一种贲门癌预后预测标志物及其应用的制作方法

本发明涉及贲门癌预后预测技术领域，具体涉及一种贲门癌预后预测标志物及其应用。

背景技术：

贲门癌是消化内科常见的恶性肿瘤之一。文献报道80年代以来食管原发性腺癌和贲门癌的发病率呈明显上升趋势，但胃远侧部位肿瘤发生率却呈下降的趋势，在过去的30年间美国和英国，食管原发性腺癌和贲门癌发病率增长速度是所有恶性肿瘤中最快的，上升了将近6倍。我国流行病学资料研究显示，贲门癌和食管癌发病具有相似的地域分布特征和相似的临床主要症状(进行性吞咽困难)。贲门癌和食管癌的以前在临床的界限并不清晰，曾经我国学者将其划归为食管癌；贲门癌常或多或少地侵及胃底，也有学者把其划入胃癌的范畴。近年，西方国家将食管胃结合部上下5cm内发生的腺癌归类为食管胃交界部或结合部腺癌，并进一步根据解剖部位分为3类，即，第一类为：食管远端腺癌，食管胃交界部上1～5cm；第二类为：贲门腺癌，食管胃交界部上1cm至交界部下2cm；第三类为：贲门下胃腺癌，食管胃交界部下2～5cm。中国人以ⅱ型为主(>97％)，ⅰ型极少见(<2％)，ⅲ型亦较少。王立东等关于河南省高发区贲门腺癌发生部位分析的研究表明，有95％以上的贲门癌发生在交界线上下约2cm范围内。因此，本专利中所指的贲门癌均为第二类——即贲门腺癌。

贲门癌与其他部位的胃癌不同，具有其独特的流行病学趋势、生物学行为和临床特点。表现为病期较晚，侵袭范围广，恶性程度高，预后不良。贲门癌起病隐匿，许多患者早期阶段无明显症状，许多患者确诊时已为中晚期。目前，贲门癌的预后情况很差，中晚期的患者，术后5年的生存率不足25％。患者普遍存在术后生存率低、耐药性高或复发转移的情况。如果能找到有效区分患者预后的分子标志物，则可以指导临床实现个体化治疗，避免过度治疗和治疗不足。人们期望探索和建立一种敏感性高、特异性强的贲门癌预后预测指标，并利用这些指标作为指导治疗和判断预后的依据。目前，在临床实践中，贲门癌的预后分级主要是以病理分级作为最重要的预后指标，而发现的预后相关的分子标志物较少，已发现的指标均未被临床接受应用，对于贲门癌患者预后预测仍处于初步探索阶段。因此，本领域亟需可用于贲门癌预后预测的分子标志物。

技术实现要素：

针对于现有技术存在的问题和不足，本发明的目的在于提供一种贲门癌预后预测标志物及其应用。

为实现发明目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明提供了一种可以有效区分贲门癌病人预后预测的分子标志物，所述分子标志物为erich3蛋白。所述erich3蛋白(全名glutamate-richprotein3)，其genbank登记号为np_001002912.4。

通过免疫组织化学检测erich3蛋白表达具有以下特征：

(1)erich3蛋白在贲门癌组织中表达，癌旁正常组织中不表达；

(2)通过和临床病理资料的关联分析，发现erich3蛋白在贲门癌组织中的阳性表达和淋巴结转移呈相关性；

(3)erich3蛋白阳性表达的贲门癌患者，其生存期短。

本发明还提供了一种erich3蛋白的检测试剂在制备用于贲门癌预后预测的试剂盒或试剂中的应用。

根据上述的应用，优选地，所述erich3蛋白的检测试剂为检测erich3蛋白是否表达的分子。

根据上述的应用，优选地，检测erich3蛋白是否表达的方法为本领域常见的蛋白定量检测方法，包括电泳法、蛋白质印迹法和免疫组织化学；更加优选地，本发明采用免疫组织化学法检测erich3蛋白的表达。

根据上述的应用，优选地，所述检测erich3蛋白是否表达的分子为蛋白质；所述蛋白质可以为分子量较小的多肽(如5-100个氨基酸组成)，也可以为分子量较大的蛋白(例如长度大于100个氨基酸)，所述蛋白质能够与erich3蛋白特异性结合，进而检测erich3蛋白的表达。

根据上述的应用，优选地，所述蛋白质为与erich3蛋白特异性结合的抗体。

根据上述的应用，优选地，所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。

根据上述的应用，优选地，所述抗体为单克隆抗体，该抗体为采用本领域公知的方法制备得到的抗体或购买的抗体。更加优选地，所述erich3抗体购自thermofisherscientific公司，货号为pa5-55933。

根据上述的应用，优选地，所述试剂盒或试剂用于贲门癌手术切除组织样品或内镜活检组织样品的检测。

根据上述的应用，优选地，所述组织样品的检测是采用免疫组织化学法对组织样品中的erich3蛋白进行定量检测，确定组织样品中erich3蛋白表达水平。

根据上述的应用，优选地，所述试剂盒或试剂中还含有检测缓冲液和显色剂。

根据上述的应用，优选地，所述贲门癌预后预测的判断方法为：erich3蛋白表达阳性，则贲门癌患者生存期短(贲门癌患者生存期短是指与erich3表达阴性的患者相比，生存期更短)；erich3蛋白表达阴性，则贲门癌患者生存期长；其中，erich3蛋白表达阳性的判断标准为本领域公知，在进行表达阳性判断时，可以设立erich3不表达的阴性对照。所述生存期的计算方式为本领域所公知，是指从患者经病理诊断确诊开始至患者因任何原因引起死亡的时间或健在患者由病理诊断确诊时间至最后一次随访的时间。

本发明还提供了一种用于贲门癌预后预测的试剂盒，所述试剂盒含有检测erich3蛋白的检测试剂。

根据上述的试剂盒，优选地，所述检测试剂为检测erich3蛋白是否表达的分子。

根据上述的试剂盒，优选地，所述检测erich3蛋白是否表达的分子为蛋白质。

根据上述的试剂盒，优选地，所述蛋白质为与erich3蛋白特异性结合的抗体。更加优选地，所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。

与现有技术相比，本发明取得的积极有益效果为：

(1)本发明提供了一种可以有效区分贲门癌生存期的分子标志物——erich3蛋白，通过检测组织样品中erich3蛋白的表达水平，可以有效区分贲门癌患者的生存期长短，从而为贲门癌预后预测的判断提供了新途径，为临床医生对于贲门癌病情分析提供了参考依据。

(2)本发明提供的用于贲门癌预后预测的试剂盒操作简单，使用方便，能够快速检测贲门癌手术切除组织样品或内镜活检组织样品中erich3蛋白的表达水平，可用于贲门癌的预后预测，使得贲门癌的预后预测更加方便易行。

附图说明

图1为贲门癌肿瘤组织中不同染色评分的erich3蛋白免疫组织化学染色显微图；

图2为贲门癌肿瘤组织及对应癌旁正常组织的he染色显微图；

图3为贲门癌肿瘤组织及对应癌旁正常组织的免疫组织化学染色显微图；

图4为kaplan-meier分析贲门癌肿瘤组织中erich3蛋白表达生存曲线图；

图5为kaplan-meier分析贲门癌内镜活检组织中erich3蛋白表达的生存曲线图。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明作进一步详细说明，但并不限制本发明范围。

本发明中贲门癌病理分级根据ajcc(americanjointcommitteeoncancer)分期第六版病理标准进行分级，具体地，原发肿瘤(t)分期，tx：原发肿瘤无法评估；t0：没有原发肿瘤的证据；tis：原位癌：上皮内癌或粘膜内癌未穿透粘膜肌层而达粘膜下层；t1：肿瘤侵及粘膜下层；t2：肿瘤侵及肌层；t3：肿瘤侵透肌层并侵达浆膜；t4：肿瘤侵及邻近组织，远处器官转移。淋巴结转移(n)分期，nx：区域淋巴结无法评估；n0：无区域淋巴结转移；n1：区域淋巴结转移。远处转移(m)分期，mx：远处转移不能评估；m0：无远处转移；m1：有远处转移。最终临床分期为i期：t1n0m0；iia期：t2～3n0m0；iib期：t1～2n1m0；iii期：t3n1m0、t4任何nm0；iv期：任何t任何nm1。

实施例一：贲门癌预后预测标志物——erich3蛋白表达水平的检测方法

采用免疫组织化学法检测erich3蛋白的表达水平，其具体步骤如下：

1、组织芯片制作：贲门癌及癌旁正常组织用10％中性福尔马林固定液固定48h后，自来水洗涤，经梯度酒精脱水(70％乙醇2小时，80％乙醇2小时，90％乙醇3小时，95％乙醇3小时，无水乙醇ⅰ2小时，无水乙醇ⅱ1小时)，二甲苯透明(二甲苯ⅰ2小时，二甲苯ⅰ2小时)，54～58℃石蜡浸蜡(浸蜡ⅰ(54～56℃)30分钟，浸蜡ⅱ(56～58℃)1小时，浸蜡ⅲ(56～58℃)1小时)，包埋成蜡块，用切片机切成5um厚的切片贴于载玻片上，置于65℃干燥箱中过夜，待做进行he(苏木素-伊红)染色(见后面详细描述)，确定贲门癌组织病理类型且标记所需癌巢及癌旁正常组织位置。在石蜡标本的相应位置标记作为取材部位，后用直径为1.5mm的打孔针从标定部位逐个取出组织芯，放入预先设计的阵列模块中，排列成组织芯片模块。用切片机切成4μm厚的切片贴于防脱玻片上，置于65℃干燥箱中过夜，待做he染色(复核诊断芯片取点位置是否准确)及免疫组织化学用。

2、he染色：组织芯片切片65℃烤片30分钟，二甲苯ⅰ脱蜡15分钟，二甲苯ⅱ脱蜡15分钟，为了洗去溶解的石蜡和二甲苯，用梯度乙醇水化(无水乙醇ⅰ15分钟，无水乙醇ⅱ15分钟，85％乙醇5分钟，75％乙醇5分钟，自来水洗)。组织芯片入苏木素染液3-5分钟，自来水洗，分化液分化，自来水洗，返蓝液返蓝30秒，流水冲洗，伊红染液中染色5分钟，组织芯片入梯度酒精脱水(85％乙醇5分钟，95％乙醇5分钟，100％乙醇ⅰ5分钟，100％乙醇ⅱ5分钟)，二甲苯ⅰ透明5分钟，二甲苯ⅱ透明5分钟，从二甲苯中拿出稍晾干，中性树胶封片，显微镜下观察，确定芯片取点位置是否准确。

3、免疫组织化学：组织芯片65℃烤片30分钟，二甲苯ⅰ脱蜡15分钟，二甲苯ⅱ脱蜡15分钟，为了洗去溶解的石蜡和二甲苯，用梯度乙醇水化(无水乙醇ⅰ15分钟，无水乙醇ⅱ15分钟，85％乙醇5分钟，75％乙醇5分钟，蒸馏水洗)。edta(ph9.0)高压修复(电磁炉加热沸腾后，放入标本，置于高压锅继续加热，喷气阀喷气后计时2分钟，停止加热，自然冷却至室温)，切片放入pbs缓冲液(ph7.4)脱色摇床晃动洗涤3次，每次5分钟。3％h2o2室温避光孵育25分钟，切片放入pbs缓冲液(ph7.4)脱色摇床晃动洗涤3次，每次5分钟，切片稍甩干后，加erich3抗体(抗体购自thermofisherscientific公司，货号为pa5-55933，稀释比例1:100)置入湿盒中4℃过夜。第二天取出湿盒恢复至室温，切片放入pbs缓冲液(ph7.4)脱色摇床晃动洗涤3次，每次5分钟。切片稍甩干后，加与一抗相应种属的二抗(hrp标记)，室温孵育50分钟，切片放入pbs缓冲液(ph7.4)脱色摇床晃动洗涤3次，每次5分钟；切片稍甩干后加二氨基联苯胺(dab)溶液镜下显色，自来水冲洗切片终止显色，苏木素染液复染3分钟，苏木素返蓝液返蓝，流水冲洗。将切片依次放入梯度酒精脱水(75％乙醇5分钟，85％乙醇5分钟，100％乙醇ⅰ5分钟，100％乙醇ⅱ5分钟)，二甲苯ⅰ透明5分钟，二甲苯ⅱ透明5分钟，从二甲苯中拿出稍晾干，中性树胶封片，显微镜下观察。

4、erich3蛋白表达水平的判定

根据现有标准，对组织芯片进行染色程度进行评估。评分标准：需综合考虑阳性细胞显色强度和百分比。

显色强度：无细胞胞浆显色为0分，较弱细胞胞浆显色(浅黄色)为1分，中等细胞胞浆显色(棕黄色)为2分，较强细胞胞浆显色(棕褐色)为3分；百分比：0～5％的肿瘤细胞出现细胞胞浆着色为0分，6％～25％的肿瘤细胞出现细胞胞浆着色为1分，26％～50％的肿瘤细胞出现细胞胞浆着色为2分，51％～75％的肿瘤细胞出现细胞胞浆着色为3分；＞75％的肿瘤细胞出现细胞胞浆着色为4分。以显色强度评分×百分比评分记为最终评分结果，其中，0分为阴性(-)，1～4分为弱阳性(+)，5～8分中阳性(++)，9～12分强阳性(+++)。图1为贲门癌肿瘤组织中不同染色评分的erich3蛋白免疫组织化学染色显微图，其中a为erich3蛋白阴性表达，b为erich3蛋白弱阳性表达，c为erich3蛋白中阳性表达，d为erich3蛋白强阳性表达。从图1可以看出，erich3蛋白在贲门癌组织中有不同程度表达。

根据评分结果来评估erich3蛋白在贲门癌中的表达水平，0分为阴性表达，≥1分为阳性表达。

实施例二：erich3蛋白在贲门癌预后预测中的应用

1、回顾性研究：免疫组织化学法检测erich3蛋白在贲门癌肿瘤组织和癌旁正常组织的表达

将150例贲门癌肿瘤组织样本和其配对癌旁正常组织制备组织芯片，其中每例患者的肿瘤组织取2个点，癌旁正常组织取2个点。采用实施例一所述的免疫组织化学法检测erich3蛋白的表达水平，并进行评分、分析。

(1)样本

患者都经由病理诊断和临床诊断后确诊；患者的肿瘤组织样本和癌旁组织样本是为手术切除标本；样本收集后，常规制成石蜡标本，切片，he染色后，镜下挑选癌组织丰富区域取点制备贲门癌组织芯片，选取手术切缘正常腺上皮取点制备癌旁正常组织芯片。经he染色后，病理专家复核贲门癌组织芯片取点病理诊断。图2为贲门癌肿瘤组织及配对癌旁正常组织的he染色显微图，经病理专家确诊后，选取取点准确，诊断明确的芯片点进入后继的免疫组织化学分析。

(2)检测组织芯片中erich3蛋白表达水平

对制备的150例贲门癌患者肿瘤组织和癌旁正常组织的组织芯片进行免疫组织化学染色(具体操作参见实施例一)，检测erich3蛋白的表达水平，其结果见表1。

表1150例贲门癌患者的肿瘤组织和配对癌旁组织的组织芯片信息及erich3免疫组织化学检测结果

注：“erich3”中的“na”为组织芯片阵列因组织破损严重、组织脱片或靶细胞过少，不能满足镜检要求，而用na代替。

由表1可知，erich3蛋白在贲门癌旁正常腺上皮组织中不表达；在部分贲门癌肿瘤组织中有阳性表达，阳性率为22.9％(34/148)。采用卡方检验(chi-squaretest)对表1中的数据进行统计学分析，发现erich3蛋白在贲门癌肿瘤组织和癌旁正常组织的表达水平存在显著性差异(p<0.05)。图3为具有代表性的贲门癌肿瘤组织及对应癌旁正常组织的免疫组织化学染色显微图。由图3可以看出，erich3蛋白在癌旁正常组织中不表达，在部分贲门癌组织中有不同程度的染色，提示erich3蛋白有阳性表达。

2、回顾性研究：erich3蛋白免疫组织化学检测与患者临床表型、预后生存分析

将2751例贲门癌手术患者的肿瘤切除组织样本制备组织芯片，每例患者肿瘤组织取2个点；用免疫组织化学法检测erich3蛋白表达水平(具体操作参见实施例一)，其检测结果见表2(表2中仅列出2751例贲门癌患者中的200例检测结果)所示。由表2可知，经过贲门癌手术的患者(例如根治或姑息手术)，可以通过检测erich3蛋白表达预测预后。

表22751例贲门癌患者中200例患者的erich3蛋白免疫组织化学检测结果

采用卡方检验分析2751例贲门癌患者的肿瘤组织中erich3蛋白和临床表型之间的相关性，结果如表3所示。由表3可知，erich3蛋白表达水平和淋巴结转移显著相关(p<0.05)，检测erich3蛋白的表达可以用于判断贲门癌的淋巴结转移。

表32751例贲门癌患者erich3蛋白表达水平与贲门癌患者临床表型的相关性分析

kaplan-meier曲线和log-rank检验分析2751例贲门癌患者的erich3蛋白表达水平与贲门癌患者的生存时间的相关性，分析erich3蛋白表达水平用于贲门癌预后评估的价值，结果如图4所示。由图4可知，erich3蛋白阳性表达的患者组生存时间较erich3阴性表达的患者组短(p<0.05)。

采用cox回归模型分析对erich3蛋白表达水平作为独立预后预测指标的可能性进行评估，其中，表4是按照表3中的数据进行的单因素cox回归分析结果，表5是按照表3中的数据进行的多因素cox回归分析结果。由表4可知，erich3阳性表达、≥60岁、低分化、深浸润程度、淋巴结阳性转移和远处器官转移都可以成为贲门癌预后不良的危险因素。由表5可知，erich3蛋白的表达、年龄、分化程度、浸润程度、淋巴结转移和远处器官转移可分别作为贲门癌的独立预后因子，可用于患者的预后评估、生存时间预测及疗效评估等。

表4单因素cox回归分析贲门癌患者中不同预测指标与预后生存的关系

表5多因素cox回归分析贲门癌患者中不同预测指标与预后生存的关系

3、回顾性研究：免疫组织化学法检测erich3蛋白在贲门癌患者的内镜活检肿瘤组织中的表达

将373例内镜活检病理诊断为贲门癌的患者的活检肿瘤组织(该患者可能经过贲门癌切除术(例如根治或姑息手术)，也可能未经过贲门癌切除术(例如根治或姑息手术)，仅进行化疗或放疗)，制备成组织芯片，用免疫组织化学的方法检测erich3蛋白表达水平(具体操作参见实施例一)，根据染色强度及面积进行评分。kaplan-meier曲线和log-rank检验用于分析erich3蛋白表达水平与贲门癌患者的生存时间的相关性，分析erich3蛋白表达水平用于贲门癌预后评估的价值。

表6373例内镜活检贲门癌患者肿瘤组织样本中erich3蛋白的免疫组织化学检测结果

由表6可知，在373例内镜活检病理诊断为贲门腺患者的活检组织样本中，erich3蛋白在部分贲门癌患者中有阳性表达，阳性率性为43.6％(163/373)。

采用kaplan-meier法和log-rank检验对表6中的统计数据进行生存分析，结果如图5所示。由图5可知，在贲门癌内镜活检组织样本中，erich3蛋白阳性表达的患者组生存时间较erich3阴性表达的患者组短(p<0.05)。

由表6可知，未经过贲门癌手术(例如根治或姑息手术)的化疗、放疗、放化疗患者同样可以通过检测erich3蛋白表达预测预后。

综上所述，本发明的erich3蛋白表达水平可以有效的区分贲门癌病人生存期的长短，从而为贲门癌的预后预测提供了新的途径，为临床医生对于贲门癌的病情分析提供参考依据。该erich3蛋白作为检测标志物，具有以下特征：当贲门癌样品的组织样本免疫组化染色评分≥1分时，判断erich3蛋白阳性表达，提示贲门癌患者的生存期短；反之，当贲门癌样品的组织样本免疫组化染色评分＝0分时，判断erich3蛋白阴性表达，提示贲门癌患者的生存期长。

实施例三：用于贲门癌预后预测的试剂盒的制备

一种用于贲门癌预后预测的试剂盒，所述试剂盒含有能够与erich3蛋白特异性结合的抗体，所述抗体购自thermofisherscientific公司，货号为pa5-55933。该试剂盒是采用免疫组织化学法对贲门癌手术切除组织样品或内镜活检组织样品中的erich3蛋白进行定量检测，确定贲门癌手术切除组织样品或内镜活检组织样品中erich3蛋白的表达水平，并根据erich3蛋白的表达水平区分贲门癌病人生存期的长短。进一步地，所述试剂盒中还含有检测缓冲液和显色剂。

该试剂盒根据检测的组织样本免疫组化染色评分(评分判定方法参见实施例一)来判断erich3蛋白的表达水平。当组织样本免疫组化染色评分≥1分时，判断erich3蛋白阳性表达，提示贲门癌患者的生存期短；反之，当贲门癌样品的组织样本免疫组化染色评分＝0分时，判断erich3蛋白阴性表达，提示贲门癌患者的生存期长。

该试剂盒操作简单，使用方便，能够快速检测贲门癌手术切除组织样品或内镜活检组织样品中erich3蛋白的表达水平，可用于贲门癌的预后预测，使得贲门癌的预后预测更加方便易行。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域普通技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。