本发明属于低剂量伽马射线辐照生物损伤评价技术领域，利用分子标记物进行低剂量伽马射线辐照生物损伤评价的方法，具体是利用c57bl/6j小鼠血清中异柠檬酸脱氢酶2(isocitratedehydrogenase2,idh2)的相对表达量下调率来评价低剂量伽马射线辐照生物损伤的方法。
背景技术：
“核污染”是指天然放射性核同位素以及人工合成核同位素在环境中扩散的过程。它不仅包括核辐照、原子尘埃等本身引起的污染，还有这些物质对环境的污染后带来的次生污染。伽马射线辐照能导致细胞组分和结构发生显著变化，并对生物体造成严重的损害。高剂量的电离辐照短期会对生物个体产生急性伤害，容易被检测和评估，而低剂量电离辐照一般不会引起生物个体的急性反应往往不被重视。随着伽马射线辐照广泛用于医疗保健、核军工、食品药品灭菌等领域，增加了人体暴露，公众越来越关注低剂量伽马射线辐照对生物体的影响。因此，筛选出检测速度快、对低剂量电离辐照敏感性、特异性强、可靠性高的生物标志物对低剂量伽马射线辐照损伤进行评价具有十分重要的意义。
生物标志物不仅可以估算伽马射线辐照剂量，还可以检测和评估伽马射线辐照对健康的影响，同时也可用于临床和医疗管理。伽马射线辐照损伤的早期生物标志物对暴露于伽马射线辐照人员的分类，治疗和随访以及放射治疗之前，治疗期间以及治疗之后的放射性毒性评估是至关重要的。生物体可能通过改变蛋白质的表达水平及其翻译后修饰状态来响应伽马射线辐照。itraq技术是新兴的高通量蛋白质组学方法，通过特异性标记多肽的氨基基团，然后进行串联质谱分析，可同时比较4种或8种不同样品中蛋白质的相对含量或绝对含量。因此，可以通过itraq技术筛选组织样品中差异表达的蛋白质来确定与伽马射线辐照相关的生物标志物。
技术实现要素：
本发明提供一种利用c57bl/6j小鼠血清中异柠檬酸脱氢酶2（idh2）的相对表达量的下调率来评价低剂量伽马射线辐照损伤的方法。本发明利用c57bl/6j小鼠血清中异柠檬酸脱氢酶2（idh2）对低剂量伽马射线辐照非常敏感的特性，根据c57bl/6j小鼠接受的低剂量伽马射线辐照剂量与血清中idh2的相对表达量的下调率的剂量-效应关系，c57bl/6j小鼠血清中idh2的相对表达量的下调率，评估低剂量伽马射线辐照的生物损伤。其原理是，发明人通过itraq技术筛选发现了接受低剂量伽马射线辐照后c57bl/6j小鼠血清中的idh2的相对表达量对低剂量伽马射线辐照非常敏感，且存在一定的剂量-效应关系。idh2是调节线粒体氧化还原平衡和通过产生nadph减少氧化应激诱导的细胞损伤的关键酶，血清中idh2表达下调，可能破坏线粒体氧化还原，诱导氧化损伤。在一定的低剂量电离辐照剂量范围内，机体受到的辐照损伤越大，idh2的相对表达量就越低，idh2蛋白表达的高低直接与人体辐照氧化损伤程度密切相关，该方法具有对剂量辐照敏感、可靠性高、特异性强等多重优点。
具体步骤是：
（1）建立低剂量辐照c57bl/6j小鼠模型；
（2）采集血清；
（3）idh2相对表达量下调率的检测；
（4）辐照损伤综合评价。
具体步骤如下：
其进一步的措施是：
所述的建立低剂量辐照c57bl/6j小鼠模型具体方法为：
选取6周到7周的c57bl/6j成年雄性小鼠，随机分4组，每组6只老鼠，对照组小鼠放在无伽马射线辐照的环境中饲养，实验组小鼠分别放在剂量率为12.5、25.0和50.0μgy/h的伽马射线辐照环境中饲养，总辐照时间为90d，每天辐照8h。
所述的采集血清具体方法为：
采用摘眼球法取血，采集的血液放置于4oc冰箱静置过夜，隔天3000r/min离心20min分离血清。
所述的idh2的相对表达量下调率的检测具体方法为：
将收集的接受过低剂量伽马射线辐照的c57bl/6j小鼠血清进行蛋白提取、总蛋白浓度测定、蛋白质变性、凝胶电泳、转膜、免疫反应、化学发光反应、凝胶成像扫描分析、最后进行idh2的相对表达量下调率分析。
所述的蛋白提取具体步骤如下：
用树脂沉淀样本中的蛋白，4℃，12000r/min离心20min，去掉上清，晾干，-80℃保存备用。在干燥后的蛋白质团块中加入200-250μll3裂解液，用枪头反复吹打直至蛋白质充分分散。超声助溶，4℃，12000r/min，离心20min，吸出上清液，转移至新的ep管中。
所述总蛋白浓度测定的具体步骤如下：
将0.2mg/ml的bsa标准品溶液加稀释液，依次稀释成0、5、10、20、50、100、150和200μg/ml的标准品溶液。然后测定它们在562nm下的吸光度值，绘制标准曲线。测定每个样品溶液在562nm下的吸光度值后，再通过标准曲线计算出样品中蛋白质的浓度。
所述蛋白质变性的具体步骤如下：
将蛋白质溶液按照4:1的比例加入5×蛋白质上样缓冲液，沸水浴变性15min，放入-20℃冰箱保存备用。
所述凝胶电泳的具体步骤如下：
将30％丙烯酰胺、1.5mtris－hcl、10％sds、ap和temed按照一定比例配制成10%的分离胶和5%的浓缩胶；待分离胶凝固后，在电泳槽中加入电泳液，将变性后的蛋白质样品加入电泳孔中，进行电泳。将浓缩胶电压调至75v，分离胶电压调至120v，电泳至溴酚蓝刚跑至分离胶底部，即可终止电泳，进行转膜。
所述转膜的具体步骤如下：
先采用甲醇将pvdf膜进行活化，再在膜的底部放置5-6张7×9cm的滤纸，再一同放置于转膜仪中，加入转膜液，300ma恒流转膜半小时。转膜过程中，将转膜槽放置于冰水中降温。
所述免疫反应的具体步骤如下：
将转好的膜用5%的脱脂牛奶（0.5%tbst稀释）封闭，在脱色摇床上混匀1h。采用tbst溶解的5%脱脂牛奶对idh2一抗（鼠抗人）进行1:100浓度稀释，然后将其与封闭好的膜进行混匀，4℃下孵育过夜。用2%tbst对idh2一抗孵育过夜的膜进行清洗，室温下在脱色摇床上清洗3次，每次5min。最后用tbst对二抗（羊抗鼠）稀释3000倍，室温下孵育30min后，在脱色摇床上清洗三次，每次5min。
所述化学发光反应的具体步骤如下：
在暗室中将ecla和eclb两种试剂在离心管中等体积混合，将pvdf膜的蛋白面朝上，加入混合好的ecl溶液充分反应1-2min后，放入凝胶成像系统进行扫描分析。
所述的凝胶成像扫描分析的具体步骤如下：
采用凝胶成像系统对蛋白条带进行拍照，再采用alpha软件分析目标带的光密度值。通过对idh2蛋白灰度值扫描获得idh2蛋白表达量，对内参蛋白gapdh蛋白灰度值扫描获得gapdh蛋白表达量；将idh2蛋白表达量除以内参蛋白gapdh蛋白表达量即获得idh2的相对表达量。
所述idh2的相对表达量下调率分析的具体步骤如下：
idh2相对表达量下调率按公式（1）进行计算：
idh2相对表达量下调率按公式（1）进行计算，
所述辐照损伤综合评价的方法是：
采用idh2的相对表达量下调率来评价低剂量伽马射线辐照生物损伤。当c57bl/6j小鼠血清中的idh2的相对表达量下调率在10%以内时，表明低剂量伽马射线辐照对无生物损伤效应；当c57bl/6j小鼠血清中的idh2的相对表达量下调率大于10%而小于20%时，此时的低剂量伽马射线辐照的生物损伤等级为ⅰ级；当c57bl/6j小鼠血清中的idh2的相对表达量下调率大于20%而小于40%时，此时的低剂量伽马射线辐照的生物损伤等级为ⅱ级；当c57bl/6j小鼠血清中的idh2的相对表达量下调率大于40%时，此时的低剂量伽马射线辐照的生物损伤等级为ⅲ级。当低剂量伽马射线辐照的生物损伤等级达到ⅰ级时，职业人员应加强辐照防护；当低剂量伽马射线辐照的生物损伤等级达到ⅱ级时，职业人员应及时休息一段时间；当低剂量伽马射线辐照的生物损伤等级达到ⅲ级时，职业人员应调离工作岗位，并接受适当治疗。
本专利发明是利用蛋白质组学全定量itraq技术分析差异表达的蛋白，鉴定idh2作为低剂量伽马射线辐照损伤生物标志物，然后利用idh2的相对表达量与辐射损伤之间的剂量-效应关系来评价低剂量伽马射线的生物损伤效应。相比于其他的生物效应标志物及评价方法，该方法具有对低剂量辐射敏感、可靠性高、特异性强等多重优点。
具体实施方式
实施例1
选取6周到7周的c57bl/6j成年雄性小鼠，随机分4组，每组6只老鼠，对照组小鼠放在无伽马射线辐照的环境中饲养，实验组小鼠放在伽马射线辐照剂量率为12.5μgy/h的环境中饲养，总辐照时间为90d，每天辐照8h。采用摘眼球法取血，采集的血液放置于4oc冰箱静置过夜，隔天3000r/min离心20min分离血清。将收集的接受过低剂量电离射线辐照的c57bl/6j小鼠血清进行蛋白提取、总蛋白浓度测定、蛋白质变性、凝胶电泳、转膜、免疫反应、化学发光反应、凝胶成像扫描分析、最后按照公式（1）进行idh2的相对表达量下调率分析。
c57bl/6j成年雄性小鼠在12.5μgy/h的剂量率下辐照90d，每天辐照8h，接受9mgy的低剂量伽马射线辐照后，血清中idh2的相对表达量下调率为17.5%，此时低剂量伽马射线辐照的生物损伤等级为
实施例2
选取6周到7周的c57bl/6j成年雄性小鼠，随机分4组，每组6只老鼠，对照组小鼠放在无伽马射线辐照的环境中饲养，实验组小鼠放在伽马射线辐照剂量率为25.0μgy/h的环境中饲养，总辐照时间为90d，每天辐照8h。采用摘眼球法取血，采集的血液放置于4oc冰箱静置过夜，隔天3000r/min离心20min分离血清。将收集的接受过低剂量电离射线辐照的c57bl/6j小鼠血清进行蛋白提取、总蛋白浓度测定、蛋白质变性、凝胶电泳、转膜、免疫反应、化学发光反应、凝胶成像扫描分析、最后按照公式（1）进行idh2的相对表达量下调率分析。
c57bl/6j成年雄性小鼠在25.0μgy/h的剂量率下辐照90d，每天辐照8h，接受18mgy的低剂量伽马射线辐照后，血清中idh2相对表达量下调率为32.5%，此时低剂量伽马射线辐照的生物损伤等级为
实施例3
选取6周到7周的c57bl/6j成年雄性小鼠，随机分4组，每组6只老鼠，对照组小鼠放在无伽马射线辐照的环境中饲养，实验组小鼠放在伽马射线辐照剂量率为50.0μgy/h的环境中饲养，总辐照时间为90d，每天辐照8h。采用摘眼球法取血，采集的血液放置于4oc冰箱静置过夜，隔天3000r/min离心20min分离血清。将收集的接受过低剂量电离射线辐照的c57bl/6j小鼠血清进行蛋白提取、总蛋白浓度测定、蛋白质变性、凝胶电泳、转膜、免疫反应、化学发光反应、凝胶成像扫描分析、最后按照公式（1）进行idh2的相对表达量下调率分析。
c57bl/6j成年雄性小鼠在50.0μgy/h的剂量率下辐照90d，每天辐照8h，接受36mgy的低剂量伽马射线辐照后，血清中idh2相对表达量下调率为41.6%，此时低剂量伽马射线辐照的生物损伤等级为
以上仅仅是本发明的较佳实施方式，根据本发明的上述构思，本领域的熟练人员还可对此作出各种修改和变换。例如，变换辐照射线的类型、变换小鼠模型的类型、调整辐照剂量率、采用不同辐照时间和辐照剂量、变换辐照损伤评价体系等等。然而，这些类似的变换和修改均属于本发明的实质。