一种用于眼球组织的固定液以及眼球组织制片的预处理方法与流程

本发明属于病理试剂技术领域，具体涉及一种用于眼球组织的固定液以及眼球组织制片的预处理方法。

背景技术：

眼球的结构精密复杂，眼球壁各层组织软硬程度相差悬殊，且视网膜、脉络膜、巩膜之间连接性差。在固定过程中，常规的固定液难以穿透致密的巩膜，导致无法使用现有的石蜡切片方法来制备眼球石蜡切片。现在常用多聚甲醛先进行固定然后用乙醇脱水，但是由于各层的收缩率会产生组织分离，特别是造成视网膜的分离和脱落。

此外，由于眼球中存在维持眼球内部的压力房水和玻璃体，这进一步增加了眼球制片的难度，操作者如果直接通过粗切来去除房水和玻璃体，很容易导致切口不平整，甚至发生破坏眼球结构，导致视网膜脱落和碎裂。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种用于眼球组织的固定液以及眼球组织制片的预处理方法。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：

一种用于眼球组织的固定液，由房水等渗液、乙酸、甲醛、无水乙醇和纯水组成，所述房水等渗液由氯化钠、尿素、氯化钾和纯水组成，所述固定液的各组分按体积百分比计为：房水等渗液20～50％、乙酸1％～10％、甲醛溶液1～15％、无水乙醇30％～50％、纯水10～20％。

上述方案中，所述房水等渗液中氯化钠的浓度为136～154mm，尿素的浓度为10～15mm，氯化钾的浓度为1～3mm。

上述方案中，所述甲醛溶液的体积浓度为37～40％。

一种眼球组织制片的预处理方法，包括如下步骤：

(1)使用所述固定液固定所述眼球组织，再将固定的眼球组织用冰冻切片包埋剂包埋；

(2)将步骤(1)包埋后的眼球组织冷冻，使眼球组织变硬；然后对冷冻的眼球组织进行粗切，去除眼球组织内的房水和玻璃体；

(3)将步骤(2)去除了房水和玻璃体的眼球组织重新用所述固定液固定；固定结束后再将眼球组织进行梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡浸蜡包埋。

上述方案中，步骤(1)所述冰冻切片包埋剂为oct包埋剂。

上述方案中，步骤(1)所述使用固定液固定眼球组织的时间为22～24h。

上述方案中，步骤(2)所述眼球组织的冷冻和粗切都在冰冻切片机上进行。

上述方案中，步骤(2)所述冷冻眼球组织的温度为-20℃至-25℃。

上述方案中，步骤(2)所述粗切的形式为：沿眼球组织的矢状面方向切去所述眼球组织的1/4至1/3。

上述方案中，步骤(3)所述眼球组织重新用所述固定液固定的时间为24～48h。

上述方案中，步骤(3)所述梯度酒精脱水的具体流程为：75％酒精4h，85％酒精2h，90％酒精2h，95％酒精1h，无水乙醇i30min，无水乙醇ii30min。

上述方案中，所述二甲苯透明的具体流程为：二甲苯i5～10min，二甲苯ii5～10min。

上述方案中，所述石蜡浸蜡包埋的具体流程为：石蜡i1h，石蜡ii1h，石蜡iii1h

本发明的有益效果：

(1)本发明所述固定液既能够快速充分地渗透至眼球组织中，又不会使眼球的各结构层发生膨胀，有利于保持眼球的结构完整性；本发明所述预处理方法通过先冷冻眼球，然后用冰冻切片刀对眼球进行裁切修理，以去除眼球内部的房水和玻璃体，眼球组织经冷冻以后组织变硬便于后面冰切机修切，比手工修切切面平整以此来防止视网膜的脱落、碎裂，并且防止了眼球在制样过程中发生变形。

(2)采用本发明所述固定液和预处理方法进行眼球切片处理，眼球各层组织结构完整，无明显结构改变，未见视网膜的脱落和分离，眼球各层组织结构清晰无裂隙；切片厚薄均匀，没有脱片现象；组织细胞间无龟裂变形，无细胞过度收缩和膨胀，未见组织的自溶；细胞核仁、核膜清晰,染色质均匀，色泽亮丽，颜色对比明显；能更好的保证眼球形态，防止制片过程中视网膜的碎裂和脱落，对眼球后续形态学，组织学，病理学的研究有积极而深远的意义。

附图说明

图1为使用常规方法得到的眼球切片的he染色图。

图2为实施例1使用本发明的固定液和预处理方法处理后制备的眼球切片的he染色图。

图3为实施例2使用本发明的固定液和预处理方法处理后制备的眼球切片的he染色图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1

眼球组织的固定液的成分如下：房水等渗液35ml，甲醛10ml，乙酸5ml，无水乙醇37.5ml，纯水12.5ml。所述房水等渗液由氯化钠、尿素、氯化钾和纯水组成，氯化钠的浓度为137.9mm，尿素的浓度为13.43mm，氯化钾的浓度为2.67mm。将上述液体混合，得到无色无沉淀的溶液即为本实施例的固定液。

一种眼球组织制片的预处理方法，包括如下步骤：

(1)使用所述固定液固定所述眼球组织22h；

(2)使用oct包埋剂包埋步骤(1)固定的眼球组织；

(3)将步骤(2)包埋的眼球组织置于-20℃下冷冻；

(4)将步骤(3)得到的冷冻的眼球组织于冰冻切片机上-20℃条件下，沿矢状面方向切去所述眼球组织的1/4，去除所述眼球组织内的房水和玻璃体；

(5)将步骤(4)处理后的眼球组织返回所述固定液中固定24h；

(6)将步骤(5)固定好的眼球组织使用梯度酒精脱水，具体流程为75％酒精4h，85％酒精2h，90％酒精2h，95％酒精1h，无水乙醇i30min，无水乙醇ii30min；

(7)再使用二甲苯透明，具体流程为：二甲苯i5～10min，二甲苯ii5～10min；

(8)再使用石蜡浸蜡包埋，具体流程为：石蜡i1h，石蜡ii1h，石蜡iii1h。

最后将经过浸蜡处理的眼球组织包埋切片，得到石蜡切片。将通过本实施例预处理方法获得的石蜡切片进行he染色，封固，拍照处理，即得图2所示效果。(注：he染色步骤为本领域技术人员所熟知的染色方法)。

以常规制片方法获得的眼球石蜡切片进行he染色为对照。所述采用常规方法制作眼球切片的过程为：

(1)使用4％多聚甲醛固定眼球组织24h；

(2)将步骤(1)固定后的眼球组织用梯度酒精进行脱水，具体流程为：75％酒精4h，85％酒精2h，90％酒精2h，95％酒精1h，无水乙醇i30min，无水乙醇ii30min；

(3)使用二甲苯透明，具体流程为：二甲苯i5-10min，二甲苯ii5-10min；

(4)使用石蜡浸蜡包埋，具体流程为：石蜡i1h，石蜡ii1h，石蜡iii1h；

将经过浸蜡处理的眼球组织包埋切片，然后将制作眼球切片进行he染色，封固，拍照处理，即得图1所示效果。

图1为使用常规方法得到的眼球切片的he染色图，从图1所示结果可以看出，使用多聚甲醛固定并用常规方法制片的眼球石蜡切片中，视网膜脱落，眼球结构完全变形。

图2为使用本发明的固定液和预处理方法处理后制备的眼球切片的he染色图。从图2中可以看出，眼球各层组织结构完整，无明显结构改变，未见视网膜的脱落和分离，眼球各层组织结构清晰无裂隙；切片厚薄均匀，没有脱片现象；组织细胞间无龟裂变形，无细胞过度收缩和膨胀，未见组织的自溶；细胞核仁、核膜清晰,染色质均匀，色泽亮丽，颜色对比明显。

图2和图1的对比，可以得出对于眼球的固定和制片，本发明中的眼球固定液及配套的眼球组织制片的预处理方法比本技术领域技术人员所熟悉的常规制片方法能更好的保证眼球的形态，防止制片过程中视网膜的碎裂和脱落，对眼球后续形态学，组织学，病理学的研究有积极而深远的意义。

实施例2

眼球组织的固定液的成分如下：房水等渗液40ml，甲醛7ml，乙酸3ml，无水乙醇30ml，纯水20ml。所述房水等渗液由氯化钠、尿素、氯化钾和纯水组成，其中氯化钠浓度为150mm，尿素浓度为3mm，氯化钾浓度为1mm。将上述液体混合，得到无色无沉淀的溶液即为本实施例的固定液。

一种眼球组织制片的预处理方法，包括如下步骤：

(1)使用所述固定液固定所述眼球组织24h；

(2)使用oct包埋剂包埋步骤(1)固定的眼球组织；

(3)将步骤(2)包埋的眼球组织置于-25℃冷冻；

(4)将步骤(3)得到的冷冻的眼球组织于冰冻切片机上-25℃条件下，沿矢状面方向切去所述眼球组织的1/3，去除所述眼球组织内的房水和玻璃体；

(5)将步骤(4)处理后的眼球组织返回所述固定液中固定48h；

(6)将步骤(5)固定好的眼球组织使用梯度酒精脱水，具体流程为：75％酒精4h，85％酒精2h，90％酒精2h，95％酒精1h，无水乙醇i30min，无水乙醇ii30min；

(7)再使用二甲苯透明，具体流程为：二甲苯i5～10min，二甲苯ii5～10min；

(8)再使用石蜡浸蜡包埋，具体流程为：石蜡i1h，石蜡ii1h，石蜡iii1h；

最后将经过浸蜡处理的眼球组织包埋切片，得到石蜡切片。将通过本实施例预处理方法获得的石蜡切片进行he染色，封固，拍照处理，即得图3所示效果。(注：he染色步骤为本领域技术人员所熟知的染色方法)。

以常规制片方法获得的眼球石蜡切片进行he染色为对照。所述采用常规方法制作眼球切片的过程为：

(1)使用4％多聚甲醛固定眼球组织24h；

(2)将步骤(1)固定后的眼球组织用梯度酒精进行脱水，具体流程为：75％酒精4h，85％酒精2h，90％酒精2h，95％酒精1h，无水乙醇i30min，无水乙醇ii30min；

(3)使用二甲苯透明，具体流程为：二甲苯i5～10min，二甲苯ii5～10min；

(4)使用石蜡浸蜡包埋，具体流程为：石蜡i1h，石蜡ii1h，石蜡iii1h；

将经过浸蜡处理的眼球组织包埋切片。将常规方法制作眼球切片进行he染色，封固，拍照处理，即得图1所示效果。

图1为使用常规方法得到的眼球切片的he染色图，从图1所示结果可以看出，使用多聚甲醛固定并用常规方法制片的眼球石蜡切片中，视网膜脱落，眼球结构完全变形。

图3为使用本发明的固定液和预处理方法处理后制备的眼球切片的he染色图。从图3中可以看出，眼球各层组织结构完整，无明显结构改变，未见视网膜的脱落和分离，眼球各层组织结构清晰无裂隙；切片厚薄均匀，没有脱片现象；组织细胞间无龟裂变形，无细胞过度收缩和膨胀，未见组织的自溶；细胞核仁、核膜清晰,染色质均匀，色泽亮丽，颜色对比明显。

图3和图1的对比，可以得出对于眼球的固定和制片，本发明中的眼球固定液及配套的眼球组织制片的预处理方法比本技术领域技术人员所熟悉的常规制片方法能更好的保证眼球的形态，防止制片过程中视网膜的碎裂和脱落，对眼球后续形态学，组织学，病理学的研究有积极而深远的意义。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。