一种检测A、B亚群禽白血病病毒抗体的ELISA试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及一种病毒抗体检测试剂盒及其应用，特别涉及一种检测A、B亚群禽白血病病毒抗体的ELISA试剂盒及其应用，本发明属于病毒检测技术领域。

背景技术：

禽白血病(Avian Leukosis Disease)是由禽白血病病毒(Avian LeukosisVirus，ALV) 引起的禽类多种肿瘤性疾病的统称，主要包括淋巴细胞性白血病，其次是成红细胞性白血病、成髓细胞性白血病。此外还可引起骨髓细胞瘤、结缔组织瘤、上皮肿瘤、内皮肿瘤等。大多数肿瘤侵害造血系统，少数侵害其他组织。ALV感染除引起鸡群发病，产生肿瘤外，还可诱导严重的免疫抑制、生产性能下降等亚临床致病作用。

ALV属于反转录病毒科α反转录病毒属。根据其囊膜蛋白的抗原性，迄今为止已将ALV分为A-J十个亚群。常见的感染鸡的ALV包括A、B和J亚群。A和B 亚群ALV主要感染蛋用型鸡，引起淋巴细胞性白血病，严重危害家禽健康和生产性能。从20世纪60年代起，国际大型种鸡公司开始对禽白血病实施严格的净化措施，经过多年的努力，国际大型种鸡公司已基本消除了鸡群中A和B亚群ALV的感染。但目前我国鸡群中，尤其是地方品种鸡群中，仍然有A和B亚群ALV的流行，危害不容忽视。该病尚无彻底可行的防治措施，也无有效的疫苗可用，预防本病的主要方法是淘汰阳性鸡，开展净化种群。而抗体检测是评价净化效果和鸡群是否感染禽白血病病毒的重要技术手段，因而研制特异性好、具有自主知识产权的A、 B亚群ALV抗体的ELISA试剂盒具有重要意义。

本发明利用真核表达的截短的A、B亚群ALV(ALV-A、ALV-B)gp85蛋白建立了检测ALV-A、ALV-B抗体的间接ELISA试剂盒及其检测方法，为ALV的检测和流行病学调查以及ALV的早期诊断提供了重要技术手段。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种检测A、B亚群禽白血病病毒抗体的ELISA试剂盒，并建立了基于该试剂盒的检测方法。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

ALV的囊膜蛋白gp85含有抗原决定簇，是决定病毒亚群的蛋白，有许多病毒抗原位点。然而以全长gp85表达产物为包被抗原，与其他亚群ALV诱导的抗体有一定的交叉反应，特异性不好，为了提高特异性，本发明发明人分析比对了常引起鸡群发病的ALV-A、ALV-B和J亚群ALV(ALV-J)的gp85氨基端序列，选取了同源性尽可能低的氨基酸序列片段，分别构建了截短表达ALV-A gp85和ALV-B gp85的稳定表达细胞系，实现了A、B亚群ALV截短gp85蛋白的稳定表达。在本发明中，发明人以真核表达的截短的ALV-A gp85蛋白以及截短表达的ALV-B gp85 蛋白为包被抗原，建立了检测ALV-A、ALV-B抗体的间接ELISA方法。结果表明，本发明建立的间接ELISA方法与美国IDEXX公司抗体检测试剂盒的最低检出血清稀释度均为1：25600。但对ALV-J、CAV、REV、IBDV、AIV-H9、NDV、IBV、 ARV和ILTV等10种常见感染禽病毒检测结果表明，本发明建立的间接ELISA方法检测OD450nm值均小于0.1，均为阴性，而IDEXX公司试剂盒除了与ALV-A、 ALV-B阳性血清反应外，还与ALV-J的阳性血清反应，而本发明建立的ELISA方法仅能与AB亚群ALV的阳性血清反应，特异性优于进口试剂盒。

在上述研究的基础上，本发明提出了一种检测A、B亚群禽白血病病毒抗体的 ELISA试剂盒，其包括包被截短表达的ALV-A gp85蛋白以及截短表达的ALV-B gp85蛋白的酶标板，其中，所述的截短表达的ALV-A gp85蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的截短表达的ALV-B gp85蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4 所示。

其中，优选的，所述试剂盒还包括HRP标记的兔抗鸡IgG、阳性对照、阴性对照、包被液、稀释液、显色液、洗涤液和终止液,优选的，所述阳性对照为A、B亚群ALV阳性动物血清；所述阴性对照为健康动物血清；所述包被液为50g/L脱脂奶粉；所述稀释液为含有1％w/v牛血清白蛋白的PBST缓冲液；所述显色液为显色液 TMB；所述洗涤液为PBST缓冲液；所述终止液为2M H2SO4。

其中，优选的，所述的试剂盒用于检测A、B亚群ALV抗体时，具体的包括以下步骤：

(1)包被截短表达的ALV-A gp85和截短表达的ALV-B gp85蛋白的酶标板4℃过夜后用洗涤液洗涤，37℃下用封闭液封闭1h，洗板；

(2)加入对照和待测血清样品，37℃孵育，洗板；

(3)加入HRP标记的兔抗鸡IgG，37℃孵育，洗板；

(4)加入TMB显色液，37℃显色，最后加终止液终止反应，测定OD405nm值，当OD450nm值≥0.15时，判定为阳性。

其中，优选的，截短表达的ALV-A gp85和截短表达的ALV-B gp85包被比例为 1：1，包被量各为1μg/ml，血清样品的稀释倍数为1:500，HRP标记的兔抗鸡IgG 的稀释度为1:3000，血清样品、HRP标记的兔抗鸡IgG及TMB的作用时间分别为 30min、30min和15min，封闭液为50g/L脱脂奶粉。

其中，优选的，所述的截短表达的ALV-A gp85蛋白经由保藏编号为CGMCC NO.17419的稳定表达截短ALV-A gp85的293F细胞系表达、纯化后获得；所述的截短表达的ALV-B gp85蛋白经由保藏编号为CGMCC NO.17416的稳定表达截短 ALV-A gp85的293F细胞系表达、纯化后获得。

进一步的，本发明还提出了所述的试剂盒在制备检测A、B亚群ALV抗体试剂中的应用。

更进一步的，本发明还提出了一种稳定表达截短ALV-A gp85的293F细胞系，命名为293F-ATgp85，分类命名为表达A亚群禽白血病病毒截短gp85蛋白的293F 稳定表达细胞系，该细胞系保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其菌种保藏编号为CGMCC NO.17419，保藏时间为2019年3月28日；以及

稳定表达截短ALV-B gp85的293F细胞系，命名为293F-BTgp85，分类命名为表达B亚群禽白血病病毒截短gp85蛋白的293F稳定表达细胞系，该细胞系保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1 号院3号中国科学院微生物研究所，其菌种保藏编号为CGMCC NO.17416，保藏时间为2019年3月28日。

一种截短表达的ALV-A gp85蛋白，其由所述的稳定表达截短ALV-A gp85的 293F细胞系表达产生，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；以及

一种截短表达的ALV-B gp85蛋白，其由所述的稳定表达截短ALV-B gp85的 293F细胞系表达产生，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

编码所述的截短表达的ALV-A gp85、ALV-B gp85蛋白的核苷酸序列也在本发明的保护范围之内，其中，优选的，编码所述的截短表达的ALV-A gp85蛋白的核苷酸如SEQ ID NO.1所示；编码所述的截短表达的ALV-B gp85蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

再进一步的，本发明还提出了所述的截短表达的ALV-A gp85蛋白以及截短表达的ALV-B gp85蛋白在制备检测A、B亚群ALV抗体试剂中的用途。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

本发明利用截短表达的A、B亚群ALV gp85蛋白建立了ALV-A、ALV-B抗体间接ELISA方法及其试剂盒，试验表明，该试剂盒用于检测A、B亚群ALV抗体时，其敏感性与同类进口试剂盒相当，但特异性优于同类进口试剂盒，与J亚群ALV 抗体无交叉反应。本发明的提出为ALV-A、ALV-B的检测和流行病学调查以及 ALV-A、ALV-B的早期诊断提供了有效技术手段。

附图说明

图1为pLVX-A-Tgp85和pLVX-B-Tgp85质粒感染293T细胞包装慢病毒荧光结果，

其中，A：pLVX-A-Tgp85荧光显微镜观察结果；B：pLVX-B-Tgp85荧光显微镜观察结果；C：明场细胞观察结果；

图2为慢病毒感染的293F细胞分选后荧光检测结果；

图3为截短ALV-A gp85和ALV-B gp85蛋白表达鉴定结果，

其中，M：蛋白marker；

图4为间接ELISA方法敏感性结果；

图5为间接ELSIA方法的特异性性结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1稳定表达截短ALV-A gp85和ALV-B gp85蛋白细胞系的构建

1材料方法

1.1试剂及仪器

胎牛血清购于EXCELL公司；293CD 293M无血清培养基购于上海源培生物科技公司；DH 5α感受态大肠杆菌、293F细胞株及含有ALV-A gp85、ALV-B gp85 目的片段的质粒由本实验室保存；限制性内切酶BamH I与Xho I购于Thermo公司； PEI转染试剂购于碧云天公司；protein A树脂购于GE公司。

1.2表达截短ALV-A和ALV-B gp85蛋白真核表达载体的构建

为了使表达的A或B亚群ALV gp85蛋白仅与ALV-A或ALV-B特异性血清反应，而不与ALV-J抗体有交叉反应，本发明发明人分析比较了ALV-A、ALV-B和ALV-J gp85基因序列，选取RAV-1(ALV-A)gp85基因第322-828bp的序列和RAV-2(ALV-B) gp85基因第337-852bp的序列，进行密码子优化并合成，优化后的ALV-A gp85基因序列如SEQ ID NO.1所示，优化后的ALV-B gp85基因序列如SEQ ID NO.3所示，优化后的序列上游添加信号肽序列，下游携带Fc标签。序列两端分别为BamHⅠ和XhoⅠ两个酶切位点。将此序列双酶切后，胶回收，酶切产物用T4连接酶连接到同样经BamHⅠ和XhoⅠ酶切的慢病毒表达载体pLVX，构建成重组质粒 pLVX-A-Tgp85和pLVX-B-Tgp85。将构建的重组质粒加入至DH 5α感受态细胞悬液中，轻轻涡旋离心管混匀，冰浴放置30min，置于42℃水浴90s，然后快速置于冰上冰浴2min，加入无抗LB培养基，220r·min^-1，37℃培养1h。将转化的产物涂布于含卡那霉素的LB琼脂平板上进行筛选培养，挑选单克隆，并进行扩增培养。提取质粒，用限制性内切酶BamH I与Xho I将质粒双酶切后，挑取阳性克隆进行测序，最终获得重组质粒分别命名为pLVX-A-Tgp85和pLVX-B-Tgp85。

1.3慢病毒包装

293T细胞在含10％胎牛血清的DMEM培养基中，于37℃和5％CO2饱和湿度的培养箱中培养。待细胞生长至80％～90％密度，用0.2％的胰蛋白酶消化传代。细胞接种于6孔板，待细胞长至85％密度时，将0.1％PEI、质粒pLVX-A-Tgp85或 pLVX-B-Tgp85按照3：1的比例加入到无血清培养基中，混合后室温孵育15min，转染293T细胞，继续培养细胞48h后，荧光显微镜下观察绿色荧光在细胞的表达与分布，收集细胞上清作为包装好的病毒液。

1.4稳定表达截短ALV-A和ALV-B gp85 293F细胞系的构建、目的蛋白的表达纯化鉴定

293F悬浮细胞在2％青链霉素混合液和1％谷氨酰胺的293M无血清培养基中，于37℃和5％CO2饱和湿度的摇床培养箱中培养。加入包装好的病毒液至293F悬浮细胞中继续培养，每12h，荧光显微镜下观察绿色荧光信号在细胞的表达与分布，观察至细胞的荧光率不再升高，使用超高速流式分选仪分选表达绿色荧光蛋白的细胞。分选得到的细胞800g*4min离心后放入培养摇瓶继续培养。收集稳定转染 pLVX-A-Tgp85或pLVX-B-Tgp85质粒的分选后的293F细胞上清，加入protein A树脂，4℃结合12h之后进行纯化。将收集到的洗脱液进行SDS-PAGE凝胶电泳，转 NC膜，转膜后用PBST洗膜3次(每次5min)，将膜在5％脱脂乳中封闭1.5h，之后 PBST洗膜5次(每次5min)。Fc单抗1：3000PBS稀释为30ml，室温孵育1.5h，用PBS洗膜5次(每次5min)。加入对应二抗室温孵育1h后，用PBS洗膜5次(每次 5min)。采用Odyssey扫描仪扫描结果。

2.结果

2.1真核表达质粒pLVX-A-Tgp85和pLVX-B-Tgp85鉴定

pLVX-A-Tgp85和pLVX-B-Tgp85质粒分别经BamH I和Xho I双酶切，琼脂糖凝胶电泳结果显示，得到约1.2kb目的片段，与预期大小相符合。将阳性克隆测序，结果与原序列相符，表明质粒pLVX-A-Tgp85和pLVX-B-Tgp85构建成功。

2.2表达截短ALV-A和ALV-B gp85慢病毒的包装与鉴定

将pLVX-A-Tgp85和pLVX-B-Tgp85质粒分别转染293T细胞，48h后在倒置荧光显微镜下观察，发现绿色荧光显著，证明慢病毒包装成功(图1)。

2.3稳定表达截短ALV-A和ALV-B gp85蛋白细胞系构建与鉴定

将包装好的慢病毒感染293F悬浮细胞后，24h出现荧光，48h时荧光率达到最高，荧光率在30％左右，荧光稳定表达。如图2所示，细胞经过流式细胞术分选后，绿色荧光阳性率达到85％。收集细胞培养上清，protein A树脂纯化后，Western Blot 检测纯化产物表明，截短的ALV-A和ALV-B gp85蛋白条带大小约为65KD，与预期大小一致。表明ALV-A gp85和ALV-B gp85蛋白得以高效表达，表达量分别为 2.5mg/100ml和3.5mg/100ml(图3)。

将本发明获得的稳定表达截短ALV-A gp85的293F细胞系，命名为 293F-ATgp85，分类命名为表达A亚群禽白血病病毒截短gp85蛋白的293F稳定表达细胞系，该细胞系保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其菌种保藏编号为CGMCC NO.17419，保藏时间为2019年3月28日。

将本发明获得的稳定表达截短ALV-B gp85的293F细胞系，命名为 293F-BTgp85，分类命名为表达B亚群禽白血病病毒截短gp85蛋白的293F稳定表达细胞系，该细胞系保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其菌种保藏编号为 CGMCC NO.17416，保藏时间为2019年3月28日。

实施例2ELISA方法的建立

1材料方法

1.1试剂及仪器

HRP标记的兔抗鸡IgG、羊抗鼠FITC二抗购于Sigma公司；Protein A树脂购于GE公司：显色液TMB购于TianGen公司；酶标板购于COSTAR公司。

1.2最佳反应条件的选择

对截短ALV-A gp85和ALV-B gp85蛋白(实施例1制备)包被比例(1：1、1： 2、2：1、1：3、3：1、1：0、0：1)、各自包被浓度(4、2、1、0.5、0.25μg/ml)、样品血清工作浓度(1：125、1：250、1：500、1：1000、1：2000、1：4000)、封闭液的种类(S-Blocking Buffer、50g/L脱脂奶粉、10g/L鱼明胶、酶标板稳定剂)、 HRP标记的兔抗鸡IgG稀释度(1:8000、1:5000、1：3000)及TMB工作最佳作用时间(5、10、15、20min)等各项反应条件进行优化。选择OD450nm值接近于1.0，且P/N值最大的条件为最佳反应条件。

1.3判定标准的确定

取273只SPF鸡，采集血清作为阴性血清，进行ELISA检测，并设阴阳性对照。计算被检阴性血清平均值OD450nm值与偏差(s)，判定标准为阴性对照和阳性对照成立的条件下，检测样品判定为阳性，反之为阴性。

1.4敏感性试验和特异性试验

在最佳反应条件下，将标准阳性血清稀释成1：100、1：200、1：400、1：800、 1：1600、1：3200、1：6400、1：12800、1：25600、1：51200、1：102400、1： 204800分别进行检测，确定本方法的敏感性。将ALV-J、鸡传染性贫血病毒(CAV)、禽网状内皮组织增生症病毒(REV)、鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)、H9亚型禽流感病毒(AIV-H9)、新城疫病毒(NDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、病毒性关节炎病毒(ARV)和传染性喉气管炎病毒(ILTV)等9种常见的禽类病毒阳性血清1：500稀释，评价其特异性。

2、结果

2.1反应参数的确定

经试验确定了检测ALV-A和ALV-B抗体的间接ELISA方法反应程序如下： ALV-A gp85和ALV-B gp85蛋白包被比例为1：1，最佳包被量为各1μg/ml，血清样品最佳稀释倍数为1:500，HRP标记的兔抗鸡IgG最佳稀释度为1:3000，血清样品、酶标二抗及TMB最佳作用时间分别为30min、30min和15min，封闭液为50g/L脱脂奶粉。

间接ELISA检测的具体步骤为：

(1)包被截短表达的ALV-A gp85和截短表达的ALV-B gp85蛋白的酶标板(包被比例为1：1，最佳包被量为各1μg/ml)，4℃过夜后用洗涤液洗涤，37℃下用50g/L 脱脂奶粉封闭1h，洗板；

(2)加入稀释倍数为1:500的对照和待测血清样品，37℃孵育30min，洗板；

(3)加入稀释度为1:3000的HRP标记的兔抗鸡IgG，37℃孵育30min，洗板；

(4)加入显色液，37℃显色15min，最后加终止液终止反应，测定OD405nm值。

2.2阴阳性判断标准确定

在上述反应参数条件下，用273份ALV阴性血清进行间接ELISA，平均值为 0.064，标准差为0.0269，依据公式根据统计学原则取OD450nm值≥0.15时，可在99.9％的可信度上判定为阳性，作为检测结果的判断标准。

2.3敏感性试验和特异性试验

利用本发明建立的间接ELISA方法(简称HVRI)和IDEXX公司的禽白血病 (AB亚群ALV)抗体检测试剂盒，测定1：100、1：200、1：400、1：800、1： 1600、1：3200、1：6400、1：12800、1：25600、1：51200、1：102400不同稀释度的ALV-A、ALV-B阳性血清。结果表明，本研究建立的间接ELISA方法与IDEXX 公司抗体检测试剂盒的最低检出血清稀释度均为1：25600(图4)。对ALV-J、CAV、 REV、IBDV、AIV-H9、NDV、IBV、ARV和ILTV等9种常见感染禽病毒检测结果表明，本发明建立的间接ELISA方法检测OD450nm值均小于0.1，均为阴性，而IDEXX公司试剂盒除了与ALV-A、ALV-B阳性血清反应外，还与ALV-J的阳性血清反应(图5)。

序列表

<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心）

<120> 一种检测A、B亚群禽白血病病毒抗体的ELISA试剂盒及其应用

<130> KLPI190319

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 507

<212> DNA

<213> ALV-A gp85

<400> 1

cagctgttag gttcccagtc tctccctaac atcacaaata tcacccagat ctccggagtg 60

acaggaggat gcgtgggctt taggcctaag ggcgtgccat ggtacctggg atggtctagg 120

caggaggcaa cgcggtttct ccttagacgc ccctctttct ctaactcctc gaagcctttc 180

acagtggtga ccgccgatag gcacaatctg tttacaggca gtgagtactg cggtgcatat 240

ggctacagat tttggaacat atataactgc tcacaagtgg gccagcagta tagatgtggc 300

aacgcaaggc gccccaggcc tggacaccca gagacacagt gcaccaggag aggcggcaag 360

tgggtgaacc agtcacggaa aattaatgag acagagccgt tcagctttac ggtaacctgt 420

acagctagta acctgggcaa tgtgagcggc tgctgtggca aggccggcat gatcctgcct 480

ggcaatctgg gtcgacagca cacaagg 507

<210> 2

<211> 169

<212> PRT

<213> ALV-A gp85

<400> 2

Gln Leu Leu Gly Ser Gln Ser Leu Pro Asn Ile Thr Asn Ile Thr 15

Gln Ile Ser Gly Val Thr Gly Gly Cys Val Gly Phe Arg Pro Lys 30

Gly Val Pro Trp Tyr Leu Gly Trp Ser Arg Gln Glu Ala Thr Arg 45

Phe Leu Leu Arg Arg Pro Ser Phe Ser Asn Ser Ser Lys Pro Phe 60

Thr Val Val Thr Ala Asp Arg His Asn Leu Phe Thr Gly Ser Glu 75

Tyr Cys Gly Ala Tyr Gly Tyr Arg Phe Trp Asn Ile Tyr Asn Cys 90

Ser Gln Val Gly Gln Gln Tyr Arg Cys Gly Asn Ala Arg Arg Pro 105

Arg Pro Gly His Pro Glu Thr Gln Cys Thr Arg Arg Gly Gly Lys 120

Trp Val Asn Gln Ser Arg Lys Ile Asn Glu Thr Glu Pro Phe Ser 135

Phe Thr Val Thr Cys Thr Ala Ser Asn Leu Gly Asn Val Ser Gly 150

Cys Cys Gly Lys Ala Gly Met Ile Leu Pro Gly Asn Leu Gly Arg 165

Gln His Thr Arg 169

<210> 3

<211> 516

<212> DNA

<213> ALV-B gp85

<400> 3

ctccccaata taactaatat tactcggatc ccatccgtgg caggaggatg catcggcttt 60

acaccctacg atagtccggc tggtgtctac ggatgggatc ggagagaggt gacccacatc 120

ctgctgacag acccaggcaa caatcccttc tttgataagg cctctaactc ctcgaaaccg 180

tttacagtag tgacagccga caggcacaat ctgtttatgg gcagcgagta ctgtggcgcc 240

tacggctatc ggttctggga gatgtataac tgctctcaga tgagacagaa ttggagcatc 300

tgtcaggacg tgtggggacg aggccccccc gaaaattggt gcacaagcac aggaggtaca 360

tgggttaatc aatcaaagga gtttaatgag acagccccct tctcctttac cgtgaattgt 420

acaggcagca acctgggaaa cgtgagcgga tgctgtggag agccaatcac catcctgcca 480

ccagaggcat gggtcgacag cacacaaggt agtttc 516

<210> 4

<211> 172

<212> PRT

<213> ALV-B gp85

<400> 4

Leu Pro Asn Ile Thr Asn Ile Thr Arg Ile Pro Ser Val Ala Gly 15

Gly Cys Ile Gly Phe Thr Pro Tyr Asp Ser Pro Ala Gly Val Tyr 30

Gly Trp Asp Arg Arg Glu Val Thr His Ile Leu Leu Thr Asp Pro 45

Gly Asn Asn Pro Phe Phe Asp Lys Ala Ser Asn Ser Ser Lys Pro 60

Phe Thr Val Val Thr Ala Asp Arg His Asn Leu Phe Met Gly Ser 75

Glu Tyr Cys Gly Ala Tyr Gly Tyr Arg Phe Trp Glu Met Tyr Asn 90

Cys Ser Gln Met Arg Gln Asn Trp Ser Ile Cys Gln Asp Val Trp 105

Gly Arg Gly Pro Pro Glu Asn Trp Cys Thr Ser Thr Gly Gly Thr 120

Trp Val Asn Gln Ser Lys Glu Phe Asn Glu Thr Ala Pro Phe Ser 135

Phe Thr Val Asn Cys Thr Gly Ser Asn Leu Gly Asn Val Ser Gly 150

Cys Cys Gly Glu Pro Ile Thr Ile Leu Pro Pro Glu Ala Trp Val 165

Asp Ser Thr Gln Gly Ser Phe 172