组织包埋液及组织切片的制备方法与流程

本发明涉及病理分析技术领域，特别是涉及一种组织包埋液及组织切片的制备方法。

背景技术：

组织切片是进行组织病理观察及病理诊断的重要手段。目前，现有的组织切片的制备方法有石蜡切片和硬组织切片两种方法。随着医疗器械的快速发展，对于新型的以适应各种含植入物的组织切片制备方法的需求也随之增加。

石蜡切片方法适用于软组织切片，使用石蜡作为组织包埋剂。但当组织含有植入物时，特别是含有金属植入物的组织以及不脱钙骨组织时，石蜡切片不适用。

硬组织切片方法适用于硬组织(例如牙科、骨科)的切片，使用树脂作为包埋剂。随着医疗器械的发展，硬组织切片技术在含植入物的组织的病理切片中应用越发广泛。但在实际应用中存在一定的局限性，主要问题如下：

组织包埋是硬组织切片的关键点。含有植入物的组织或骨组织往往较大，组织包埋后切片存在变形的现象，这与组织包埋液相关。现有的组织包埋液难以满足快速发展的医疗器械对含植入物的组织切片制备方法的需求。

技术实现要素：

基于此，有必要提供一种组织包埋液，以制备不易变形的组织切片。

一种组织包埋液，包括树脂单体、塑化剂、催化剂、加速剂和消泡剂，其中，

所述树脂单体按体积百分比包括：亲水树脂单体30％～35％、第一疏水树脂单体55％～60％和第二疏水树脂单体5％～10％；

所述塑化剂的体积百分比为5％～8％；

所述催化剂的浓度为0.4g/100ml～0.8g/100ml；

所述加速剂的浓度为40ul/100ml～50ul/100ml；

所述消泡剂的浓度为200ul/100ml～400ul/100ml。

在其中一个实施例中，所述亲水树脂单体为甲基丙烯酸羟乙酯，所述第一疏水树脂单体为甲基丙烯酸甲酯，所述第二疏水树脂单体为甲基丙烯酸丁酯。

在其中一个实施例中，所述塑化剂为聚乙二醇，所述催化剂为过氧化苯甲酰，所述加速剂为n-n二甲基对甲苯胺，所述消泡剂为奎硫醇。

一种组织切片的制备方法，包括如下步骤:

使用上述组织包埋液对待分析组织进行包埋，然后进行切片、染色和封片，得到组织切片。

在其中一个实施例中，所述包埋是在0～4℃下进行包埋，直至固化。

在其中一个实施例中，所述包埋的步骤之前还依次包括固定、脱水、透明和渗透的步骤。

在其中一个实施例中，所述固定的步骤包括将所述待分析组织在常温的甲醛水溶液中固定12～72小时。

在其中一个实施例中，所述脱水的步骤包括依次使用体积分数为70％、80％、90％、95％、100％和100％的乙醇水溶液在常温下进行逐级脱水，每级脱水的时间为3～6小时。

在其中一个实施例中，所述透明的步骤包括使用二甲苯透明两次，每次的透明的时间为1～12小时。

在其中一个实施例中，所述渗透的步骤包括使用第一级渗透液、第二级渗透液和第三级渗透液依次进行逐级渗透，每级渗透的时间为1～3天。

在其中一个实施例中，所述第一级渗透液按体积百分比包括：第一树脂单体30％～35％、第二树脂单体55％～60％、第三树脂单体5％～10％和聚乙二醇5％～8％；

所述第二级渗透液和第三级渗透液按体积百分比包括：第一树脂单体30％～35％、第二树脂单体55％～60％、第三树脂单体5％～10％和聚乙二醇5％～8％；且包括浓度为0.4g/100ml～0.8g/100ml的过氧化苯甲酰。

在其中一个实施例中，所述切片的方法为磨片法或直接切片法。

将树脂单体、塑化剂、催化剂、加速剂和消泡剂按合适的配比形成上述组织包埋液，经实验证明，使用上述组织包埋液对待分析组织进行包埋后再切片，能够制备不易变形的组织切片。

附图说明

图1为实施例1的组织切片图；

图2为实施例2的组织切片图；

图3为实施例3的组织切片图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

一实施方式的组织包埋液，用于在病理分析中对待分析组织进行包埋。该组织包埋液包括树脂单体、塑化剂、催化剂、加速剂和消泡剂。

其中，树脂单体聚合形成树脂后的将待分析的生物组织包埋其中，作为组织载体，用于病理切片。

树脂单体按体积百分比包括：亲水树脂单体30％～35％、第一疏水树脂单体55％～60％和第二疏水树脂单体5％～10％。

塑化剂用于调节树脂单体聚合形成的树脂的韧性，有利于避免切片变形。塑化剂占组织包埋液的体积百分比为5％～8％。

催化剂用于催化树脂单体聚合形成固态的树脂。在组织包埋液中，催化剂的浓度为0.4g/100ml～0.8g/100ml。

加速剂用于加快树脂单体聚合形成固态的树脂。在组织包埋液中，加速剂的浓度为40ul/100ml～50ul/100ml。

消泡剂用于减少树脂单体聚合时产生的气泡。在组织包埋液中，消泡剂的浓度为200ul/100ml～400ul/100ml。

需要说明的是，上述树脂单体和塑化剂的体积百分比是指以三种树脂单体和塑化剂的体积之和作为总体积，各个树脂单体的体积分别占该总体积的百分比及塑化剂的体积占该总体积的百分比。由于催化剂、加速剂和消泡剂的量较小，其体积之和可以忽略，各个树脂单体和塑化剂的体积之和亦当作的组织包埋液的总体积。上述催化剂、加速剂和消泡剂的浓度中的100ml是指三种树脂单体和塑化剂的体积之和为100ml，亦当作是组织包埋液的总体积为100ml。

在进行包埋处理后，上述组织包埋液聚合形成固态物质而将待分析的生物组织包埋其中，作为组织载体，用于病理切片。

将树脂单体、塑化剂、催化剂、加速剂和消泡剂按合适的配比形成上述组织包埋液，经实验证明，使用上述组织包埋液对待分析组织进行包埋后再切片，能够制备不易变形的组织切片。

在一实施方式中，亲水树脂单体为甲基丙烯酸羟乙酯。第一疏水树脂单体为甲基丙烯酸甲酯。第二疏水树脂单体为甲基丙烯酸丁酯。甲基丙烯酸甲酯是完全疏水的，单独使用甲基丙烯酸甲酯作为树脂单体，聚合后切片变形较严重。疏水的甲基丙烯酸甲酯与亲水的甲基丙烯酸羟乙酯的按上述配比配合，切片后，切片遇水会变得平整，不易变形。并且，易于磨片，容易染色。进一步，加入适量的疏水树脂单体甲基丙烯酸丁酯，可调节聚合物的硬度，有利于避免切片变形。

在一实施方式中，塑化剂为聚乙二醇。催化剂为过氧化苯甲酰。加速剂为n-n二甲基对甲苯胺。消泡剂为奎硫醇。

在一实施方式中，塑化剂为聚乙二醇400(peg400)，聚乙二醇400能够提高聚合物的韧性，使切片不容易折断或者裂开，因而使切片不易变形。

上述组织包埋液适用于软组织的包埋和硬组织的包埋。硬组织包括牙科组织切片、骨科组织切片、含有植入物(例如，金属支架)的组织切片等。

在一实施方式中，上述组织包埋液包括：甲基丙烯酸甲酯55～60ml、甲基丙烯酸羟乙酯30～35ml、甲基丙烯酸丁酯5～10ml、聚乙二醇4005ml～8ml、过氧化苯甲酰0.4g/100ml～0.8g/100ml、n-n二甲基对甲苯胺40ul/100ml～50ul/100ml和奎硫醇200ul/100ml～400ul/100ml。

按下述方法制备该组织包埋液：按上述体积百分比将三种树脂单体和塑化剂进行混合得到混合液，按每100ml该混合液含有(亦当作组织包埋液的总体积，下同)0.4g～0.8g的浓度加入催化剂，按每100ml该混合液含有40ul～50ul的浓度加入加速剂，按每100ml该混合液含有200ul～400ul的浓度加入消泡剂，混合均匀后，得到组织包埋液。

在一实施方式中，过氧化苯甲酰的浓度为0.4g/100ml。

进一步，提供一种组织切片的制备方法，包括使用上述组织包埋液对待分析组织进行包埋，然后进行切片、染色和封片，得到组织切片。

在一实施方式中，包埋的步骤是在0～4℃下进行包埋，直至固化，即树脂单体聚合形成固态物质。包埋的步骤后，形成固态的包埋块。

在一实施方式中，包埋的步骤之前还依次包括固定、脱水、透明和渗透的步骤。

在一实施方式中，固定的步骤包括在常温下，将待分析组织在甲醛水溶液中固定12～72小时，有利于保持组织的形态学结构。其中，甲醛水溶液中，甲醛的体积百分比为10％。

在一实施方式中，脱水的步骤包括依次使用体积分数为70％、80％、90％、95％、100％和100％的乙醇水溶液在常温下进行逐级脱水，每级脱水的时间为3～6小时，一共进行5级脱水，以充分脱水，但避免引起组织收缩。在一实施方式中，当待分析组织较大时，通过加压脱水。

在一实施方式中，透明的步骤包括使用二甲苯透明两次，每次的透明的时间为1～12小时，以充分置换待分析组织中的乙醇。

在一实施方式中，渗透的步骤包括使用第一级渗透液、第二级渗透液和第三级渗透液依次进行逐级渗透，每级渗透的时间为1～3天。采用三级渗透以使树脂单体充分渗透至组织内。

在一实施方式中，第一级渗透液按体积百分比包括：第一树脂单体30％～35％、第二树脂单体55％～60％、第三树脂单体5％～10％和聚乙二醇5％～8％。

在一实施方式中，第二级渗透液和第三级渗透液相同。第二级渗透液和第三级渗透液按体积百分比包括：第一树脂单体30％～35％、第二树脂单体55％～60％、第三树脂单体5％～10％和聚乙二醇5％～8％。且还包括浓度为0.4g/100ml～0.8g/100ml的过氧化苯甲酰。需要说明的是，上述体积百分比的计算时，以第一树脂单体、第二树脂单体、第三树脂单体和聚乙二醇的体积之和作为总体积，忽略过氧化苯甲酰的体积。0.4g/100ml～0.8g/100ml是指当上述体积之和为100ml时，过氧化苯甲酰的质量为0.4g～0.8g。

在一实施方式中，上述第一级渗透液、第二级渗透液和第三级渗透液中的第一树脂单体为甲基丙烯酸羟乙酯，第二树脂单体为甲基丙烯酸甲酯，第三树脂单体为甲基丙烯酸丁酯。

采用上述第一级渗透、第二级渗透液和第三级渗透液依次进行渗透1～3天，一方面能够保证充分渗透，另一方面避免在渗透过程中树脂单体提早固化。

在一实施方式中，切片的方法为磨片法或直接切片法。

在一实施方式中，磨片法包括将固化后的包埋块切成片状，然后将切片磨薄后进行抛光。例如，切成厚度为200～400微米的切片，然后磨薄至100微米左右，再进行抛光。可采用线性切割机进行切割。

采用磨片法进行切片后，进行染色、粘片、磨片和封片后即得到组织切片。其中，可采用组织化学染色的方法进行染色。粘片是指将染色好的切片粘在粘附级载玻片上。磨片的操作进一步将切片磨得更薄，然后再次抛光并风干。封片是使用中性树胶进行封片，即得到组织切片。

在一实施方式中，直接切片法包括采用重型切片机将包埋块切成薄片，然后在体积百分数为20％～40％的乙醇水溶液中展片，薄片在乙醇溶液中缓慢展开变平。例如，采用重型切片机将包埋块切成5～8微米的薄片。

采用直接切片法进行切片后，进行粘片、染色和封片后即得到组织切片。其中，粘片是将切片移至玻片上，并在40～50℃的烤片机上烤干。可采用组织化学染色的方法进行染色。染色的切片风干后，使用中性树胶进行封片，即得到组织切片。

上述组织切片的制备方法能够制备不易变形的组织切片。并且，由于采用合适的上述组织包埋液，使得上述组织切片的制备方法的适用范围较广，不仅仅适用于软组织切片，还适用于硬组织切片；不仅适用于不含有植入物的组织切片，还适用于含有植入物的组织切片。并且，无论是含有植入物的软组织或含有植入物的硬组织，均适用。

以下进一步通过具体实施例对上述组织包埋液和组织切片的制备方法进一步阐述。

实施例1

1、在常温下，将含有金属植入体的骨组织在体积百分数为10％的甲醛水溶液中固定72小时；

2、在常温下，将步骤1得到的样品依次在体积分数为70％、80％、90％、95％、100％和100％的乙醇水溶液中逐级脱水，每级脱水的时间均为3小时；

3、在常温下，将步骤2得到样品在二甲苯中透明两次，每次透明的时间均为4小时；

4、在0℃下，使用第一级渗透液、第二级渗透液和第三级渗透液依次对步骤3得到的样品进行逐级渗透处理，其中，第一级渗透液按体积比包括甲基丙烯酸羟乙酯30ml、甲基丙烯酸甲酯55ml、甲基丙烯酸丁酯10ml和聚乙二醇4005ml。第二级渗透液和第三级渗透液相同，包括第一级渗透液按体积比包括甲基丙烯酸羟乙酯30ml、甲基丙烯酸甲酯55ml、甲基丙烯酸丁酯10ml、聚乙二醇4005ml和浓度为0.4g/100ml的过氧化苯甲酰。每级渗透的时间为1天；

5、使用组织包埋液将步骤4得到的样品在0℃下进行包埋，直至液体固化，形成包埋块。其中，组织包埋液包括甲基丙烯酸羟乙酯30ml、甲基丙烯酸甲酯55ml、甲基丙烯酸丁酯10ml、聚乙二醇4005ml、浓度为0.4g/100ml的过氧化苯甲酰、浓度为50ul/100mln-n二甲基对甲苯胺和浓度为200ul/100ml的奎硫醇；

6、采用线性切割机将步骤5得到包埋块切成厚度约为200微米的切片，然后将切片磨薄至厚度约为100微米，抛光、染色及粘片后，继续磨薄至厚度为20微米左右，抛光并风干后，使用中性树胶封片，即得到组织切片，如图1所示。

由图1可见，实施例1的组织切片平整不变形。

实施例2

1、在常温下，将骨组织在体积百分数为10％的甲醛水溶液中固定24小时；

2、在常温下，将步骤1得到的样品依次在体积分数为70％、80％、90％、95％、100％和100％的乙醇水溶液中逐级脱水，每级脱水的时间均为3小时；

3、在常温下，将步骤2得到样品在二甲苯中透明两次，每次透明的时间均为4小时；

4、在4℃下，使用第一级渗透液、第二级渗透液和第三级渗透液依次对步骤3得到的样品进行逐级渗透处理，其中，第一级渗透液按体积比包括甲基丙烯酸羟乙酯30ml、甲基丙烯酸甲酯56ml、甲基丙烯酸丁酯7ml和聚乙二醇4007ml。第二级渗透液和第三级渗透液相同，包括第一级渗透液按体积比包括甲基丙烯酸羟乙酯30ml、甲基丙烯酸甲酯55ml、甲基丙烯酸丁酯7ml、聚乙二醇4007ml和浓度为0.4g/100ml的过氧化苯甲酰。每级渗透的时间为2天；

5、使用组织包埋液将步骤4得到的样品在0℃下进行包埋，直至液体固化，形成包埋块。其中，组织包埋液包括甲基丙烯酸羟乙酯30ml、甲基丙烯酸甲酯56ml、甲基丙烯酸丁酯7ml、聚乙二醇4007ml、浓度为0.4g/100ml的过氧化苯甲酰、浓度为40ul/100mln-n二甲基对甲苯胺和浓度为300ul/100ml的奎硫醇；

6、采用线性切割机将步骤5得到包埋块切成厚度约为200微米的切片，然后将切片磨薄至厚度约为100微米，抛光、染色及粘片后，继续磨薄至厚度为20微米左右，抛光并风干后，使用中性树胶封片，即得到组织切片，如图2所示。

由图2可见，实施例2的组织切片平整不变形。

实施例3

1、在常温下，将骨组织在体积百分数为10％的甲醛水溶液中固定12小时；

2、在常温下，将步骤1得到的样品依次在体积分数为70％、80％、90％、95％、100％和100％的乙醇水溶液中逐级脱水，每级脱水的时间均为6小时；

3、在常温下，将步骤2得到样品在二甲苯中透明两次，每次透明的时间均为6小时；

4、在2℃下，使用第一级渗透液、第二级渗透液和第三级渗透液依次对步骤3得到的样品进行逐级渗透处理，其中，第一级渗透液按体积比包括甲基丙烯酸羟乙酯35ml、甲基丙烯酸甲酯55ml、甲基丙烯酸丁酯5ml和聚乙二醇4005ml。第二级渗透液和第三级渗透液相同，包括第一级渗透液按体积比包括甲基丙烯酸羟乙酯35ml、甲基丙烯酸甲酯55ml、甲基丙烯酸丁酯5ml、聚乙二醇4005ml和浓度为0.4g/100ml的过氧化苯甲酰。每级渗透的时间为3天；

5、使用组织包埋液将步骤4得到的样品在0℃下进行包埋，直至液体固化，形成包埋块。其中，组织包埋液包括甲基丙烯酸羟乙酯35ml、甲基丙烯酸甲酯55ml、甲基丙烯酸丁酯5ml、聚乙二醇4005ml、浓度为0.4g/100ml的过氧化苯甲酰、浓度为45ul/100mln-n二甲基对甲苯胺和浓度为400ul/100ml的奎硫醇；

6、采用重型切片机将步骤5得到包埋块切成厚度约为8微米的切片，然后在体积百分数为20％的乙醇水溶液中展片，接着使用粘附级载玻片将切片移至玻片上，并在40℃的烤片机上烤干，染色，使用中性树胶封片，即得到组织切片，如图3所示。

由图3可见，实施例3的组织切片平整不变形。

实施例4

1、在常温下，将含有金属支架的血管组织在体积百分数为10％的甲醛水溶液中固定24小时；

2、在常温下，将步骤1得到的样品依次在体积分数为70％、80％、90％、95％、100％和100％的乙醇水溶液中逐级脱水，每级脱水的时间均为6小时；

3、在常温下，将步骤2得到样品在二甲苯中透明两次，第一次透明的时间为1小时，第二次透明的时间为3小时；

4、在2℃下，使用第一级渗透液、第二级渗透液和第三级渗透液依次对步骤3得到的样品进行逐级渗透处理，其中，第一级渗透液按体积比包括甲基丙烯酸羟乙酯30ml、甲基丙烯酸甲酯60ml、甲基丙烯酸丁酯5ml和聚乙二醇4005ml。第二级渗透液和第三级渗透液相同，包括第一级渗透液按体积比包括甲基丙烯酸羟乙酯30ml、甲基丙烯酸甲酯60ml、甲基丙烯酸丁酯5ml、聚乙二醇4005ml和浓度为0.4g/100ml的过氧化苯甲酰。每级渗透的时间为3天；

5、使用组织包埋液将步骤4得到的样品在0℃下进行包埋，直至液体固化，形成包埋块。其中，组织包埋液包括甲基丙烯酸羟乙酯30ml、甲基丙烯酸甲酯60ml、甲基丙烯酸丁酯5ml、聚乙二醇4005ml、浓度为0.4g/100ml的过氧化苯甲酰、浓度为45ul/100mln-n二甲基对甲苯胺和浓度为400ul/100ml的奎硫醇；

6、采用重型切片机将步骤5得到包埋块切成厚度约为8微米的切片，然后在体积百分数为40％的乙醇水溶液中展片，接着使用粘附级载玻片将切片移至玻片上，并在50℃的烤片机上烤干，染色，使用中性树胶封片，即得到组织切片。

实施例5

1、在常温下，将含有金属植入体的骨组织在体积百分数为10％的甲醛水溶液中固定24小时；

2、在常温下，将步骤1得到的样品依次在体积分数为70％、80％、90％、95％、100％和100％的乙醇水溶液中逐级脱水，每级脱水的时间均为6小时；

3、在常温下，将步骤2得到样品在二甲苯中透明两次，每次透明的时间均为12小时；

4、在0℃下，使用第一级渗透液、第二级渗透液和第三级渗透液依次对步骤3得到的样品进行逐级渗透处理，其中，第一级渗透液按体积比包括甲基丙烯酸羟乙酯32ml、甲基丙烯酸甲酯55ml、甲基丙烯酸丁酯5ml和聚乙二醇4008ml。第二级渗透液和第三级渗透液相同，包括第一级渗透液按体积比包括甲基丙烯酸羟乙酯32ml、甲基丙烯酸甲酯55ml、甲基丙烯酸丁酯5ml、聚乙二醇4008ml和浓度为0.4g/100ml的过氧化苯甲酰。每级渗透的时间为1天；

5、使用组织包埋液将步骤4得到的样品在0℃下进行包埋，直至液体固化，形成包埋块。其中，组织包埋液包括甲基丙烯酸羟乙酯32ml、甲基丙烯酸甲酯55ml、甲基丙烯酸丁酯5ml、聚乙二醇4008ml、浓度为0.4g/100ml的过氧化苯甲酰、浓度为50ul/100mln-n二甲基对甲苯胺和浓度为200ul/100ml的奎硫醇；

6、采用线性切割机将步骤5得到包埋块切成厚度约为200微米的切片，然后将切片磨薄至厚度约为100微米，抛光、染色及粘片后，继续磨薄至厚度为20微米左右，抛光并风干后，使用中性树胶封片，即得到组织切片。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。