神经丝蛋白轻链在梅毒血液检测中的应用的制作方法

本发明涉及生物医学
技术领域：
，特别涉及神经丝蛋白轻链(nf-l)在神经梅毒血液检测中的应用。
背景技术：
：梅毒在上世纪50年代开始，在我国大范围流行，随着新中国的成立，在政府强有力的防治措施下，在1964年基本消灭梅毒。然而80年代以来，包括梅毒在内的性病重新流行，特别是2000年以来，梅毒开始从高危人群向普通人群传播，全国梅毒报告发病率在乙类传染病中排第三位。从中国疾病预防控制中心官方公布的数据统计可见，近10年来，梅毒的发病率在逐年升高，从2006年的12.80(1/10万)上升至2015年的31.85(1/10万)，远远没有实现消灭梅毒的目标(参见图1)。虽然随着青霉素治疗的推广应用，梅毒患者的生存质量得到显著提升，死亡率显著下降，梅毒仍然是应该引起高度重视的乙类传染病。梅毒是由梅毒螺旋体侵入人体后引起的一种全身性、感染性疾病。梅毒螺旋体是一种小而纤细的螺旋状微生物，横断分裂的方式进行繁殖，其结构中有维持螺旋体弹性的轴纤维，可以屈曲及伸缩，有利于梅毒螺旋体穿入宿主组织。梅毒螺旋体在人体外不易生存，煮沸立即死亡，干燥肥皂水以及酒精等一般的消毒剂可以很容易将其杀死，因此目前不能体外培养，梅毒螺旋体在低温(-78℃)下可保存数年，仍能保持其形态活力及毒性。梅毒螺旋体在不能体外培养可以在一定程度上限制了梅毒螺旋体的传播和侵入，但是也使得对梅毒螺旋体的研究以及对梅毒疾病的研究造成了极大的困难和不变，因此目前梅毒的诊断、治疗以及预后研究进展不大。当梅毒螺旋体侵入人体后，首先在皮肤粘膜的侵入部位繁殖，形成一期梅毒硬下疳，为界限清楚、边缘隆起、基底坚实、软骨样硬度的无痛性圆形或椭圆形浅在性溃疡，并可伴随腹股沟或患侧淋巴结肿大。若一期梅毒未治疗或者治疗未彻底，则梅毒螺旋体可通过淋巴系统进入血液循环，播散至全身，临床上主要表现为二期梅毒疹，包括斑疹、丘疹、脓庖等等。一期梅毒硬下疳和二期梅毒疹都具有自限性，且一般不留痕迹，如果未能治疗或者治疗不成功，则进入隐性梅毒阶段。梅毒螺旋体在人体内潜伏数年后(2年及以上)，对所潜伏的器官造成不同程度的损害，可累及神经系统、心脏、骨骼、血管等，即进入三期梅毒。需要注意的是，已有研究证明早期梅毒患者的脑脊液接种于动物后可分离到梅毒螺旋体，说明梅毒螺旋体在侵入人体早期，就能够入侵到神经系统。神经梅毒并非是只发生在三期梅毒，而是可以发生于梅毒的各个阶段。神经梅毒可分为无症状神经梅毒(asymptomaticneurosyphilis)、脑脊膜梅毒(meningealsyphilis，包括梅毒性脑膜炎和梅毒性硬脊膜炎)、脑膜血管梅毒(meningovascularsyphilis)、实质性神经梅毒(麻痹性痴呆(generalparesis)和脊髓痨(tabesdorsalis))及树胶肿性神经梅毒。无症状神经梅毒是指梅毒的血浆学检查阳性，脑脊液存在异常，但是无神经系统的症状和体征。o’leary等人的研究发现，13.5％的梅毒患者(包含各个梅毒阶段)是无症状神经梅毒，而keidel等人在一期梅毒和二期梅毒的研究中发现20％的患者至少存在一种脑脊液异常(o’learypa,colehn,mooreje,etal.cooperativeclinicalstudiesinthetreatmentofsyphilis:asymptomaticneurosyphilis.archdermsyphilol1937；35:387–401；keidela,mooreje.studiesinasymptomaticneurosyphilisi:atentativeclassificationofearlyasymptomaticneurosyphilis.archneurolpsychiatry1921；6:286–291y)。无症状神经梅毒通常发生在感染后的12至18个月，是神经梅毒的最初阶段，无症状神经梅毒患者比脑脊液正常的梅毒患者更容易进展为有症状神经梅毒，因此应对可疑患者进行脑脊液检查，以期早发现早治疗，避免无症状神经梅毒进展为有症状神经梅毒。脑脊膜梅毒包括梅毒性脑膜炎和梅毒性硬脊膜炎，主要发生于梅毒感染后的12个月内，可发生于1.4％至6％的梅毒患者中，主要原因是早期梅毒阶段未能得到充分治疗。脑膜血管梅毒包括脑血管梅毒和脊髓脑膜血管梅毒，一般感染梅毒后的5到12年发生，在抗生素未发明之前，3.2％到15％的梅毒患者会进展为脑膜血管梅毒。实质性神经梅毒是较晚期的神经梅毒，包括麻痹型痴呆和脊髓痨。麻痹型痴呆的平均潜伏期为15-20年，据报道，5％的梅毒患者会进展为麻痹型痴呆，而未经治疗的麻痹型痴呆患者会在5年内死亡。树胶肿性神经梅毒，在神经梅毒中比较罕见，包括脑树胶肿以及脊髓树胶肿，树胶肿发病部位的不同导致临床表现也不同，脑树胶肿主要表现为脑肿瘤类似症状，例如进行性神经系统症状、癫痫、颅内压增高等，mri可出现与脑膜瘤类似的线性强化。而脊髓树胶肿累及颈椎部时可导致四肢麻痹，累及胸椎时则可导致下肢轻瘫等等。梅毒被称为最伟大的模仿者，而神经梅毒的临床表现亦是复杂多变，症状无特异性，几乎包括神经病学中的所有各种症状与体征，可出现神经科、眼科、皮肤科、精神科等科相似的临床表现，因此对神经梅毒的误诊率高，误诊率达55.6％，比如神经梅毒引起的青壮年不明原因脑梗死，青壮年出现癫痫、智能障碍等可能被误诊，因此，神经梅毒的正确诊断和及时治疗是非常重要的。目前并没有诊断神经梅毒的金标准，实验室检测有助于神经梅毒的诊断；但是并没有单个检测方法可用于所有情况下神经梅毒的诊断。神经梅毒的诊断依赖于血浆学试验、脑脊液(csf)检查、神经症状和体征的综合分析。对于出现神经梅毒临床症状的患者需要进一步测试。血浆学试验主要包括两类试验，即非梅毒螺旋体抗原血浆试验和梅毒螺旋体抗原血浆试验。非梅毒螺旋体抗原血浆试验是以心磷脂作为抗原，检测血浆中的对心磷脂有反应的抗体，其中目前应用最广泛的是快速血浆反应素环状卡片试验(rpr，rapidplasmareagin)，该方法操作简便、迅速，试验结果清晰易读，简便快速，稳定性好。其原理是利用心磷脂、卵磷脂及胆固醇组成混合物作为抗原，用特制的活性炭颗粒进行吸附，通过肉眼观察白色纸板上有无黑色凝集颗粒出现而直接进行结果判断。梅毒螺旋体抗原血浆试验是针对作为抗原的梅毒螺旋体特异成分，因此被用于筛查和确诊梅毒感染。梅毒螺旋体明胶凝集实验(tppa)把致病性tp的精致菌株成分包被在人工载体明胶粒子上，检测血浆中梅毒相应的抗体，由于试剂制备过程排除了各种非特异性反应，敏感性和特异性均较高，是目前主要的梅毒螺旋体抗原血浆试验。脑脊液检查主要包括csf-rpr、csf白细胞计数或蛋白水平。csf-rpr与血浆rpr原理相同，特异性与脑脊液性病研究实验室(vdrl，venerealdiseaseresearchlaboratory)试验(csf-vdrl)相似，但是敏感性比csf-vdrl高，是目前常用的脑脊液梅毒螺旋体非特异性抗体试验，一般csf-rpr阳性，即可诊断神经梅毒。神经梅毒的重要参考指标还包括脑脊液细胞计数或蛋白水平，在csf-rpr为阴性结果时，如果出现神经梅毒临床征象、血浆学检测阳性以及脑脊液细胞计数(一般csf白细胞计数>5/μl为异常，对于合并hiv感染的患者，脑脊液细胞计数会偏高，为提高诊断准确性，这类患者脑脊液细胞计数异常的标准应提高为白细胞>20/μl)和/或蛋白水平异常，可以考虑诊断为神经梅毒。多项临床研究证实，神经梅毒患者脑脊液中蛋白质含量升高程度与病情严重程度呈正相关，与远期预后呈负相关；神经梅毒患者脑脊液中寡克隆区带(ocb)阳性，脑脊液tau蛋白含量升高，或cxcl13升高等均提示中枢神经系统内发生了免疫应答。但是目前并没有可信的反映神经梅毒神经损伤程度的生物学标志物。因此，寻找评估神经梅毒患者神经受损程度以及预后的指标显得尤为重要。神经细胞轴索由3种骨架蛋白即微丝、微管和中间纤维(intermediatefilaments，ifs)组成的复合网络系统，它决定了细胞的形状、强度、支撑作用，并在细胞运动、膜泡运输、细胞分裂、信号转导中起重要作用。中间纤维是一种空心纤维结构，直径为10nm，介于微管以及微丝之间，主要分为神经丝蛋白和角蛋白等六类。中间纤维对细胞核有固定作用、给细胞提供机械强度、参与细胞连接、对细胞内物质运输起作用、参与细胞分裂活动、参与信息传递活动等。神经丝蛋白只表达于神经细胞，包括神经丝蛋白轻链(neurofilament-light，nf-l)、神经丝蛋白中链(neurofilament-medium，nf-m)、神经丝蛋白重链(neurofilament-heavy，nf-h)三种亚结构；其结构与其他中间纤维类似，包括头部氨基区、α螺旋的杆状区以及尾部羧基区。神经丝蛋白的作用是稳定轴索的形态，保持其直径及维持其稳定的传导速度，并在神经元分化，轴突生长和再生过程等过程中发挥作用。据报道，能够反映中枢神经系统损伤的标记物很多，如β淀粉样前体蛋白及β淀粉样蛋白、髓鞘碱性蛋白、神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白tau等，在神经梅毒也有一些变化，但都存在特异性都不强等诸如此类的问题。神经丝蛋白在肌萎缩性脊髓侧索硬化症(amyotrophiclateralsclerosis，als)、帕金森病(parkinson’sdisease，pd)、阿尔兹海默症(alzheimer’sdisease，ad)、腓骨肌萎缩症(charcot-marie-toothdisease，cmt)、神经元中间丝包涵体病(neuronalintermediatefilamentinclusiondisease，nifid)、糖尿病性神经病变(diabeticneuropathy)、脊髓型肌萎缩(spinalmuscularatrophy)等疾病中都有变化，推测神经丝蛋白的异常与多种神经系统疾病有关，但是其细胞分子学机制尚不清楚。nf-l是神经丝蛋白中最先被表达的亚结构，分子量为68kda。nf-h也是组成神经丝蛋白的主要成分之一，分子量为205kda，是最后表达的神经丝蛋白，与扩增轴索直径以及提高轴索传导速度直接相关。据报道，nf-l与nf-h的表达水平是相互独立的，这可能与它们的基因组定位不同有关。nf-h的羧基端有51个磷酸化的位点，从近端到远端，磷酸化程度不同。在神经元胞体或者树突中，nf-h基本无磷酸化存在，而在神经元轴索中，则多以磷酸化的形式即磷酸化神经微丝蛋白重链(phosphorylatedneurofilament-heavy，pnf-h)存在，nf-h对于稳定轴索形态以及神经信号的传导起到重要作用。技术实现要素：本发明第一方面提供了一种梅毒检测试剂盒，所述试剂盒包括用于检测血nf-l水平的检测试剂。本发明第二方面提供了一种用于检测血nf-l的检测试剂在制备神经检测试剂盒中的应用。本发明人通过对神经梅毒患者血液中nf-l水平进行研究，首次发现血nf-l异常与神经梅毒的发展及相关症状的发生存在一定相关性，因而对于神经梅毒具有重大的临床意义。由于有症状神经梅毒患者组血nf-l与无症状神经梅毒患者组血nf-l相比较差异有统计学意义，说明不同临床分型或分期神经梅毒患者脑脊液中的蛋白分子水平有所不同，患者脑脊液中的蛋白分子水平有所不同，免疫反应程度及免疫损伤程度也不同，因此可以根据其蛋白分子水平方便地对梅毒进行早期诊断、分型分期、疗效评价和/或预后评估。附图说明图1是中国2006年-2015年梅毒发病率(1/10万)。注：2006年12.80、2007年15.88、2008年19.49、2009年23.07、2010年26.86、2011年29.47、2012年30.44、2013年30.04、2014年30.93、2015年31.85。图2显示了各组患者血液的nf-l分析结果。其中，ns表示有症状神经梅毒组(n＝20)；ans表示无症状神经梅毒组(n＝46)；s表示隐性梅毒组(n＝18)。图3显示了各组患者的平均血液nf-l水平。其中，ns表示有症状神经梅毒组(n＝13)；ans表示无症状神经梅毒组(n＝46，包括27名脑脊液trust阳性(+)患者和19名脑脊液trust阴性(-)患者)；s表示隐性梅毒组(n＝18)。具体实施方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。但是，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明第一方面提供了一种梅毒检测试剂盒，所述试剂盒包括用于检测血nf-l水平的检测试剂。优选的是，所述梅毒为神经梅毒，更优选为有症状神经梅毒。在一些优选的实施方式中，所述检测试剂为用于对血nf-l进行定性检测或定量检测的检测试剂。更优选的是，所述检测试剂为用于对血nf-l进行定量检测的检测试剂。在一些优选的实施方式中，所述血nf-l水平为血nf-l蛋白水平，更优选的是，所述检测试剂为抗nf-l的抗体，进一步优选的是，所述抗体为抗人nf-l的抗体，更进一步优选的是，所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体，最优选为单克隆抗体。所述单克隆抗体可以是已知的，例如从商业试剂公司(如r&dsystems,inc.，genetexinternationalcorporation，abcam等)购得的单克隆抗体，或者从德国ibl等公司购得的nf-l蛋白酶联诊断试剂盒中包括的单克隆抗体。在一些优选的实施方式中，所述试剂盒还包括可选的第二检测试剂，所述第二检测试剂为用于选自vdrl(venerealdiseaseresearchlaboratory(性病研究实验室))检测、usr(unheatedserumregain(血浆不需加热的反应素))检测、trust(toluidineredunheatedserumtest(甲苯胺红血浆不需加热试验))检测、rpr(rapidplasmaregain(快速血浆反应素))检测、fta-abs(fluorescenttreponemalantibody-absorption(荧光螺旋体抗体吸收))检测、tpha(treponemapallidumhemagglutinationassay(梅毒螺旋体血凝试验))检测、tppa(treponemapallidumparticleagglutinationassay(梅毒螺旋体颗粒凝集试验)检测、elisa(enzyme-linkedimmuno-sorbentassay(酶联免疫吸附试验)检测、脑脊液nf-l检测、血pnf-h检测、脑脊液pnf-h检测组成的组的一种或者多种梅毒检测方法的检测试剂，这些梅毒检测方法及其所用的试剂都是已知的。例如，vdrl检测、usr检测、trust检测、rpr检测、fta-abs检测、tpha检测、tppa检测和elisa检测及其所采用的试剂均可以行业标准如梅毒诊断标准(ws273-2007)所述。血或脑脊液nf-l的检测试剂可以如商用试剂盒(neurofilamentlight)elisa(enzymeimmunoassayforquanlitativedeterminationofhumanneurofilamentlight(nf-l)proteinincerebrosphinalfluid)(lblinternationalgme)所述，血或脑脊液pnf-h的检测试剂可以如商用试剂盒humanphosphorylatedneurofilamenthelisa试剂盒(biovendor-laboratornímedicínaa.s.)所述。更优选的是，所述第二检测试剂为用于选自由rpr检测、tppa或tpha检测、fta-abs检测、脑脊液nf-l检测、血pnf-h检测、脑脊液pnf-h检测组成的组的梅毒检测方法的检测试剂；进一步优选的是，所述第二检测试剂为用于fta-abs检测和/或tppa检测的检测试剂。fta-abs以及tppa是诊断梅毒螺旋体感染特异性指标，一般认为脑脊液fta-abs阴性可以排除神经梅毒，该指标结合nf-l检测结果，能够增加诊断神经梅毒的敏感性和特异性。在一些优选的实施方式中，所述试剂盒还包括用于辅助抗nf-l的抗体通过elisa检测法检测血nf-l的辅助试剂。在一些优选的实施方式中，所述辅助试剂包括选自由nf-l抗体包被微滴定板条、nf-l抗体溶液、辣根过氧化酶偶联物溶液、nf-l蛋白标准样品、稀释缓冲液、洗涤液、底物溶液、终止液组成的组。在一些优选的实施方式中，所述试剂盒还包括血液采集器械、抗凝采血管和/或促凝采血管。所述血液采集器械可以用来从患者或者疑似患者采集全血；所述抗凝采血管可以用来由全血制备待测血浆；所述促凝采血管可以用来由全血制备血清。在本发明中，待测的生物样品可以是血液样品，更优选为血浆或者血清。所述血液采集器械、抗凝采血管和/或促凝采血管都是本领域已知并且常用的，本领域技术人员在有能力选择用来实施本发明。本发明第二方面提供了用于检测血nf-l的第一检测试剂和可选的第二检测试剂在制备检测试剂盒中的应用。所述第一检测试剂可以如本发明第一方面所述。例如，所述第一检测试剂可以为用于对血nf-l进行定量检测或定性检测的检测试剂，例如，所述检测试剂盒为用于通过elisa检测法对血液样品中的nf-l进行定性或者定量检测的检测试剂盒。更优选的是，所述检测试剂为抗nf-l的抗体，进一步优选的是，所述抗体可以为抗人nf-l的抗体；更进一步优选的是，所述抗体为单克隆抗体。所述单克隆抗体可以如上所述。所述第二检测试剂可以为用于检测选自由脑脊液nf-l水平、脑脊液pnf-h水平、脑脊液rpr滴度、血液rpr滴度、脑脊液白细胞、脑脊液蛋白、治疗前和治疗后血nf-l差值、治疗前和治疗后脑脊液nf-l差值、治疗前和治疗后脑脊液pnf-h差值组成的组的指标的检测试剂。在一些优选的实施方式中，所述试剂盒为用于对神经梅毒进行早期诊断、分型分期、疗效评价和/或预后评估的试剂盒。在对神经梅毒进行诊断(包括早期诊断、分型分期、疗效评价和/或预后评估等)时，可以根据血nf-l水平对神经梅毒患者进行分型分期(即对神经梅毒进行分型和/或分期)；或者，可以根据血nf-l预后相对于预前(或称为治疗前)的差值对神经梅毒患者进行预后评估。于是，在一些具体的实施方式中，本发明提供了一种梅毒检测试剂盒，所述试剂盒包括用于检测血nf-l水平的检测试剂，并且用于对神经梅毒患者进行分型分期或者预后评估。本发明还提供了所述检测试剂在制备用于对神经梅毒患者进行分型分期(即对神经梅毒进行分型和/或分期)或者预后评估的试剂盒中的应用。在对神经梅毒进行诊断(包括早期诊断、分型分期、疗效评价和/或预后评估等)时，可以将血nf-l水平独立地或者与选自由脑脊液nf-l水平、脑脊液pnf-h水平、脑脊液rpr滴度、血液rpr滴度、脑脊液白细胞、脑脊液蛋白、治疗前和治疗后血nf-l差值、治疗前和治疗后脑脊液nf-l差值、治疗前和治疗后脑脊液pnf-h差值组成的组中一个或者多个指标结合地用于对神经梅毒进行早期诊断、分型分期、疗效评价和/或预后评估。于是，在一些具体的实施方式中，本发明提供了一种梅毒检测试剂盒，所述试剂盒包括：用于检测血nf-l水平的第一检测试剂；可选的第二检测试剂，所述第二检测试剂用于检测选自由脑脊液nf-l水平、脑脊液pnf-h水平、脑脊液rpr滴度、血液rpr滴度、脑脊液白细胞、脑脊液蛋白、治疗前和治疗后血nf-l差值、治疗前和治疗后脑脊液nf-l差值、治疗前和治疗后脑脊液pnf-h差值组成的组中的一个或者多个指标。本发明还提供了所述第一检测试剂和/或所述第二检测试剂在制备用于对神经梅毒进行早期诊断、分型分期、疗效评价和/或预后评估的检测试剂盒中的应用。在本发明中，血nf-l水平、脑脊液nf-l水平、脑脊液pnf-h水平、脑脊液rpr滴度、血液rpr滴度、脑脊液白细胞数、脑脊液蛋白量都是通过已知的检测方法检测的，治疗前和治疗后血nf-l差值、治疗前和治疗后脑脊液nf-l差值、治疗前和治疗后脑脊液pnf-h差值都可以通过已知方法测得的数据求算的。例如，nf-l、pnf-h都可以采用商用试剂盒测得，其他指标都可以根据我国行业标准梅毒诊断标准(ws273-2007)规定的方法测得。神经梅毒是梅毒螺旋体侵犯中枢神经系统而引起的慢性感染性疾病，可以造成难以恢复的神经系统损害，是梅毒致残的主要原因，因此神经梅毒已经成为严重威胁人类健康的疾病。本发明人经过研究发现，血nf-l水平与神经梅毒的发展及相关症状的发生存在一定相关性，有症状神经梅毒患者血nf-l水平与无症状神经梅毒患者相比较差异有统计学意义，说明不同临床分型或分期神经梅毒患者血nf-l水平的蛋白分子水平有所不同，免疫反应程度及免疫损伤程度也不同。神经丝蛋白只存在于神经细胞当中，神经细胞特异性强，并且有很强的抗酶解能力。神经细胞受损后，nf-l会释放到血液中。本发明人通过对神经梅毒患者血nf-l水平的研究，发现血nf-l水平具有重大的临床意义，并探索其相关影响因素。虽然脑脊液是反应神经组织病理性改变的敏感指标，是生物学标志物的最佳选择，但是其适用人群范围窄并且具有一定潜在风险，因此本发明人分析nf-l水平在血液中的水平及其与其他因素的相关性可以为神经梅毒的早期诊断、分型分期、疗效评价和/或预后评估提供可靠且有效的技术方案。实施例1、患者一般临床资料本研究共入组患者92例，年龄中位数为37.5岁，年龄最大值为68岁，最小值为17岁。根据ws273-2007梅毒诊断标准诊断为有症状神经梅毒组、无症状神经梅毒和隐性梅毒。其中，有症状神经梅毒组23例；无症状神经梅毒组51例；隐性梅毒对照组18例。有症状神经梅毒组男性17例，女性6例；年龄中位数为54岁，年龄最大值66岁，年龄最小值32岁；已婚20例，未婚1例，离婚1例，丧偶1例。血浆tppa全部阳性；血浆rpr滴度1:1患者1例，1:4患者2例，1:8患者2例，1:16患者3例，1:32患者4例，1:64患者4例，1:128患者2例，1:256患者5例。脑脊液tppa阳性23例；脑脊液rpr滴度阴性1例，1:1患者6例，1:2患者3例，1:4患者5例，1:8患者3例，1:16患者4例，1:32患者1例。脑脊液蛋白中位数为62.3mg/dl，最大值为191.6mg/dl，最小值为30mg/dl。脑脊液白细胞数中位数为17×106/l，最大值为130×106/l，最小值为0×106/l。无症状神经梅毒组男性22例，女性29例；年龄中位数为33岁，年龄最大值68岁，年龄最小值24岁；已婚36例，未婚12例，离婚3例。血浆tppa全部阳性；血浆rpr滴度1:1患者2例，1:2患者3例，1:4患者5例，1:8患者11例，1:16患者11例，1:32患者14例，1:64患者2例，1:128患者2例，1:256患者1例。脑脊液tppa阳性44例，阴性7例。脑脊液rpr滴度阴性30例，1：1患者9例，1:2患者9例，1:4患者2例，1:8患者1例。脑脊液蛋白中位数为29.6mg/dl，最大值为60.7mg/dl，最小值为7.2mg/dl。脑脊液白细胞数中位数为10×106/l，最大值为216×106/l，最小值为1×106/l。隐性梅毒组男性8例，女性10例；年龄中位数为32岁，年龄最大值为52岁，年龄最小值为17岁；已婚12例，未婚6例。血浆tppa全部阳性；血浆rpr滴度阴性患者3例，1:1患者1例，1:2患者3例，1:4患者3例，1:8患者2例，1:16患者3例，1:32患者1例，1:64患者1例，1:128患者1例。脑脊液tppa阴性17例，阳性1例；脑脊液rpr滴度全部阴性。脑脊液蛋白中位数为22.8mg/dl，最大值为45.2mg/dl，最小值为8.6mg/dl；脑脊液白细胞数中位数为3×106/l，最大值5×106/l，最小值为0×106/l。具体数据如表1所示。表1患者一般临床资料表2、样品获取根据入组患者情况，行腰椎穿刺术以及肘静脉穿刺术留取脑脊液、血液进行常规检验，并留取脑脊液和血液标本，标本配对置-80℃冰箱保存，最后统一检测，避免样本检测批次误差。在患者知情同意下，腰穿收集脑脊液标5ml，静脉采集血液标本10ml。腰椎穿刺术收集脑脊液后，用冻存管分装，编码标记；静脉穿刺术收集血液后，置于4℃离心机中，离心10分钟，3000转/分钟，迅速分离上层清亮血浆置于冻存管中，编码标记。脑脊液和血浆标本全部保存于-80℃冰箱，最后统一检测。3、检测方法实施例中采用的检测方法都是已知的。其中，血nf-l和脑脊液nf-l的检测采用(neurofilamentlight)elisa(enzymeimmunoassayforquanlitativedeterminationofhumanneurofilamentlight(nf-l)proteinincerebrosphinalfluid)(lblinternationalgme)根据说明书进行检测。血浆和脑脊液pnf-h的检测采用humanphosphorylatedneurofilamenthelisa试剂盒(biovendor-laboratornímedicínaa.s.)并按照所附的厂家的说明书进行检测。血浆rpr滴度、脑脊液rpr滴度、脑蛋白检测和脑白细胞的检测根据ws273-2007所述的方法进行。4、治疗方案有症状神经梅毒和无症状神经梅毒的治疗方法采用国家标准治疗方法，青霉素2400万u/天，分为400万u/4小时，静脉滴注，连续治疗14天。治疗前数据是使用在治疗之前第0天取得的样品检测得到的数据；治疗后数据是在采用上述治疗方案进行治疗后第180天取得的样品检测得到的结果。5、结果与分析各组患者血nf-l水平和差异比较各组患者的血nf-l水平的数据(表2)和对比分析(图2)结果如下：有症状神经梅毒组、无症状神经梅毒组、隐性梅毒组患者的血nf-l的中位数分别为207.89pg/ml、188.53pg/ml、204.1pg/ml，其中有症状神经梅毒组血nf-l水平高于无症状神经梅毒组(p<0.001)，具有统计学意义。有症状神经梅毒组血nf-l水平虽然高于隐性梅毒组，但是没有统计学意义(p＝0.063)。无症状神经梅毒组、隐性梅毒组患者的血nf-l水平没有差异(p＝0.552)。因此，可以根据血nf-l水平对神经梅毒患者进行分型或分期，例如将有症状神经梅毒区别于无症状神经梅毒组。另外，有症状神经梅毒组(ns)患者的血nf-l水平显著高于无症状神经梅毒组(ans)和隐形梅毒组(s)患者的水平。有症状神经梅毒组(ns)患者和无症状神经梅毒组(ans)患者经过青霉素标准治疗方案进行治疗以后，血nf-l水平显著下降(参见图3)。表2各组患者血nf-l水平(n＝84)疾病类型nf-l水平(pg/ml)(中位数最小值,最大值))有症状神经梅毒(20)207.89(146.70,1897.86)无症状神经梅毒(46)188.53(91.41,3434.74)隐形梅毒(18)204.1(90.9,594.91)血nf-l与各因素的相关性分析进一步检测了脑脊液nf-l和pnf-h水平，另外还进行了血液rpr检测(结果如下表3至4所示)。表3各组患者脑脊液nf-l水平(n＝92)疾病类型nf-l水平(pg/ml)(中位数最小值,最大值))有症状神经梅毒(23)5806.25(409.25,41616.68)无症状神经梅毒(51)217.59(33.48,2020.43)隐性梅毒(18)266.32(117.83,679.43)表4各组患者脑脊液pnf-h水平(n＝92)疾病类型pnf-h水平(pg/ml)(中位数最小值,最大值))有症状神经梅毒(23)986.46(117.26,9018.81)无症状神经梅毒(51)43(0,196.53)隐性梅毒(18)48.71(0,199.05)对所有患者血nf-l检测结果进行相关性分析发现：血nf-l水平与脑脊液nf-l水平(r＝0.257，p<0.018)；脑脊液pnf-h水平(r＝0.544，p<0.001)显著相关。因此，可以将血nf-l水平独立地或者与脑脊液nf-l、脑脊液pnf-h水平结合地用于神经梅毒的早期诊断、分型分期、疗效评价和/或预后评估。实施例3：血nf-l预后分析预后共随访25人，有症状神经梅毒组随访15人，无症状神经梅毒组10人。具体测试指标和统计结果见下表5。经过将有症状神经梅毒组与无症状神经梅毒组血nf-l治疗前后差值(治疗后数值-治疗前数值)的差异比较发现，神经梅毒组血nf-l水平预后差值中位数为-3.48pg/ml，即下降3.48pg/ml；无症状神经梅毒组血nf-l水平治疗前后差值中位数为2.36pg/ml，即上升2.36pg/ml；两者比较差异有统计学意义(p＝0.03)。因此，可以根据血nf-l治疗前后差值对神经梅毒患者进行预后评估。预后血nf-l与各因素的相关性分析对治疗后血nf-l水平进行相关性分析发现，治疗后血nf-l水平与梅毒分期(r＝-0.503，p＝0.017)、治疗前血nf-l水平(r＝0.687，p<0.001)、脑脊液rpr滴度(r＝0.505，p＝0.017)、脑蛋白(r＝0.607，p＝0.003)相关。因此，可以将治疗后血nf-l水平独立地或者与选自由治疗前血nf-l水平、脑脊液rpr滴度、脑蛋白组成的组的指标结合地用于神经梅毒的早期诊断、分型分期、疗效评价和/或预后评估。治疗前后血nf-l变化水平(即预后差值)与治疗后血浆pnf-h水平(r＝-0.595，p＝0.003)、治疗后脑脊液nf-l水平(r＝-0.636，p＝0.001)、治疗前脑脊液nf-l水平(r＝-0.683，p<0.001)、治疗前脑脊液pnf-h水平(r＝-0.559，p＝0.007)相关。因此，可以将治疗前后血nf-l变化水平独立地或者与选自由预后血浆pnf-h水平、预后脑脊液nf-l水平、治疗前脑脊液nf-l水平、治疗前脑脊液pnf-h水平组成的组的指标结合地用于神经梅毒的早期诊断、分型分期、疗效评价和/或预后评估。表5有症状神经梅毒组与无症状神经梅毒组血nf-l治疗前后水平变化表最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。当前第1页12