本发明涉及硝基呋喃类代谢物检测的
技术领域：
，尤其是涉及硝基呋喃类代谢物的前处理方法。
背景技术：
：目前硝基呋喃类药物是一类人工合成的广谱抗生素，因为价格较低且效果好，而广泛应用于畜禽及水产养殖业，由于硝基呋喃类药物及其代谢物对人体有致癌、致畸胎副作用，一些国家已经禁止硝基呋喃类药物在畜禽及水产动物食品中使用，但是，硝基呋喃类原型药在生物体内代谢迅速，无法检测，但其代谢产物因和蛋白质结合而保证长时间稳定存在。所以一般以硝基呋喃类药物代谢物为目标分析物的检测，来达到检测硝基呋喃类药物残留量的目的。现有的硝基呋喃类代谢物的检测方法很多，如gb/t20752-2006中的方法，对于肌肉、内脏、鱼和虾，大致均为以下步骤：水解和衍生化：在试样中加入甲醇-水混合溶液(体积比2:1)洗涤，残留物中加盐酸、内标标准溶液、邻硝基苯甲醛，混匀，在37℃避光震荡水解16h；萃取和浓缩：取出样品，冷却至室温，加入磷酸一氢钾，用氢氧化钠调ph至7.4，过hlb固相萃取柱，用乙酸乙酯洗脱，氮气吹干洗脱液，得到前处理样品，然后进行测定。上述中的现有技术方案存在以下缺陷：衍生化过程需要在37℃避光震荡水解16h，使硝基呋喃类代谢物前处理过程时间长。技术实现要素：本发明的目的一是提供一种使硝基呋喃类代谢物前处理过程时间较短的硝基呋喃类代谢物的前处理方法。本发明的上述目的是通过以下技术方案得以实现的：硝基呋喃类代谢物的前处理方法，包括以下步骤：s1：对样品进行清洗，搅碎样品得到试样；s2：向试样中加入盐酸和衍生化试剂，于50-65℃温度下超声1-1.5h；s3：调ph至7.4，加入环己烷、中性氧化铝以及促分层剂，振摇后冷冻离心，得到底层固相、中层水相a、顶层有机相；s4：取中层水相a进行固相萃取，然后用洗脱剂洗脱得到洗脱液b；s5：将洗脱液b氮气吹干，初始时流动相定容。通过采用上述技术方案，动物体内，硝基呋喃类代谢物绝大部分一结合态的形式与蛋白质结合，对样品搅碎，使样品与后续加入的盐酸和衍生化试剂的相对接触面积较大，使样品内与蛋白质结合的硝基呋喃类代谢物能够在酸性环境与蛋白质较好的分离开来，从而从样品中获得最高的硝基呋喃类代谢物残留量，同时，盐酸酸化条件下的水解步骤与衍生同时进行，使样品内的硝基呋喃类代谢物能够有较长的时间与蛋白质分离，保证了硝基呋喃类代谢物的分离量；与蛋白质分离开的游离态硝基呋喃类代谢物与衍生化试剂反应，使硝基呋喃类代谢物的衍生物的分子量增大，便于定性检测。衍生化的温度和超声条件的设置，加快了硝基呋喃类代谢物与蛋白质的分离速度，且有利于加快衍生化速度，使衍生化的时间降低，从而有利于硝基呋喃类代谢物前处理过程时间降低。环己烷的加入，脂肪会融入环己烷中，而环己烷与硝基呋喃类代谢物所在的水层分层，从而将脂肪除去，同时中性氧化铝同时也对脂肪进行吸附，进一步提高了净化效果，降低了脂肪含量，减少了脂肪对检测结果的影响，并且离心后，中性氧化铝与试样一起位于底层固相，环己烷位于顶层有机相，使中层水相a的上下层同时对脂肪进行去除，保正了脂肪的去除效果，避免了脂肪堵塞固相萃取柱，从而使固相萃取的速度不会被脂肪堵塞而减慢，避免脂肪影响待测物质的离子化过程。采用固相萃取进行净化，实现了硝基呋喃类代谢物与其他杂质的较好的分离，同时减少了洗脱剂的用量，相对于直接将洗脱剂与试样溶液混合，进行多次液液萃取，降低了洗脱剂的用量，使氮吹的洗脱液减少，有利于氮吹时间的降低。本发明进一步设置为：在s1中，用甲醇：水的体积比为2:1，对样品进行清洗。通过采用上述技术方案，除去了样品外的游离硝基呋喃类代谢物，避免了样品外可能粘有到的游离硝基呋喃类代谢物对最后检测结构造成影响；甲醇使蛋白质变性，使疏松的蛋白质结块，从而蛋白质离心后更易分离，有利于减少杂峰的出现。本发明进一步设置为：在s2中，衍生化试剂为邻硝基苯甲醛。本发明进一步设置为：在s2中，在避光环境下进行。本发明进一步设置为：在s3中，促分层剂为氯化钠溶液。通过采用上述技术方案，氯化钠溶液加大了中层水相a的电解质强度，使中层水相a和顶层有机相的极性差距变大，从而有利于加快中层水相a和顶层有机相的分层速度，使硝基呋喃类代谢物前处理过程时间较短。本发明进一步设置为：在s4中，洗脱剂为乙酸乙酯。本发明进一步设置为：在s4中，取中层水相a过hlb柱子进行固相萃取。本发明进一步设置为：在s4中，固相萃取的具体步骤为：s1：依次用3ml甲醇，5ml水对hlb柱子进行活化；s2：将中层水相a以1ml/min的速度过hlb柱子，用5ml水淋洗hlb柱子；s3：用5-10ml环己烷淋洗hlb柱子,将流出液弃去；s4：然后用洗脱剂加入hlb柱子进行洗脱得到洗脱液b。通过采用上述技术方案，将hlb柱子活化后，中层水相a过hlb柱子后，中层水相中的硝基呋喃类代谢物衍生物被hlb柱子吸附，实现了分离，然后用水淋洗，保证了所有中层水相a全部过hlb柱子，且水能够将中层水相a中的离子类杂质冲出，保证了hlb柱子内较为干净，最后用环己烷将hlb柱子中的水替换出来，使最后用洗脱剂洗脱得到的洗脱液b中的水较少，氮吹时，水的沸点为100℃，沸点相对较高，不易被氮气吹出，而环己烷的沸点为80.7℃，乙腈的沸点为81-82℃，而乙酸乙酯的沸点为77℃，从而使环己烷与洗脱剂的沸点相差不大，相对于水，较易被吹干，有利于降低洗脱液b被吹干的时间。综上所述，本发明的有益技术效果为：1.加快了硝基呋喃类代谢物与蛋白质的分离速度，且有利于加快衍生化速度，使衍生化的时间降低，从而有利于硝基呋喃类代谢物前处理过程时间降低；2.环己烷的加入，脂肪会融入环己烷中，而环己烷与硝基呋喃类代谢物所在的水层分层，从而将脂肪除去，同时中性氧化铝同时也对脂肪进行吸附，进一步提高了净化效果，降低了脂肪含量，减少了脂肪对检测结果的影响。具体实施方式实施例1硝基呋喃类代谢物的前处理方法，包括以下步骤,以下为待测样品溶液的制备：s1：取2g样品(本实施例样品为猪肉样品)，使5ml体积比为2:1的甲醇：水溶液对样品进行洗涤，对样品进行清洗，搅碎样品得到试样，在试样中加入0.5ml0.1μg/ml四种硝基呋喃代谢物混合内标标准溶液(甲醇稀释)；s2：向试样中加入10ml0.2mol/l盐酸晃匀，加入0.3ml0.05mol/l的衍生化试剂(溶剂为二甲亚砜)，衍生化试剂为邻硝基苯甲醛，在避光环境下，50℃温度下超声1h；s3：用1mol/l的氢氧化钠溶液调ph至7.4，加入3ml1mol/l的促分层剂，促分层剂为氯化钠溶液，用水定容至25ml，加入10ml环己烷、1g中性氧化铝,振摇后冷冻离心，得到底层固相、中层水相a、顶层有机相；s4：依次用3ml甲醇，5ml水对hlb柱子进行活化；取10ml中层水相a以1ml/min的速度过hlb柱子，用5ml水淋洗hlb柱子；用5ml环己烷淋洗hlb柱子,将流出液弃去；然后将5ml洗脱剂加入hlb柱子进行洗脱得到洗脱液b，洗脱剂为乙酸乙酯，然后用洗脱剂洗脱得到洗脱液b；s5：将洗脱液b用40℃氮气吹干，初始时流动相定容至1ml,混匀后过0.2μm滤膜，以待测定。实施例2与实施例1的不同之处在于：s2中，60℃温度下超声1.2h。实施例3与实施例1的不同之处在于：s2中，65℃温度下超声1.5h，实施例4与实施例2的不同之处在于：s4中，用7ml环己烷淋洗hlb柱子。实施例5与实施例2的不同之处在于：s4中，用10ml环己烷淋洗hlb柱子。对比例1：采用gb/t20752-2006中的方法。检测数据：采用液相色谱-质谱连用1、仪器条件(与gb/t20752-2006中的仪器条件相同)：1.1液相色谱条件色谱柱：atlantis-c18柱(2.1×150mm，3.5μm)；流动相：如表1所示；流速：200μl/min；柱温：35℃；进样量：40μl。表1-流动相梯度洗脱条件：时间(min)0.3％乙酸水溶液(％)0.3％乙酸乙腈溶液(％)0.0080203.0080208.0060408.01109016.0080201.2质谱条件离子源：esi离子源；扫描方式：正离子扫描；喷雾电压：5000v；辅助气(aux)流速:7l/min；辅助气温度(tem)：480℃；聚焦电压(fp)：150v；碰撞室出口电压(cxp)；11v；去簇电压(dp)：45v；四种硝基呋喃代谢物和内标衍生物的定性离子对、定性离子对、采集时间及碰撞气能量质谱参见表2。表2-四种硝基呋喃代谢物和内标衍生物的质谱参数：2、测定方法验证2.1、线性范围和相关系数在实施例4的实验条件下，以空白基质溶液配制四种硝基呋喃代谢物混合标准溶液浓度在0.5、1、2、4、10ng/ml，进样，记录色谱图，绘制标准曲线，并计算线性回归方程，线性方程和相关系数见表3。表3-回归方程及相关系数由表3可以看出，该方法的相关系数均大于0.99，在四种硝基呋喃代谢物浓度为0.5-10ng/ml范围内，线性良好；并且以3倍信噪比(s/n)计算4种硝基呋喃类代谢物的检出限(lod)为0.2μg/kg，以10倍信噪比(s/n)计算4种硝基呋喃类代谢物的检出限(lod)为0.5μg/kg。2.2、添加回收试验在实施例4的试验条件下，向对不含待测物的空白基质中，在s1步骤清洗完毕后，添加不同浓度的四种硝基呋喃代谢物混合标准溶液，回收率及平均回收率见表4。2.3精密度实验在2.2的条件下，每个相同条件一个做5组平行试验，rsd值见表4。表4-硝基呋喃代谢物添加回收率及相对标准偏差表(n＝5)由表4可知，各代谢物在不同的硝基呋喃代谢物添加浓度下，回收率大部分在88-97％方位内，且rsd范围在1.13-3.51％之间，从而回收率良好，精密度良好。3、在实施例1-5各自的条件下，以及对比例1的条件下，添加浓度为4μg/kg的四种硝基呋喃代谢物混合标准溶液，回收率和氮吹时间见表5.表5-回收率和氮吹时间表根据表5可以看出，实施例1-5的回收率基本与对比例中的回收率相差不大，说明该方法达到国标规定的回收率；相对于对比例1的16h的衍生化时间，实施例1-5的衍生化时间在1-1.5h的范围内，大大节约了衍生化时间。实施例1-3中，实施例1的回收率低于实施例2和3，而实施例2和3的回收率相差不大，说明实施例2和3的延伸程度大于实施例1，实施例2和3相比，实施例3的延伸温度和时间均加长，但是回收率相差不大，说明在实施例2的条件下，已经基本为衍生终点，但实施例3的衍生化时间大于实施例2的衍生化时间，为了进一步降低整个前处理的时间，最优条件为实施例2中的条件。实施例2、4、5与对比例1相比，氮吹时间降低30min以上,明显降低了洗脱液b被吹干的时间，而5ml-10ml环己烷通过柱子的时间在4-8min内，整体使氮吹时间变短，所以环己烷的加入降低了氮吹时间；实施例2、4、5之间对比，实施例2的氮吹时间大于实施例4和5，实施例4和5中，实施例5的环己烷的增加，使氮吹的吹干时间变化不大，实施例5比实施例4中的环己烷的量多，加上多余的环己烷过柱子所需的时间，实施例4和5的洗脱和氮吹时间基本相近，但是实施例4所需的溶剂较少，较为节约，所以最优条件为实施例4中的条件。本具体实施方式的实施例均为本发明的较佳实施例，并非依此限制本发明的保护范围，故：凡依本发明的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围之内。当前第1页12