一种快速检测瓜蚜对杀虫剂敏感度的方法及装置与流程

本发明涉及一种适合于快速检测瓜蚜对杀虫剂敏感度的方法装置，属于生物学领域。
背景技术：
：瓜蚜aphisgossypiiglover又名棉蚜，属半翅目蚜科，是一种世界性的重要农业害虫，通过直接刺吸植株汁液造成叶片畸形、分泌蜜露影响植株生长，还会降低商品瓜的价值，并可通过传播多种植物病毒，如黄瓜花叶病毒(cucumbermosaicvirus，cmv)、甜瓜花叶病毒(melonmosaicvirus，mmv)等，给作物造成更严重的经济损失（zhangetal.，2015）。瓜蚜寄主植物广泛，可危害瓜果类、棉花、烟草、茄科、豆科、十字花科等经济作物在内的116科900种作物（李飞等，2003；梁彦等，2013）。瓜蚜属于r-对策害虫，种群世代历期短、繁殖力强，短期内种群数量可快速增长。化学药剂仍是目前瓜蚜的重要防控手段，随着化学农药的频繁使用，瓜蚜对多种类型的化学农药，包括有机磷类、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类、新烟碱类等化学杀虫剂均产生了不同程度的抗药性（caoetal.，2008；matsuura&nakamura，2014；panetal.，2015）。chen等（2017b）连续6a对全国8个省份19个地区的瓜蚜进行生物测定，发现瓜蚜对高效氯氰菊酯和溴氰菊酯均产生了上千倍甚至上万倍的抗药性；解毒酶活性的升高及抗性相关基因出现点突变等均会导致瓜蚜产生高抗性（li&han，2004；shangetal.，2012；chenetal.，2017a）。因此，生产中瓜蚜的化学防治需要在明确种群对不同化学药剂的抗药性基础上进行科学选药和用药，以取得优良防治效果。传统的害虫对杀虫剂敏感度的检测方法是通过杀虫剂的室内毒力测定试验实现的，而不同害虫的室内毒力测定随着害虫种类的不同而存在差异。瓜蚜对杀虫剂的敏感度监测主要是采用滤纸浸叶法进行，即将浸过药液的植物离体叶片放置在湿润滤纸上，然后接入田间采集的瓜蚜试虫，随后放在光照培养箱中培养，48小时后观察记录受试瓜蚜的存活率和死亡率。这种测定方法需要耗费2-3天的时间，才能监测明确药剂对害虫的毒力活性和受试瓜蚜对测试药剂的敏感性。同时，这种方法的实施需要更多的试验耗材，例如培养皿、无虫苗、打孔器、卫生纸、光照培养箱、橡皮筋等，其中无虫苗的饲养需要花费更多的人力、物力和时间。针对杀虫剂敏感度的快速检测技术研究中，也有采用玻璃管药膜法进行蚜虫敏感性选药技术的研究（鲁艳辉等，2009），但是玻璃管药膜法实施中，需要在加入药剂的玻璃管中采用人工或者仪器（如小型滚瓶机）转动管子，以在管内形成药膜；同时，这种方法需要药剂更多，也造成了浪费，并在后期处理中造成的污染也更多；采用玻璃管作为药剂的承载体，保存、运输及使用过程中均需要特别细致，避免破损。技术实现要素：针对上述问题，本发明根据上述领域的需要，提供了一种适合于快速检测瓜蚜对杀虫剂敏感度的方法及装置，本发明克服了需要转动玻璃管形成药膜、保存运输不易等问题，专门设计用于测定杀虫剂对瓜蚜的毒力活性的快速检测，是一种新的杀虫剂敏感度快速监测方法，具有误差小，效率高，稳定性强等优点，且对于短时间内快速评价杀虫剂对害虫的毒力、从而有针对性的选药施药具有重要的指导意义。本发明提供的技术方案是：一种快速检测瓜蚜对杀虫剂敏感度的方法，所述方法包括如下步骤：a.配置待测杀虫剂的药液浓度，待用；b.将滤纸裁剪成长方形滤纸块，待用；c.将裁剪好的滤纸浸入步骤a中配制的药液中，浸渍8-20s后取出，用吸水纸吸取滤纸块上多余的药液，于通风橱中将滤纸晾至略潮湿但不湿润；d.将步骤c中带有药液的滤纸块小心夹取，以短边为圆周长卷成圆柱状，放置于提前标记好的塑料离心管中；e.轻取15-20头龄期一致的健康的无翅成蚜放置于滤纸柱内壁，然后盖上离心管管盖，离心管横置，防止蚜虫落入离心管管底，将离心管包裹后置于常温条件；3h后，观察并记录蚜虫的存活率和死亡率。所述的方法，优选地，步骤c中，将裁剪好的滤纸浸入步骤a中配制的药液中，浸渍10s后取出。进一步地，所述的方法，步骤e中，瓜蚜死亡具体判定标准为，用毛笔轻触虫体，不能动或者不能正常运动的判定为死亡。所述的方法，优选地，步骤a中，所述待测杀虫剂及其药液浓度为氟啶虫胺腈200mg/l、吡虫啉200mg/l、噻虫嗪200mg/l、联苯菊酯150mg/l、氟啶虫酰胺200mg/l或阿维菌素20mg/l。同时，本发明还提供一种适合于所述快速检测瓜蚜对杀虫剂敏感度的方法的装置：该装置包括离心管和放置于所述离心管内的附着有待测药剂的滤纸。所述离心管为2ml塑料离心管。所述滤纸形状为空心圆柱状。本发明在玻璃管药膜法的基础上，提供了一种专用于蚜虫的杀虫剂毒力检测方法及装置，包括内含有附着药剂的滤纸一张的离心管。本发明可以在短短3个小时（根据杀虫剂特性有所差异）之内快速检测出所测试杀虫剂对瓜蚜的毒力高低，为田间采用化学药剂防治害虫针对性防控提供及时、快速的选药用药。本发明与现有技术相比的有益效果在于：本发明提供了一种适合于快速检测瓜蚜对杀虫剂敏感度的方法及装置，克服了需要转动玻璃管形成药膜、保存运输不易等问题，专门设计用于测定杀虫剂对瓜蚜的毒力活性的快速检测，是一种新的杀虫剂敏感度快速监测方法，具有误差小，效率高，稳定性强等优点，且对于短时间内快速评价杀虫剂对害虫的毒力、从而有针对性的选药施药具有重要的指导意义。本发明的装置采用滤纸塑料管，为室内常用耗材，材料易于获得，造价极低，极大地简化了诊断设施，而不需要定制特定的玻璃管；采用滤纸作为药剂的承载体，由此改变了药液需要在玻璃管内滚动的过程，因此也不需要人或者特定的滚瓶仪进行操作，简便性大大提高，植保人员经过简单培训即可使用；试验结束后观察瓜蚜死亡率时，直接将载药滤纸取出，进行计数，也提供了方便；同时，滤纸载药及采用塑料管可以长距离运输，而不用担心药管意外坠落导致破损的风险，大大提升了长距离使用及商品化的可能性。附图说明图1本发明置的结构示意图，其中：1-离心管，2-滤纸（浸过药液的滤纸）。具体实施方式一、材料和方法1、试验材料试验所需要耗材：2ml塑料离心管、滤纸、一次性水杯、滴管、毛笔、计时器、称量纸、报纸、剪刀、镊子、马克笔；试验中蚜虫为采集自黄瓜田的蚜虫田间种群。本发明适合于快速检测瓜蚜对杀虫剂敏感度的方法的装置包括离心管1和放置于离心管1内的附着有待测药剂的滤纸2。在本实施例中，离心管1为2ml塑料离心管；滤纸2为4.8cm×3.6cm的长方形滤纸块，浸渍待测药剂后，用吸水纸吸取滤纸块上多余的药液，于通风橱中将滤纸晾至略潮湿但不湿润；然后将带有药液的滤纸块用镊子小心夹取，以3.6cm短边为圆周长卷成空心圆柱状，小心放置于2ml塑料离心管中即可。2、试验步骤试验步骤包含以下过程：a.在预备试验基础上，于通风橱中配置相应浓度的药液，待用；b.将滤纸裁剪出4.8cm×3.6cm的长方形滤纸块，待用；c.将裁剪好的滤纸浸入新鲜配制的药液中，浸渍10s后取出，用吸水纸吸取滤纸块上多余的药液，于通风橱中将滤纸晾至略潮湿但不湿润；空白对照采用丙酮或者含有曲拉通x-100的蒸馏水处理（与化学药剂的稀释溶液保持一致）。d.将带有药液或空白处理的滤纸块用镊子小心夹取，以3.6cm短边为圆周长卷成圆柱状，小心放置于提前标记好的2ml塑料离心管中，用零号毛笔轻轻取15-20头龄期一致的健康的无翅成蚜放置于滤纸柱内壁，然后盖上离心管管盖，离心管横置，防止蚜虫落入离心管管底，用报纸包裹后置于常温条件。3h后，观察并记录蚜虫的存活率和死亡率。瓜蚜死亡具体判定标准为，用毛笔轻触虫体，不能动或者不能正常运动的判定为死亡。实施例1：建立不同杀虫剂对瓜蚜的敏感性诊断剂量1.供试昆虫瓜蚜试虫为采集自黄瓜田的田间种群。2.供试杀虫剂浓度在预备试验中，选取不同杀虫剂的不同浓度，采用本发明快速检测瓜蚜对杀虫剂敏感度的方法（滤纸离心管法）开展不同杀虫剂对瓜蚜的毒力试验，具体试验浓度见表1。表1不同杀虫剂对瓜蚜的诊断剂量浓度梯度（mg/l）氟啶虫胺腈吡虫啉噻虫嗪联苯菊酯氟啶虫酰胺阿维菌素浓度150505050505浓度210010010010010010浓度315015015015015015浓度420020020020020020根据预备试验中获得的瓜蚜试虫死亡率超过85%的浓度开展验证试验，建立了不同杀虫剂对瓜蚜的敏感性诊断剂量。检测结果：空白对照平均死亡率小于5%，各化学药剂诊断浓度下田间瓜蚜种群死亡率均在85%以上（表2）。表2不同杀虫剂对瓜蚜敏感性的诊断浓度药剂浓度校正死亡率氟啶虫胺腈200mg/l87.08%吡虫啉200mg/l86.96%噻虫嗪200mg/l95.64%联苯菊酯150mg/l95.99%氟啶虫酰胺200mg/l95.64%阿维菌素20mg/l97.92%实施例2：诊断剂量的验证及与田间防效的关系对以上推荐浓度进行田间验证试验，在田间黄瓜蚜虫发生期，设置上述六种药剂的推荐剂量处理，采用本发明滤纸离心管法进行验证试验，重复3次。结果处理中，空白对照未见死亡，所有药剂处理中瓜蚜死亡率均超过85%以上（表3），说明该方法诊断剂量是稳定的。同时，采用不同药剂的推荐剂量在田间进行常规叶面喷雾，防效试验，数据表明，田间防效试验中，测试杀虫剂对瓜蚜的防效均超过90%，取得理想防效。因此，采用快速检测装置及诊断剂量进行检测时，如果测试瓜蚜的校正死亡率超过85%，那么其在药剂推荐剂量下的相对防效达90%以上，联苯菊酯略低，约为85%（表4），由此建立了诊断剂量和田间防效间的关系，可以根据诊断剂量下试虫的死亡率科学选药，从而达到预期的高效防控目的。表3不同杀虫剂处理下田间瓜蚜的校正死亡率药剂浓度测试总数死亡数校正死亡率氟啶虫胺腈200mg/l907886.67%吡虫啉200mg/l1059085.71%噻虫嗪200mg/l11010393.64%联苯菊酯150mg/l989495.92%氟啶虫酰胺200mg/l959498.95%阿维菌素20mg/l1029896.08%表4不同药剂在推荐剂量下对瓜蚜的田间相对防效实施例3：滤纸离心管在不同存放条件下的稳定性以实施例2中确定的药剂浓度处理药剂滤纸块，同时设置空白对照滤纸块，用封口袋密封起来，避光保存在常温和4℃条件下，常温下放置1天和7天，4℃条件下放置1天、7天、14天、21天和28天。之后分别取出药剂处理滤纸块和空白对照滤纸块，回复至室温后，放置于2ml的塑料离心管中，采用上述方法分别测定其诊断剂量对瓜蚜的稳定性，每处理各重复4次。滤纸离心管在不同温度和时间等存放条件下，测定不同处理条件下瓜蚜的死亡率，计算其校正死亡率。结果表明，在室温和4℃条件下，滤纸离心管的诊断剂量浓度稳定性强，对瓜蚜试虫的校正死亡率处于85％以上，4℃条件下，其药效稳定性至少一个月。该结果将为该快速诊断装置及方法的商业化提供了保障。本发明通过大量实验室测试检验，可靠性和实用性强，药膜持效期至少2个月，测试结果快速准确。且结构简单，造价极低，操作方便，适合用于带有诊断剂量的滤纸长距离运输及其商品化，帮助农户及大型种植农场在生产实际中合理选用杀虫剂防治瓜蚜，降低或延缓瓜蚜抗药性的产生与发展。当前第1页12