本发明涉及判断动物妊娠的方法，具体涉及一种雌性东北虎超早孕检测方法。
背景技术：
众所周知，人工饲养是我国东北虎迁地保护或易地保护的一种有效措施，对保护东北虎的基因多样性和种群规模都是一种极好的措施。尽管目前我国人工饲养东北虎种群已经具有较好的数量规模，但野生东北虎的数量仍然极少，早已处于濒危状态；而将人工饲养的东北虎进行野化是扩大野生种群的方法之一。然而野化需要足够大的人工种群以及足够健康的个体作为保证，这一点目前人工饲养的东北虎种群数量和质量仍然不能满足需求。为了进一步扩大东北虎人工饲养的种群数量和质量，还需要进一步加强人工饲养东北虎的繁殖规模。
老虎交配后，管理人员最关注的是雌虎是否成功妊娠，而且越早判断越便于管理。这主要体现在以下几个方面：
1、如果能提早确定雌虎的妊娠状况，就不需要再让雌雄虎进行二次交配，这减少了雌雄虎交配中经常发生的打斗现象，从而减少了给这些珍贵的“种源虎”带来的伤害；
2、饲养者出于繁殖的需要，要时刻关注雌虎是否发情，确认了雌虎的妊娠，就不需要再时刻关注她是否再次出现发情现象，从而可以减轻饲养者的工作负担；
3、一旦确定了妊娠，饲养者就可以为雌虎提供更好的食宿条件，减少鸡鸭肉供给并增加牛肉的供给，提供环境更好的圈舍。
然而，目前东北虎的妊娠判断都是根据外部形态观察来判断的，缺乏准确性。尤其是对于怀孕早期的判断，因为雌虎妊娠前后体形变化很小，所以很难根据外部形态观察进行判断，对于雌性东北虎交配后是否成功妊娠，短时间内还没有切实有效的方法。
技术实现要素：
本发明的目的提供一种对雌性东北虎进行超早孕检测的方法，使东北虎的饲养者不再毫无依据或仅仅根据雌虎体形的变化来盲目臆断雌性东北虎妊娠与否，从而极大地提高雌性东北虎的早期妊娠判断准确率，为老虎的生产繁殖与保护做出贡献。
本发明的技术解决方案是：
一种雌性东北虎超早孕检测方法，它包括以下步骤：
第一步：连续采集雌性东北虎交配期的新鲜尿液，每天1次，做好区分和标记，零下20℃冷冻保存；
第二步：待该雌性东北虎交配结束后，再连续采集其交配结束后第1周的新鲜尿液，每天1次，做好区分和标记，零下20℃冷冻保存；
第三步：将以上两步采集到的全部尿液送检，测量出每一个尿样中的孕酮水平并做好记录；
第四步：将交配期和交配结束后第1周所测的尿液孕酮水平利用spss统计软件进行对比分析，如果数值符合正态分布，分别进行独立样本t检验并做好记录；如果数值属于非正态分布，则进行kruskal–wallish和mann–whitneyutest检验并做好记录；
如果该雌性东北虎交配结束后第1周的尿液孕酮平均水平高于交配期的尿液孕酮平均水平，且达到p＜0.05的显著程度，就可以判断这只雌性东北虎成功妊娠。
本发明的技术效果是：这种方法可以使人工饲养东北虎种群更便于管理，不再需要让老虎进行二次交配以避免雌雄虎打斗受伤的风险，不再需要关注雌虎是否再次发情，并可以为确定妊娠的雌虎提供更好的饮食条件，不再需要根据外部形态观察来判断雌虎是否成功妊娠，判断雌虎成功妊娠效果准确。它不但为东北虎这一国家i级濒危保护动物的早期妊娠诊断和饲养繁殖管理提供很大方便，还对东北虎的保护和其他珍惜濒危动物的早期妊娠判断有很好的借鉴意义。
另外，这种早期判断雌性东北虎成功妊娠的方法成本低，速度快，一个尿液样本送检费用只有10-12元（以北京北方生物技术研究所有限公司的放射性免疫同位素法检测价格为例）；一只雌性东北虎交配期大约7天左右，交配期和交配结束后第1周全部样本共14个左右，这样150-200元左右即可以确定虎是否妊娠；时间一般3-5天即可以给出检测结果，1周内即可确定结果，具有很好的实际可操作性。
本发明是一种可以对雌性东北虎交配结束后第1周即进行妊娠检测的方法，其检测结果准确，可靠性高。饲养和繁殖管理者不再需要在虎交配结束后还要不间断地时刻观察虎是否会因为没有成功妊娠而再次发情，观察时间往往需要几周到1-2个月不等（雌性东北虎未妊娠的情况下两次发情间隔时间通常为1个月）；不再因观察判断错误使已经成功妊娠的虎再进行交配，导致雌雄虎因配对不和出现打斗造成虎受伤。本发明为虎的繁殖管理提供了很大方便，也为其他动物的妊娠诊断和繁殖管理提供了借鉴。
具体实施方式
一、实验对象：
12只成年雌性东北虎（均有繁殖经历），其编号分别为：202号、262号、312号、382号、440号、520号、526号、536号、576号、654号、754号、1154号。
二、实验方法：
它包括以下步骤：
第一步：采集上述12只成年雌性东北虎每一只个体交配期（有的雌性东北虎只参与了一次交配，有的参与多次交配，参与多次发情交配的雌性东北虎选择它的最后一次交配期）的新鲜尿液，每天1次（如因故未能采集到某1天或几天的尿液，则时间顺延），每次2ml，做好区分和标记，冷冻于零下20℃的冰箱中；
第二步：待该雌性东北虎交配结束后，再连续采集其交配结束后第1周的新鲜尿液，每天1次（如因故未能采集到某1天或几天的尿液，则时间顺延），每次2ml，做好区分和标记，冷冻于零下20℃的冰箱中；
第三步：将每一只雌性东北虎整个交配期（多次发情交配的雌性东北虎选择它的最后一次交配期）和交配结束后第1周所收集到的尿液送检，利用放射性免疫同位素法对两个时期全部雌性东北虎尿液中的孕酮水平进行测量并做好记录，分别得到表1和表2的结果。
表1雌性东北虎交配期的尿液孕酮水平（ng/ml）
表1（续）雌性东北虎交配期的尿液孕酮水平（ng/ml）
表2雌性东北虎交配后第1周尿液孕酮水平（ng/ml）
表2（续）雌性东北虎交配后第1周尿液孕酮水平（ng/ml）
第四步：对每只雌性东北虎在交配期和交配结束后第1周所测的孕酮水平利用spss统计软件分别进行对比分析，如果数据符合正态分布，分别进行独立样本t检验并做好记录；如果数据属于非正态分布，则进行kruskal–wallish和mann–whitneyutest检验并做好记录。所有统计都利用spss软件进行双尾检验，显著性水平α=0.05，平均数据记录为平均值±标准误(mean±se)。
根据最终雌性东北虎是否产仔分成妊娠和未妊娠两组，根据上述表1和表2的尿液孕酮数据统计出妊娠组和未妊娠组交配期和交配后第1周的尿液孕酮平均水平做好记录，得出表3和表4的结果。
表3妊娠雌性东北虎交配期和交配后第1周内尿液孕酮平均水平的差异性（ng/ml）
表4未妊娠虎交配期和交配后第1周尿液孕酮平均水平的差异性（ng/ml）
由以上两个表格，将每只雌性东北虎采集交配结束后第1周的尿液孕酮平均水平与交配期的尿液孕酮平均水平做对比，如果交配结束后第1周的尿液孕酮平均水平显著（p＜0.05）高于交配期的尿液孕酮水平，就可以判断该雌性东北虎成功妊娠，否则说明未成功妊娠。
三、实验结果统计分析：
妊娠（交配后产仔）的雌性东北虎交配期和交配结束后第1周尿液的孕酮平均水平如表3所示，交配结束后第1周，所有妊娠成功的雌性东北虎尿液中孕酮的平均水平都出现了升高，并且这种升高经过统计达到了显著（p＜0.05）或者极显著（p＜0.01）水平。
未妊娠（交配后未产仔）的雌性东北虎交配期和交配结束后第1周尿液的孕酮平均水平如表4所示，交配结束后第1周，所有未成功妊娠的雌性东北虎尿液中孕酮的平均水平都未明显升高（p＞0.05），甚至有两只个体（262号和382号）的平均孕酮水平出现了下降。
四、实验结果总结：
本方法是一种判断雌性东北虎超早期妊娠的可行方法，如果雌性东北虎交配结束后第1周的尿液孕酮平均水平显著高于交配期的尿液孕酮平均水平时，即可判断其已经成功妊娠。在此之前尚没有在老虎交配后第1周即可判断是否妊娠的客观的科学方法，此方法将为东北虎这一国家i级濒危保护动物的超早期妊娠诊断和饲养繁殖管理提供很大方便，对其它品种老虎和其他珍惜濒危动物的早期妊娠判断也具有很好的借鉴意义。