本发明属于一种中医药产品的质量控制方法，具体是涉及到一种黄精药材的hplc指纹图谱的构建方法。
背景技术：
黄精是百合科黄精属的植物黄精(polygonatumsibiricumred.)、滇黄精(polygonatumkingianumcoll.ethemsl.)、多花黄精(polygonatumcyrtonemahua.)的干燥根茎入药。中药指纹图谱以其整体性、模糊性和宏观性等特点能准确的反映出中药及其制剂真实的质量情况。
在进行具体的hplc指纹图谱色谱条件的选择时，一般原则就是指所选的色谱条件是能让中药所含有的各种有效成分最大限度的都出现在图谱中并且分离度达标，峰形较好。
在进行流动相的选择时，要至少比较三种不同的流动相，选出能让指纹峰尽可能多的出现和较好的分离的那个流动相，比如比较甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.5％的醋酸溶液等。在选择洗脱方式时要先参考相关文献比较可能的等度洗脱方式，如果等度洗脱不行，再改用梯度洗脱，在进行梯度洗脱时要考虑所设定的梯度洗脱条件在指纹峰能都出来，并且分离度达到要求的基础上，还要考虑基线尽可能少的飘移。
黄精含有糖类、皂苷以及蒽醌类、生物碱、强心苷、黄酮、氨基酸等有效成分。目前对黄精多糖和黄精皂苷的研究相对比较多。黄精中含有的糖类物质有粘液质、淀粉及糖，其中有黄精多糖甲、乙、丙，其分子量不同(都大于20万)。但是不同产地的黄精，不同成分的含量相对有差异，显示了各产地黄精间的质量不同，为了准确的评估黄精的质量，需要对黄精的hplc指纹图谱进行改进，以达到最好的效果。
目前黄精国家标准(中国药典)中没有指纹图谱或特征图谱检测方法，仅仅检测浸出物、多糖指标，难以全面反映黄精的质量，不利于控制产品质量，不能防止伪品假冒伪劣。有文献记载研究黄精指纹图谱的构建方法，包括样品的制备，其中包括供试品溶液制备，方法为：将黄精药材放入烘箱50℃烘干至恒重，粉碎，过40目筛，精密称取此样品2g，加70％的乙醇40ml，超声30min提取，放冷，抽滤，取滤液，滤渣加70％的乙醇40ml，超声30min提取第二次，放冷，抽滤，合并两次提取液，旋干，浸膏加10ml甲醇定容，然后加10g/l的壳聚糖冰醋酸溶液100ul过夜，0.22μm滤膜滤过，取滤液作为供试品溶液。标品溶液的制备方法包括，精确称取薯蓣皂苷元适量，加甲醇溶解配制成(113.9ug/ml)的对照品溶液，0.22μm滤膜滤过。纹图谱测定的色谱条件，waters1525二元高效液相色谱仪，watersxb-c18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，watersuv-2487检测器，以a：乙腈和b：水为流动相，采用二元梯度洗脱，梯度程序为：0-10min，5％-10％a(v/v)；10-30min，10％-35％a(v/v)；30-40min，35％-60％a(v/v)；40-60min，60％-100％a(v/v)。流速1ml/min，柱温30℃，检测波长200nm，进样量20μl。上述方法稳定性重现性不够好。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种黄精药材的hplc指纹图谱的构建方法，其分离度和峰形较好。
本发明的内容包括如下方法，
1、供试品溶液的制备，取60℃干燥至恒重的细粉1g于50ml锥形瓶中，加20ml水超声提取1h；提取液经高速离心后取上清液10ml，于蒸发皿中水浴蒸干后加10ml3mol/l的盐酸使溶解，然后将蒸发皿至于95℃水浴上，使其蒸干的同时发生水解及焦糖化；待盐酸溶液完全蒸干时往蒸发皿中滴加2ml甲醇以带走残留的盐酸，重复2次；蒸干后的残渣用10ml甲醇溶解，离心后经微孔滤膜过滤，即得；
2、液相条件:美国agilent1200lc型高效液相色谱仪(配备g1311型四元泵，g1329型自动进样器，g1316a型温控箱及g4214型dad检测器)；色谱柱：agilenteclipsexdb-c18；检测波长：290nm；柱温：30℃；流动相：甲醇/h2o；洗脱条件：0-15min：5-20％甲醇，15-20min：20-20％甲醇，20-25min：20-28％甲醇，25-32min：28-28％甲醇，32-60min：28-50％甲醇，60-70min：50-95％甲醇。
本发明的有益效果是，本发明的hplc指纹图谱的构建方法，对于不同的黄精药材具有共同的峰值，精密度、重复性和稳定性良好，其与对照图谱的相似度均大于0.99，hplc指纹图谱的分离度和峰形较好。
附图说明
图1为实施例1的黄精hplc色图谱(a-b:不同批次姜形黄精、c-d:不同批次鸡头黄精、e-f:不同批次大黄精)。
图2为黄精对照特征图谱。
图3为黄精用甲醇提取的hplc色谱图。
图4为黄精用甲丙酮提取的hplc色谱图。
图5为黄精用乙醚提取的hplc色谱图。
图6为实验例2的hplc色谱图。
图7为黄精多糖在水浴条件下焦糖化后的hplc图谱。
图8为黄精多糖在边蒸干状态下焦糖化后的hplc图谱。(a：3mol/l+75℃；b：3mol/l+85℃；c：3mol/l+95℃；d：4mol/l+95℃；e：5mol/l+95℃；f：6mol/l+95℃)。
图9为31批黄精药材的hplc特征性图谱。
具体实施方式
实施例1
本发明的内容包括如下方法，
1、供试品溶液的制备，取60℃干燥至恒重的细粉1g于50ml锥形瓶中，加20ml水超声提取1h；提取液经高速离心后取上清液10ml，于蒸发皿中水浴蒸干后加10ml3mol/l的盐酸使溶解，然后将蒸发皿至于95℃水浴上，使其蒸干的同时发生水解及焦糖化；待盐酸溶液完全蒸干时往蒸发皿中滴加2ml甲醇以带走残留的盐酸，重复2次；蒸干后的残渣用10ml甲醇溶解，离心后经微孔滤膜过滤，即得；
2、液相条件:美国agilent1200lc型高效液相色谱仪(配备g1311型四元泵，g1329型自动进样器，g1316a型温控箱及g4214型dad检测器)；色谱柱：agilenteclipsexdb-c18；检测波长：290nm；柱温：30℃；流动相：甲醇/h2o；流速为每分钟1ml；进样量为10μl。理论塔板数按5-羟甲基糠醛计算应不低于6000。洗脱条件：0-15min：5-20％甲醇，15-20min：20-20％甲醇，20-25min：20-28％甲醇，25-32min：28-28％甲醇，32-60min：28-50％甲醇，60-70min：50-95％甲醇。
测定法，精密供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。供试品特征图谱中应呈现9个特征峰，并应与对照药材参照物色谱峰中的9个特征峰相对应，其中峰1应与对照品参照物峰保留时间一致。不同批次样品的色谱图如图1所示。黄精对照特征图谱见图2。
实验例1
hplc特征性图谱
对黄精的甲醇、丙酮、乙醚等溶剂的提取液进行了高效液相分析，样品制备方法为取60℃干燥至恒重的黄精样品粉末2g，加提取溶剂20ml(提取溶剂分别为甲醇，丙酮和乙醚)，超声提取30min，取甲醇提取上清液高速离心后过微孔滤膜，进样分析，取丙酮和乙醚提取上清液液离心后取12ml，用旋转蒸发仪旋干后用1ml甲醇溶解，高速离心后取上清液过微孔滤膜，再进样分析。检测波长：210nm；柱温：30℃；流动相：acn/0.05％h3po4-h2o；洗脱条件：0-45min：20-90％acn，45-50min：90-95％acn，55-65min：95％acn；进样量：10μl，其hplc色谱图如图3-5所示。从图3-5可以看出，不同批次以及不同品种之间的黄精样品之间共同峰很少且吸收很弱，初步确定黄精的提取液不适用于hplc指纹图谱研究。
实验例2
对黄精多糖进行水解，然后对其水解后的单糖衍生化进行液相分析，具体方法如下。
黄精多糖制备：取黄精样品1g于50ml锥形瓶中，加水20ml，超声提取45min，离心取上清液，加入80ml无水乙醇，于4℃冰箱中静置12h，离心，沉淀用10ml水溶解，离心取上清液，用旋转蒸发仪旋干，即得黄精多糖。
多糖水解：取上述制备的多糖，用2ml水溶解于具塞试管中，加2mol/l的三氟乙酸(tfa)溶液4ml，密塞，于烘箱中105℃水解6h，取出后用旋转蒸发仪旋干，沉淀用meoh(3ml)洗涤并旋干，重复3次，带走多余的tfa。最终，沉淀用2ml水溶解，离心，取上清液即为多糖水解液。
衍生化：取上述水解液于10ml具塞试管中，加入1ml浓度为0.3mol/l的氢氧化钠溶液和1.2ml浓度为0.5mol/l的1-苯基-3-甲基-吡唑啉酮(pmp)溶液，混匀后密塞。置于70℃水浴中反应1h，取出，冷却至室温，加入1ml盐酸溶液(0.3mol/l)中和氢氧化钠。用氯仿萃取三次(5ml×3)，取水层，离心后取上清液，即得。
液相条件：检测波长：250nm；柱温：30℃；流动相：以acn/磷酸盐缓冲溶液(ph＝6.8)；洗脱条件：0-25min：15-30％acn，25-35min：30-90％acn；进样量：10μl。
进样分析后发现(如图6所述)，除残留的pmp峰外，仅在其右侧看到3个单糖衍生后的峰，该方法操作复杂，最终得到的色谱谱依然很少，故该方法依然难以作为黄精的指纹图谱或特征图谱来对黄精进行质量控制。
实验例3
对本发明的方法参数进行考察，发现影响水解及焦糖化的关键因素在于加入盐酸加热的过程，因此加热的时间、温度以及酸的浓度都会对实验结果产生较大影响，我们对如下几种方法进行了考察：
①取三份60℃干燥至恒重的细粉1g于50ml锥形瓶中，分别加20ml水超声提取1h。提取液经高速离心后，取上清液5ml于具塞试管中，加入5ml3mol/l的盐酸于75℃，85℃和95℃水浴中反应30min后取出，分别滴加5ml3mol/l的naoh中和盐酸，然后取上清液高速离心过微孔滤膜后进样分析。结果发现三种温度反应条件下产物单一，主要只生成5-羟甲基糠醛。改变盐酸浓度为4、5及6mol/l以及缩短和延长反应时间后结果都并无改善，其色谱图如图7所示。
②由于上述恒温水浴焦糖化反应生成的产物峰较少，我们尝试控制温度，直接在蒸发皿中边反应边蒸干的方法进行焦糖化后再进行分析。其具体操作方法为：取60℃干燥至恒重的细粉1g于50ml锥形瓶中，加20ml水超声提取1h。提取液经高速离心后取上清液10ml，于蒸发皿中水浴蒸干后加10ml盐酸使溶解，然后将蒸发皿至于水浴上，使其蒸干的同时发生水解及焦糖化。待盐酸溶液完全蒸干时往蒸发皿中滴加2ml甲醇以带走残留的盐酸，重复2次。蒸干后的残渣用10ml甲醇溶解，离心后经微孔滤膜过滤后进样分析。我们对盐酸的浓度及水浴的温度进行了考察，从图8(a、b和c)中可以看出，当水浴温度为95℃时，生成的液相色谱峰较多。而从图8(d、e和f)中可以看出，盐酸浓度为4mol/l或5mol/l时，色谱峰变化不大，而当浓度升高到6mol/l时，由于酸强度太大，反应过于剧烈，焦糖化产物峰过多且吸收较弱。由此可以得出结论，盐酸浓度为3mol/l，水浴温度为95℃时，其hplc色谱图最佳，更跟适合用于质量控制。
实验例4
(3)方法学考察
精密度试验：按实施例1的方法制备a1样品一份，在上述色谱条件下连续进样六次分析，记录保留时间和峰面积。测得9个共有峰的保留时间rsd依次为0.86％、0.55％、0.32％、0.13％、0.14％、0.03％、0.04％、0.06％、0.05％，峰面积rsd分别为3.13％、3.29％、3.05％、0.75％、0.91％、0.81％、1.25％、0.75％、0.65％，精密度良好。
重复性试验：平行制备a1样品6份，在上述液相色谱条件下分析测定。测得9个共有峰的保留时间rsd依次为0.33％、0.23％、0.26％、0.21％、0.24％、0.14％、0.15％、0.15％、0.14％，峰面积rsd分别为3.38％、3.57％、3.24％、0.65％、1.08％、1.26％、0.61％、2.85％、2.31％，说明重复性良好。
稳定性试验：制备a1供试品溶液一份，分别于0h，2h，4h，8h，12h，24h进样测定，测得9个共有峰的保留时间rsd依次为0.20％、0.14％、0.12％、0.08％、0.10％、0.04％、0.06％、0.29％、0.08％，峰面积rsd分别为0.91％、1.00％、0.62％、0.68％、0.21％、0.87％、0.69％、0.75％、0.65％，稳定性良好。
指纹图谱的建立
将所收集到的31批黄精药材及14批黄精饮片按上述样品制备项下的方法进行制备后，按上述液相条件进样分析得到其色谱图。将色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件，分别以a1和x1为参照图谱，时间窗为0.1，对色谱峰进行自动匹配后分别建立其特征性图谱(图9)。其与对照图谱的相似度均大于0.99。