本发明涉及一种电致化学发光免疫传感器的制备与应用，具体说是一种以双电位发光材料ru@mof-5为传感平台灵敏检测pct的比率型免疫传感器，本发明属于新型功能材料、生物传感技术领域。
背景技术：
pct是一种能反映全身炎症反应活跃程度的蛋白质。影响pct水平的因素包括被感染器官的大小和类型、细菌的种类、炎症的程度和免疫反应的状况。pct在健康个体中的浓度非常低，约为0.1ng/ml，当严重细菌、真菌、寄生虫感染以及脓毒症和多脏器功能衰竭时它在血浆中的水平升高。血浆中的pct含量是鉴别诊断细菌性和非细菌性感染和炎症的有效参数。
电致化学发光(ecl)是将电化学手段与化学发光技术相结合的一种研究方法，近几年在免疫分析等方面受到的广泛地关注。ecl传感器具有高灵敏性、高选择性、高专一性和检出限低等优点，可快速准确的检测待测物的含量。
金属-有机骨架复合物(mof)是近十年来发展迅速的一种配位聚合物，具有三维的孔结构，一般以金属离子为连接点，有机配体位支撑构成空间3d延伸，系沸石和碳纳米管之外的又一类重要的新型多孔材料，在催化，传感，储能和分离中都有广泛应用。
本发明中采用的mof-5具有大的比表面积及高孔隙率，用于承载更多的ru(bpy)32+，从而增大及稳定发光信号；此外mof-5含有丰富的羧基基团，用于结合pct抗体。当共反应剂k2s2o8存在时，发光材料ru@mof-5作为传感器基底出现阴极(-1.5v)和阳极(1.5v)双电位信号；此外agncs-sem-aunps作为标记物标记于二抗，agncs-sem-aunps在-1.5v电压下发射出强电致化学发光信号，此信号与基底的阴极信号叠加使其增大，但同时使得阳极信号降低，以阴极信号/阳极信号的比值绘制工作曲线，能高效灵敏的检测pct含量。
技术实现要素：
本发明的目的之一是制备一种基于ru@mof-5双电位比率型电致化学发光传感器。
本发明的目的之二是将该传感器用于pct的高灵敏、特异性检测。
本发明的技术方案如下：
1.一种基于ru@mof-5双电位比率型电致化学发光传感器的制备方法如下：
（1）将玻碳电极用抛光粉打磨，再使用去离子水清洗，将电极置于5mmol/l铁氰化钾溶液中，并在-0.2~0.6v电位下进行扫描，使峰电位的差值小于110mv；
（2）将8μl，1~5mg/mlru@mof-5复合物溶液滴加在电极上，室温下干燥；
（3）将8μl，1~2μg/mlpct抗体滴加在电极上，室温下干燥之后，用pbs清洗，除去多余抗体，室温下干燥；
（4）将3μl，质量分数为1~2%bsa溶液滴加于电极上，用以封闭非特异性结合位点，干燥之后使用pbs洗去多余bsa，室温下干燥；
（5）将8μl，0.00005~100ng/ml一系列不同浓度的pct抗原标准溶液滴加于电极上，室温下干燥之后，用pbs清洗，除去多余抗原，室温下干燥；
（6）将8μl，2~6mg/mlagncs-sem-aunps复合物溶液滴加于电极上，室温下干燥后，用pbs清洗，除去多余二抗，室温下干燥。
2.一种基于ru@mof-5双电位比率型电致化学发光传感器的ru@mof-5材料的制备步骤如下：
(1)mof-5的制备
将1~3mmolzn(no3)2·6h2o与1~3mmol对苯二甲酸(h2bdc)溶解于200~300mmol的n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，搅拌使其溶解，后将7~9mmol三乙胺(tea)加入混合溶液中，连续搅拌2~4h，离心洗涤数次，将获得的白色沉淀放置于60˚c真空干燥箱中干燥24h，得到mof-5；
(2)ru@mof-5的制备
称取100~200mg的mof-5溶解于dmf中，加入20~40mg三(2,2'-联吡啶)二氯化钌，70˚c油浴加热12h，后通过离心洗涤收集沉淀，放置于60˚c真空干燥箱中干燥24h，得到ru@mof-5。
3.一种基于ru@mof-5双电位比率型电致化学发光传感器的agncs-sem-aunps材料的制备步骤如下：
(1)agncs的制备
将0.15~0.18g聚乙烯吡咯烷酮(pvp)用20~25ml乙二醇(eg)溶解，然后将3~5ml的agno3(1mm，溶解于eg中)，和2~5ml的fecl3(0.6mm，溶解于eg中)依次加入pvp溶液中，然后将混合物倒入50ml的高压釜中，140˚c反应1h，离心洗涤数次，放置于60˚c真空干燥箱中干燥12h，得到agncs；
(2)aunps的制备
首先将100ml质量分数为0.01~0.03%的氯金酸(haucl4)130˚c油浴加热至沸腾，然后将2~3ml质量分数为1~3%的柠檬酸钠在搅拌条件下逐滴加入到上述溶液中，溶液颜色由淡黄色变为红棕色，即为aunps，冷却至室温后避光保存以备使用；
(3)agncs-sem-aunps的制备
在搅拌下将200~300μl氨基脲(sem,10mm)溶液加入到上述合成的300~500μlauncs溶液(1mg/ml)中，搅拌12h以获得agncs-sem，用去离子水洗涤两次后，收集沉淀并分散在去离子水中，然后，将200~400μl制备的aunps溶液(1mg/ml)加入agncs-sem溶液中，搅拌12h，然后离心洗涤数次，放置于60˚c真空干燥箱中干燥12h，获得agncs-sem-aunps。
4.pct的检验，步骤如下：
（1）使用电化学工作站的三电极体系进行测试，ag/agcl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的电致化学发光免疫传感器为工作电极，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为800v，循环伏安扫描电位范围为-1.5~1.5v，扫描速率为0.1v/s；
（2）在10ml、ph6.0~8.5的含浓度为50mmol/l~100mmol/lk2s2o8的pbs缓冲溶液中通过电化学发光方法，检测对不同浓度的pct标准溶液产生的电化学发光信号强度，绘制工作曲线；
（3）将待测pct样品溶液代替pct标准溶液进行测定。
本发明的有益成果
（1）本发明采用含有羧基基团的mof-5材料与ru(bpy)32+复合，合成的发光材料ru@mof-5具有较高且稳定的发光信号，将ru@mof-5作为传感器基底材料，在共反应剂k2s2o8存在时可产生阴极(-1.5v)和阳极(1.5v)双电位信号，有效提高传感器的灵敏度；
（2）本发明采用的agncs-sem-aunps具有高效的阴极信号发射，与二抗标记后可增强ru@mof-5的阴极信号，降低阳极信号，以阴极信号/阳极信号的比值绘制工作曲线，能高效灵敏的检测pct含量，构建的超灵敏比率型电致化学发光免疫传感器，可大大提高检测的准确度和特异性；
（3）本发明构建的超灵敏比率型电致化学发光免疫传感器，应用于pct的检测，具有操作简单，检测快速，信号线性范围宽（0.00005ng/ml~100ng/ml）和检出限低（0.02pg/ml）的优点。
具体实施方式
实施例1一种基于ru@mof-5双电位比率型电致化学发光传感器的ru@mof-5材料的制备步骤如下：
(1)mof-5的制备
将1mmolzn(no3)2·6h2o与2mmol对苯二甲酸(h2bdc)溶解于200mmol的n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，搅拌使其溶解，后将7mmol三乙胺(tea)加入混合溶液中，连续搅拌3h，离心洗涤数次，将获得的白色沉淀放置于60˚c真空干燥箱中干燥24h，得到mof-5；
(2)ru@mof-5的制备
称取150mg的mof-5溶解于dmf中，加入20mg三(2,2'-联吡啶)二氯化钌，70˚c油浴加热12h，后通过离心洗涤收集沉淀，放置于60˚c真空干燥箱中干燥24h，得到ru@mof-5。
实施例2一种基于ru@mof-5双电位比率型电致化学发光传感器的ru@mof-5材料的制备步骤如下：
(1)mof-5的制备
将2mmolzn(no3)2·6h2o与1mmol对苯二甲酸(h2bdc)溶解于260mmol的n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，搅拌使其溶解，后将7.91mmol三乙胺(tea)加入混合溶液中，连续搅拌2h，离心洗涤数次，将获得的白色沉淀放置于60˚c真空干燥箱中干燥24h，得到mof-5；
(2)ru@mof-5的制备
称取100mg的mof-5溶解于dmf中，加入30mg三(2,2'-联吡啶)二氯化钌，70˚c油浴加热12h，后通过离心洗涤收集沉淀，放置于60˚c真空干燥箱中干燥24h，得到ru@mof-5。
实施例3一种基于ru@mof-5双电位比率型电致化学发光传感器的ru@mof-5材料的制备步骤如下：
(1)mof-5的制备
将3mmolzn(no3)2·6h2o与3mmol对苯二甲酸(h2bdc)溶解于300mmol的n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，搅拌使其溶解，后将9mmol三乙胺(tea)加入混合溶液中，连续搅拌4h，离心洗涤数次，将获得的白色沉淀放置于60˚c真空干燥箱中干燥24h，得到mof-5；
(2)ru@mof-5的制备
称取200mg的mof-5溶解于dmf中，加入40mg三(2,2'-联吡啶)二氯化钌，70˚c油浴加热12h，后通过离心洗涤收集沉淀，放置于60˚c真空干燥箱中干燥24h，得到ru@mof-5。
实施例4一种基于ru@mof-5双电位比率型电致化学发光传感器的agncs-sem-aunps材料的制备步骤如下：
(1)agncs的制备
将0.15g聚乙烯吡咯烷酮(pvp)用20ml乙二醇(eg)溶解，然后将4ml的agno3(1mm，溶解于eg中)，和2ml的fecl3(0.6mm，溶解于eg中)依次加入pvp溶液中，然后将混合物倒入50ml的高压釜中，140˚c反应1h，离心洗涤数次，放置于60˚c真空干燥箱中干燥12h，得到agncs；
(2)aunps的制备
首先将100ml质量分数为0.02%的氯金酸(haucl4)130˚c油浴加热至沸腾，然后将2ml质量分数为1.5%的柠檬酸钠在搅拌条件下逐滴加入到上述溶液中，溶液颜色由淡黄色变为红棕色，即为aunps，冷却至室温后避光保存以备使用；
(3)agncs-sem-aunps的制备
在搅拌下将250μl氨基脲(sem,10mm)溶液加入到上述合成的300μlauncs溶液(1mg/ml)中，搅拌12h以获得agncs-sem，用去离子水洗涤两次后，收集沉淀并分散在去离子水中，然后，将250μl制备的aunps溶液(1mg/ml)加入agncs-sem溶液中，搅拌12h，然后离心洗涤数次，放置于60˚c真空干燥箱中干燥12h，获得agncs-sem-aunps。
实施例5一种基于ru@mof-5双电位比率型电致化学发光传感器的agncs-sem-aunps材料的制备步骤如下：
(1)agncs的制备
将0.16g聚乙烯吡咯烷酮(pvp)用22ml乙二醇(eg)溶解，然后将3ml的agno3(1mm，溶解于eg中)，和2.5ml的fecl3(0.6mm，溶解于eg中)依次加入pvp溶液中，然后将混合物倒入50ml的高压釜中，140˚c反应1h，离心洗涤数次，放置于60˚c真空干燥箱中干燥12h，得到agncs；
(2)aunps的制备
首先将100ml质量分数为0.01%的氯金酸(haucl4)130˚c油浴加热至沸腾，然后将2.5ml质量分数为1%的柠檬酸钠在搅拌条件下逐滴加入到上述溶液中，溶液颜色由淡黄色变为红棕色，即为aunps，冷却至室温后避光保存以备使用；
(3)agncs-sem-aunps的制备
在搅拌下将200μl氨基脲(sem,10mm)溶液加入到上述合成的500μlauncs溶液(1mg/ml)中，搅拌12h以获得agncs-sem，用去离子水洗涤两次后，收集沉淀并分散在去离子水中，然后，将200μl制备的aunps溶液(1mg/ml)加入agncs-sem溶液中，搅拌12h，然后离心洗涤数次，放置于60˚c真空干燥箱中干燥12h，获得agncs-sem-aunps。
实施例6一种基于ru@mof-5双电位比率型电致化学发光传感器的agncs-sem-aunps材料的制备步骤如下：
(1)agncs的制备
将0.18g聚乙烯吡咯烷酮(pvp)用25ml乙二醇(eg)溶解，然后将5ml的agno3(1mm，溶解于eg中)，和5ml的fecl3(0.6mm，溶解于eg中)依次加入pvp溶液中，然后将混合物倒入50ml的高压釜中，140˚c反应1h，离心洗涤数次，放置于60˚c真空干燥箱中干燥12h，得到agncs；
(2)aunps的制备
首先将100ml质量分数为0.03%的氯金酸(haucl4)130˚c油浴加热至沸腾，然后将3ml质量分数为3%的柠檬酸钠在搅拌条件下逐滴加入到上述溶液中，溶液颜色由淡黄色变为红棕色，即为aunps，冷却至室温后避光保存以备使用；
(3)agncs-sem-aunps的制备
在搅拌下将300μl氨基脲(sem,10mm)溶液加入到上述合成的400μlauncs溶液(1mg/ml)中，搅拌12h以获得agncs-sem，用去离子水洗涤两次后，收集沉淀并分散在去离子水中，然后，将400μl制备的aunps溶液(1mg/ml)加入agncs-sem溶液中，搅拌12h，然后离心洗涤数次，放置于60˚c真空干燥箱中干燥12h，获得agncs-sem-aunps。
实施例7一种基于ru@mof-5双电位比率型电致化学发光传感器的制备方法：
（1）将玻碳电极用抛光粉打磨，再使用去离子水清洗，将电极置于5mmol/l铁氰化钾溶液中，并在-0.2~0.6v电位下进行扫描，使峰电位的差值小于110mv；
（2）将8μl，1mg/mlru@mof-5复合物溶液滴加在电极上，室温下干燥；
（3）将8μl，1.5μg/mlpct抗体滴加在电极上，室温下干燥之后，用pbs清洗，除去多余抗体，室温下干燥；
（4）将3μl，质量分数为1.5%bsa溶液滴加于电极上，用以封闭非特异性结合位点，干燥之后使用pbs洗去多余bsa，室温下干燥；
（5）将8μl，0.00005~100ng/ml一系列不同浓度的pct抗原标准溶液滴加于电极上，室温下干燥之后，用pbs清洗，除去多余抗原，室温下干燥；
（6）将8μl，2mg/mlagncs-sem-aunps复合物溶液滴加于电极上，室温下干燥后，用pbs清洗，除去多余二抗，室温下干燥。
实施例8一种基于ru@mof-5双电位比率型电致化学发光传感器的制备方法：
（1）将玻碳电极用抛光粉打磨，再使用去离子水清洗，将电极置于5mmol/l铁氰化钾溶液中，并在-0.2~0.6v电位下进行扫描，使峰电位的差值小于110mv；
（2）将8μl，2mg/mlru@mof-5复合物溶液滴加在电极上，室温下干燥；
（3）将8μl，1μg/mlpct抗体滴加在电极上，室温下干燥之后，用pbs清洗，除去多余抗体，室温下干燥；
（4）将3μl，质量分数为1%bsa溶液滴加于电极上，用以封闭非特异性结合位点，干燥之后使用pbs洗去多余bsa，室温下干燥；
（5）将8μl，0.00005~100ng/ml一系列不同浓度的pct抗原标准溶液滴加于电极上，室温下干燥之后，用pbs清洗，除去多余抗原，室温下干燥；
（6）将8μl，5mg/mlagncs-sem-aunps复合物溶液滴加于电极上，室温下干燥后，用pbs清洗，除去多余二抗，室温下干燥。
实施例9一种基于ru@mof-5双电位比率型电致化学发光传感器的制备方法：
（1）将玻碳电极用抛光粉打磨，再使用去离子水清洗，将电极置于5mmol/l铁氰化钾溶液中，并在-0.2~0.6v电位下进行扫描，使峰电位的差值小于110mv；
（2）将8μl，5mg/mlru@mof-5复合物溶液滴加在电极上，室温下干燥；
（3）将8μl，2μg/mlpct抗体滴加在电极上，室温下干燥之后，用pbs清洗，除去多余抗体，室温下干燥；
（4）将3μl，质量分数为2%bsa溶液滴加于电极上，用以封闭非特异性结合位点，干燥之后使用pbs洗去多余bsa，室温下干燥；
（5）将8μl，0.00005~100ng/ml一系列不同浓度的pct抗原标准溶液滴加于电极上，室温下干燥之后，用pbs清洗，除去多余抗原，室温下干燥；
（6）将8μl，6mg/mlagncs-sem-aunps复合物溶液滴加于电极上，室温下干燥后，用pbs清洗，除去多余二抗，室温下干燥。
实施例10pct的检验，步骤如下：
（1）使用电化学工作站的三电极体系进行测试，ag/agcl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的电致化学发光免疫传感器为工作电极，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为800v，循环伏安扫描电位范围为-1.5~1.5v，扫描速率为0.1v/s；
（2）在10ml、ph6.0~8.5的含浓度为50mmol/l~100mmol/lk2s2o8的pbs缓冲溶液中通过电化学发光方法，检测对不同浓度的pct标准溶液产生的电化学发光信号强度，绘制工作曲线；
（3）将待测pct样品溶液代替pct标准溶液进行测定；
（4）pct检测的线性范围是0.00005ng/ml~100ng/ml，检测限是0.02pg/ml。