胰岛再生原蛋白1α的应用及其检测方法与流程

本发明属于医学诊断和检测领域，涉及一种胰岛再生原蛋白1α的应用及其检测方法。
背景技术：
：结直肠癌(colorectalcancer，crc)是我国发病率第三的恶性肿瘤，其发病与生活方式、遗传、大肠腺瘤等关系密切。发病年龄趋老年化，男女之比为1.65：1。大肠癌的发生与高脂肪低纤维素饮食、大肠慢性炎症、大肠腺瘤、遗传因素和其他因素如：血吸虫病、盆腔放射、环境因素(如土壤中缺钼)、吸烟等有关。大肠癌早期无症状，或症状不明显，仅感不适、消化不良、大便潜血等。随着癌肿发展，症状逐渐出现，表现为大便习惯改变、腹痛、便血、腹部包块、肠梗阻等，伴或不伴贫血、发热和消瘦等全身症状。肿瘤因转移、浸润可引起受体器官的改变。大肠癌因其发部位不同而表现出不同的临床症状及体征。目前临床上最主要的检测大肠癌的手段是纤维结肠镜检查，将纤维结肠镜伸入到结肠起始部位回盲部，检查结肠和直肠肠腔，并在检查过程中进行活检和治疗。crc的“三早”防治是提高生存率的关键，卫生部《中国癌症预防与控制规划纲要(2004-2010)》曾指出癌症的早期发现、早期诊断、早期治疗作为我国提高五年生存率及降低死亡率的主要策略之一。然而，结肠镜作为结直肠癌的诊断金标准，由于其具有侵入性、检查之前需要饮用大量泻药，且存在肠穿孔的风险，导致受试者依从性差。大多数肠癌患者在确诊时，已处于中晚期阶段，此时即便采取治疗措施，其五年生存率也大幅降低。传统与结直肠癌相关的肿瘤标志物包括cea、ca199以及ca724，多用于治疗用药检测以及预后评估，但其存在准确度低等问题，因此，非常需要有差异显著、灵敏度高、特异性好的标志物作为辅助判断手段。技术实现要素：本发明的目的是提供一种胰岛再生原蛋白1α的应用方法。本发明的另一个目的是提供一种胰岛再生原蛋白1α的检测方法及其检测试剂盒。根据本发明的研究结果，胰岛再生原蛋白1α可作为一种新的人结直肠癌标志物和筛选检测、治疗抗结直肠癌药物的靶标。本发明中的胰岛再生原蛋白1α(regeneratingfamilymember1alpha，reg1a)的编码基因分离自小鼠增生胰腺β细胞cdna，其在人类肠道黏膜上皮细胞中表达，与肠道黏膜细胞增殖及肿瘤的发生有关。已知的人类reg1a蛋白是由166个氨基酸组成的分泌蛋白，其蛋白序列为：maqtssyfmlisclmflsqsqgqeaqtelpqariscpegtnayrsycyyfnedretwvdadlycqnmnsgnlvsvltqaegafvaslikesgtddfnvwiglhdpkknrrwhwssgslvsykswgigapssvnpgycvsltsstgfqkwkdvpcedkfsfvckfkn。具体的，该胰岛再生原蛋白1α(reg1a)的氨基酸序列见seqidno：1所示。本发明提供了胰岛再生原蛋白1α的一种应用方法，所述应用方法是胰岛再生原蛋白1α在用于制备预测或诊断结直肠癌试剂中的应用。优选的，所述胰岛再生原蛋白1α在制备预测或诊断结直肠癌试剂盒中的应用。优选的，所述胰岛再生原蛋白1α在制备诊断、缓解或治疗结直肠癌的药剂中的应用。更优选的，所述胰岛再生原蛋白1α作为筛选制备诊断、缓解或治疗结直肠癌的药剂的靶标。本发明第二个方面提供了一种检测试剂盒，所述检测试剂盒包括能够与胰岛再生原蛋白1α特异性结合的抗体。优选的，所述检测试剂盒含有胰岛再生原蛋白1α校准品。优选的，所述能够与胰岛再生原蛋白1α特异性结合的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。较佳的，所述抗体为辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体。在本发明的一优选实施例中，所述检测试剂盒为酶联免疫试剂盒，试剂盒包括：包被单克隆抗体的酶标板，reg1a校准品、质控品，辣根过氧化物酶(hpr)标记的单克隆抗体(检测抗体)，20*浓缩洗液，显色液a/b，终止液。本发明第三个方面提供了一种胰岛再生原蛋白1α的检测方法，包括：(a)分离提取样本中的蛋白质；和/或(b)检测(a)所得的蛋白质中胰岛再生原蛋白1α的含量。本发明不限于上述步骤，还可以包含其他的步骤，例如在步骤(a)之前、步骤(a)和(b)之间、步骤(b)之后，还包含其他额外的步骤，而不超出本发明的保护范围。优选的，所述样本为血清样本。优选的，利用胰岛再生原蛋白1α的抗体与样本中的蛋白反应，检测胰岛再生原蛋白1α的蛋白表达量。优选地，采用酶联免疫法检测样本中胰岛再生原蛋白1α的含量。在本发明的一优选实施例中，检测方法具体包括以下步骤：(一)预处理1.酶标板制备(1)包被：将包被抗体(抗reg1a单克隆抗体)用包被液(10mmpbs)配制成浓度为1.0μg/ml的溶液，加入到酶标板中，4℃孵育过夜，弃掉包被液，用pbst(10mmpbs+0.05％吐温20)清洗一遍，拍干；(2)封闭：向包被后的酶标板中加入封闭液，37摄氏度孵育1h后弃掉封闭液。2.校准品制备：配制标准品稀释液，然后将reg1a重组蛋白分别稀释成1、5、10、50、75ng/ml的溶液作为校准品，标准品稀释液(10mmpbs+0.1％吐温20+0.5％牛血清白蛋白)为0浓度校准品。3.检测抗体制备：采用过碘酸钠法将辣根过氧化物酶(hpr)标记到抗reg1a单克隆抗体上，用酶标抗体稀释液(湖州英创cat#hrp-sd-001)将标记好的检测抗体稀释8w倍。(二)检测1.复温：取酶标板，在室温下静置30min；2.加样：分别向酶标板内加入校准品和待测样本，5μl/孔，然后加入酶标抗体，195μl/孔，37℃孵育30min；3.清洗：用pbst洗板4次，拍干；4.显色：将显色液a/b(湖州英创cat#tmb-s-003)按1:1比例混合(现配现用)，加入到孔板内，150μl/孔，37℃避光孵育15-20min；5.终止：向孔板内加入终止液(0.2mh2so4)，50μl/孔；6.读数：用酶标仪读取450nm下的od值；7.数据处理：以校准品浓度为横坐标，od值为纵坐标，作标准曲线；计算标准曲线回归系数r2，r2>0.9900；将待测样本的测定od值带入标准曲线，即可算得reg1a浓度值。本发明第四个方面公开了上述检测试剂盒或检测方法在结直肠癌预测、诊断或治疗领域中的应用。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，而不超出本发明的构思与保护范围。本发明的有益效果：本发明提供了一个用于预测或诊断结直肠癌的新的蛋白标志物reg1a，以及利用该标志物制备预测或诊断结直肠癌的制剂和试剂盒。本发明的检测试剂盒高效、灵敏、特异性强，相关的检测方法快速、简便，成本较低。附图说明图1为本发明实施例1中的标准曲线图。具体实施方式本发明提供了一个用于预测或诊断结直肠癌的新的蛋白标志物reg1a，以及利用该标志物制备预测或诊断结直肠癌的制剂和试剂盒。下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。实施例1本实施例公开了一种检测胰岛再生原蛋白1α的方法，具体包括以下步骤：(一)预处理1.酶标板制备(1)包被：将包被抗体(抗reg1a单克隆抗体)用包被液(10mmpbs)配制成浓度为1.0μg/ml的溶液，加入到酶标板中，4℃孵育过夜，弃掉包被液，用pbst(10mmpbs+0.05％吐温20)清洗一遍，拍干；(2)封闭：向包被后的酶标板中加入封闭液，37摄氏度孵育1h后弃掉封闭液。2.校准品制备：配制标准品稀释液，然后将reg1a重组蛋白分别稀释成1、5、10、50、75ng/ml的溶液作为校准品，标准品稀释液(10mmpbs+0.1％吐温20+0.5％牛血清白蛋白)为0浓度校准品。3.检测抗体制备：采用过碘酸钠法将辣根过氧化物酶(hpr)标记到抗reg1a单克隆抗体上，用酶标抗体稀释液(湖州英创cat#hrp-sd-001)将标记好的检测抗体稀释8w倍。(二)检测1.复温：取酶标板，在室温下静置30min；2.加样：分别向酶标板内加入校准品和待测样本，5μl/孔，然后加入酶标抗体，195μl/孔，37℃孵育30min；3.清洗：用pbst洗板4次，拍干；4.显色：将显色液a/b(湖州英创cat#tmb-s-003)按1:1比例混合(现配现用)，加入到孔板内，150μl/孔，37℃避光孵育15-20min；5.终止：向孔板内加入终止液(0.2mh2so4)，50μl/孔；6.读数：用酶标仪读取450nm下的od值；7.数据处理：以校准品浓度为横坐标，od值为纵坐标，作标准曲线；计算标准曲线回归系数r2，r2>0.9900；将待测样本的测定od值带入标准曲线，即可算得reg1a浓度值。该标准曲线如图1所示。实施例2本实施例使用实施例1公开的方法对样本中的胰岛再生原蛋白1α检测方法进行检测，并将测试结果进行统计学分析。其中，一共采集2539例样本，样本信息如表1所示。表1样本信息样本类型样本例数男/女正常人样本822428/394肠癌早期样本870501/369肠癌中期样本514327/187肠癌晚期样本333225/108合计25391481/1058所有样本的检测结果统计学分析如表2所示。表2中cutoff值是指reg1a浓度值≥38为阳性结果，reg1a浓度值＜38为阴性结果。表2reg1a样本测试结果统计学分析同时，本实施例对表1所示的样本中血清标志物cea进行检测(检测方法为常规的cea检测方法)，检测结果如表3所示。表3cea样本测试结果统计学分析从表2和表3可知，相比于已知的血清标志物cea，reg1a可作为预测或诊断结直肠癌的新的蛋白标志物，其auc值更高，在肠癌早期和中期检测中，其灵敏度和特异性更强。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>深圳市盛波尔生命科学技术有限责任公司<120>胰岛再生原蛋白1α的应用及其检测方法<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>2<211>166<212>prt<213>人工序列(artificalsequence)<400>2metalaglnthrsersertyrphemetleuilesercysleumetphe151015leuserglnserglnglyglnglualaglnthrgluleuproglnala202530argilesercysprogluglythrasnalathrargserthrcysthr354045tyrpheasngluasparggluthrtrpvalaspalaaspleutyrcys505560glnasnmetasnserglyasnleuvalservalleuthrglnalaglu65707580glyalaphevalalaserleuilelysgluserglythraspaspphe859095asnvaltrpileglyleuhisaspprolyslysasnargargtrphis100105110trpserserglyserleuvalserthrlyssertrpglyileglyala115120125proserservalasnproglythrcysvalserleuthrserserthr130135140glypheglnlystrplysaspvalprocysgluasplyspheserphe145150155160valcyslysphelysasn165当前第1页12