子溶液，并分别加入1滴(50μl)与标记相对应的待检标本和阴、阳性对照血清至相应的孔中，低离子强度溶液有紫色变为青绿色或浅绿色，如仍为紫色则可能漏加了待检标本；

(3)将微板条用封口胶封好，轻轻混匀后，置于37℃水浴箱中孵育15分钟；

(4)取出孵育完毕的微板条，撕去封口胶，甩干孔中液体，用生理盐水洗涤5次，最后一次洗涤后，将微板条倒置于吸水纸上吸干残余液体；

(5)加入1滴(50μl)羊/兔抗人igg后，即刻加入1滴(50μl)指示红细胞，轻轻振荡混匀；

(6)将微板条放入平板离心机中，200g离心5分钟，判定结果。

2.进口试剂盒

(1)将冰箱中保存的进口试剂盒取出2条微板条后，平衡至室温，将其中1条的第1-8孔分别标记为-jk^a2、-jk^a1、neg(阴性对照)、pos(阳性对照)、-d32、-d16、neg(阴性对照)、pos(阳性对照)；另一条的第1-8孔分别标记为normal(正常血浆)、normal(正常血浆)、neg(阴性对照)、pos(阳性对照)、-mur8、-mur4、neg(阴性对照)、pos(阳性对照)；

(2)在上述各孔中分别加入2滴(100μl)低离子溶液，并分别加入1滴(50μl)与标记相对应的待检标本和阴、阳性对照血清至相应的孔中，低离子强度溶液有紫色变为青绿色或浅绿色，如仍为紫色则可能漏加了待检标本；

(3)将微板条用封口胶封好，轻轻混匀后，置于37℃水浴箱中孵育15分钟；

(4)取出孵育完毕的微板条，撕去封口胶，甩干孔中液体，用生理盐水洗涤5次，最后一次洗涤后，将微板条倒置于吸水纸上吸干残余液体；

(5)加入1滴指示红细胞，轻轻振荡混匀；

(6)将微板条放入平板离心机中，300g离心3分钟，判定结果。