一种动物性食品中207种兽药及添加物的筛查与确证方法与流程

本发明属于动物性食品检测技术领域，具体涉及一种动物性食品中207种兽药及添加物的筛查与确证方法。

背景技术：

兽药是指用于预防、治疗、诊断动物疾病或者有目的地调节动物生理机能的物质，一般可以分为抗生素类、驱肠虫类、生长促进类、抗原虫药类、灭锥虫类、镇静剂类和β-肾上腺素受体阻断剂类兽药。

近年来，我国的畜牧业发展迅速，这与兽药的发展和合理使用是分不开的。兽药在降低畜禽的发病率与死亡率、促进动物生长、改善动物产品品质和提高饲料利用率方面起到了重要的作用。但是目前滥用兽药情况比较普遍，其用量远远超过了动物治疗疾病的需要量，造成动物性食品中药物残留。兽药残留的毒性作用大多是通过长期积累而造成的，比如林可胺类药物残留可引起肾功能障碍和革兰氏阳性菌的耐药性增加；大环内酯类药物残留可引起过敏反应和导致携带耐药因子的菌株扩散，氯霉素可引起贫血灰婴综合征、白血病等。因此，欧盟和我国制定了相关药物的残留标志物以及在不同的动物性食品中的最大残留限量，并规定了畜牧业禁止使用的兽药种类，但兽药乱添滥用情况依然存在。

我国农业部235公告明确规定了动物组织中各药物的最大残留限量，但在兽药监督检查或养殖场中时而能够看到不合理使用兽药，违法使用兽药的现象依然存在。除了兽药，2017年发生的“氟虫腈”毒鸡蛋事件使动物性食品中农药残留引起了广泛的关注。动物性食品中的农药、兽药的残留一方面直接或间接地危害了人类的身体健康，另一方面破坏了生态环境。因此，从保障畜产品质量安全的角度出发，对动物性食品中兽药及添加物的全面监控势在必行。

随着检测技术的发展，农药兽药残留检测从单一类别向多类别发展，前处理技术和仪器分析技术也趋向多元化。欧美等发达国家在此方面起步比国内早，发展更为快速。美国食品和药物管理局利用液相色谱串联飞行时间质谱建立了牛奶中150多种兽药，50％药物的检出限为10ng/ml或者更低。美国农业部利用高效液相色谱串联四极杆质谱建立了牛肾中11类共120种兽药的检测方法，药物的检出限为1ng/g～100ng/g，方法的回收率为29％～192％。

目前，我国现有的多残留检测方法主要有液相色谱-串联四级杆和液相色谱-高分辨质谱检测方法，其中传统液相色谱-串联四极杆有着灵敏度高，定量准确的特点，但是存在分辨率低，容易造成假阳性，检测药物数量有限，建立仪器方法复杂等缺点。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明提供一种动物性食品207种兽药及添加物的筛查与确证方法。

本发明的目的是以下述方式实现的：

一种动物性食品中207种兽药及添加物的筛查与确证方法，具体包括以下步骤：

所述207种兽药及添加物为：

(a)磺胺类：磺胺二甲嘧啶、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺异噁唑、磺胺脒、磺胺甲嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺甲恶唑、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲唑、磺胺吡啶、磺胺喹恶啉、磺胺噻唑、磺胺二甲异嘧啶、甲氧苄啶、二甲氧苄啶、酞磺胺噻唑、苯酰磺胺、乙酰磺胺、磺胺氯哒嗪、磺胺氯吡嗪、磺胺嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶；

(b)氟喹诺酮类：洛美沙星、马波沙星、那氟沙星、萘啶酸、诺氟沙星、氧氟沙星、奥比沙星、恶喹酸、吡哌酸、培氟沙星、西诺沙星、沙拉沙星、司帕沙星、环丙沙星、达氟沙星、二氟沙星、依诺沙星、恩诺沙星、氟罗沙星、氟甲喹、加替沙星；

(c)苯并咪唑类：甲苯达唑、氨基甲苯哒唑、2-氨基氟苯咪唑、奥芬达唑、奥苯达唑、帕苯咪唑、5-羟基噻苯达唑、噻苯达唑、阿苯达唑、阿苯达唑砜、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑氨基砜、苯并咪唑、非班太尔、洛苯达唑；

(d)兴奋剂类：赛庚啶、非诺特罗、拉贝特罗、喷布特罗、苯乙醇胺a、莱克多巴胺、沙丁胺醇、沙美特罗、特布他林、马布特罗、妥布特罗、班布特罗、溴布特罗、西马特罗、西布特罗、克伦特罗、克伦丙罗、可乐定；

(e)激素类：醋酸氯地孕酮、17a-甲基睾丸酮、氯倍他索丙酸酯、氯倍他松丁酸酯、皮质酮、氢化可的松、醋酸可的松、可的松、地夫可特、地塞米松、二氟拉松双醋酸酯、表睾酮、苯甲酸雌二醇、醋酸氟氢可的松、特戊酸氟米松、双氟美松、氟轻松、氟米龙、氟氢缩松、氟替卡松丙酸酯、丙酸诺龙、哈西奈德、己烷雌酚、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸美伦孕酮、美雄酮、甲基泼尼松龙、炔诺酮、丙酸诺龙、炔诺孕酮、泼尼卡酯、泼尼松龙、泼尼松、黄体酮、去氢睾酮、睾丸酮、群勃龙、曲安奈德、倍氯米松、倍他米松双丙酸酯、倍他米松戊酸酯、倍他米松；

(f)硝基咪唑类:地美硝唑、异丙硝唑、甲硝唑、奥硝唑、羟基地美硝唑、罗硝唑、塞克硝唑、替硝唑；

(g)抗病毒类：金刚烷胺、金刚乙胺；

(h)林可胺类：克林霉素、林可霉素；

(i)酰胺醇类：氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素；

(j)青霉素类：头孢噻呋、氟氯西林、氯唑西林、萘夫西林、哌拉西林、青霉素g；

(k)喹噁啉类：喹烯酮；

(l)解热镇痛类：非那西丁、水杨酸、氨基比林、安替比林、氨苯砜、氟尼辛葡甲胺、对乙酰氨基酚；

(m)精神类：氟哌啶醇、丙咪嗪、硝西泮、奥沙西泮、匹莫林、奋乃静、异丙嗪、盐酸丙酰丙嗪、舒必利、甲苯噻嗪、乙酰丙嗪、阿扎哌醇、阿扎哌隆、卡马西平、氯丙嗪、地西泮、苯海拉明、氟哌利多、艾司唑仑、克拉霉素、泰妙菌素、红霉素、吉他霉素、替米考星、泰乐菌素；

(n)驱虫类：托曲珠利亚砜、氯羟吡啶、二硝托胺、常山酮、左旋咪唑；

(o)农药类：噻嗪酮、萎锈灵、3-羟基呋喃丹、噻虫胺、环丙氨嗪、敌草隆、乙氧酰胺苯甲酯、氟虫睛、氟啶草酮、乙酰甲胺磷、环嗪酮、抑霉唑、吡虫啉、利谷隆、嗪草酮、腈菌唑、啶虫脒、氟草敏、炔苯酰草胺、莠去津、西玛津、去乙基锈去津、嘧菌酯、解草嗪；

(p)其它类：东莨菪碱、沃尼妙林、阿托品；

(1)标准工作溶液的配制：

a)标准储备液的配制：取各标准对照品10mg，精密称定，于10ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度为1mg/ml的标准储备液；其中，诺氟沙星用水溶解，农药类均用丙酮溶解，二甲氧苄啶、阿苯达唑、阿苯达唑砜、非班太尔均用甲酸溶解，然后再用甲醇定容至刻度，对于其他难溶物质，利用甲醇与氨水的混合溶剂或甲醇与二甲基亚砜的混合溶剂进行溶解后，再用甲醇定容至刻度；

b)标准工作液的配制：①准确移取标准储备液各100μl于10ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，按药物类别分组如表1所示，配制成16个浓度为10μg/ml的混合标准中间液ⅰ，分别准确移取混合标准中间液ⅰ各100μl，用甲醇定容至10ml，配制成浓度为100ng/ml的混合标准中间溶液ⅱ；②准确移取混合标准中间液ⅱ100μl、500μl、1ml、5ml，分别用20％甲醇水溶液定容至10ml，配制成浓度为1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml的混合标准工作溶液；

(2)待测样品的前处理：

a)提取：对于试样为肌肉或禽蛋：称取试样5g于50ml离心管中，加入提取液，涡旋混匀后，振荡、离心，转移上清液于另一50ml离心管中，残渣用提取液重复提取，合并两次提取的上清液，上清液加入6g无水硫酸钠和1.5g氯化钠，涡旋30s，静置后离心，得到二次上清液备用；

对于试样为牛奶或羊奶：称取试样5g于50ml离心管中，加入提取液，涡旋混匀后，振荡、离心，转移上清液于另一50ml离心管中，上清液加入4g无水硫酸钠和1g氯化钠，涡旋30s，静置后离心，得到二次上清液备用；

b)净化：固相萃取柱依次用4ml甲醇和4ml水活化平衡后，先取2ml二次上清液润洗固相萃取柱，弃去流出液，再移取5ml二次上清液通过固相萃取柱，用离心管收集流出液；准确移取流出液4ml，40℃下氮吹干，加入200μl甲醇后涡旋混匀10s，再加入800μl纯水涡旋混匀30s，过0.22μm尼龙滤膜，备用；

(3)高分辨质谱数据库的建立：

将207种兽药及添加物按类别将药物分成16组，分组情况如表1所示，每组混合标准液浓度为1μg/ml，用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱仪对混合标准液进行正负模式下的全扫描和二级扫描，通过q-exactiveplus自带tracefinder工作软件分析得到各化合物的保留时间、母离子精确分子量、加合方式、二级碎片离子和同位素丰度比、三个碰撞能量分别为20ev、40ev和60ev下叠加的二级谱图，完成质谱数据库的构建，如表1所示。其中同分异构体通过进单标进行确认。以1μg/ml的恩诺沙星为例，恩诺沙星一级离子提取色谱图、一级、二级质谱图分别如附图1、2、3所示。

表1化合物质谱库信息

(4)化合物检测：

用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱仪对前处理后的样品进行检测，得到样品检测原始数据；

(5)化合物筛查：

将提取质量窗口设为5ppm，使用tracefinder工作软件对样品检测原始数据在5ppm质量窗口范围内进行自动提取，当化合物同时满足以下条件时得到该样品中测得的疑似阳性化合物：

①目标物信号响应s/n>3；

②目标物保留时间与质谱数据库中的保留时间参数偏差≤0.2min或者±2.5％以内(不超过0.5min)；

③目标物和高分辨质谱数据库相比，匹配上一级母离子和一个二级碎片离子，且一级母离子质量精度偏差<5ppm，二级碎片离子质量精度偏差<10ppm；

(6)化合物确证：

对于样品中的疑似阳性化合物，需将其二级碎片谱图与标准溶液中该化合物的二级碎片谱图进行比较，若两张谱图中主要碎片离子的准确分子量精度偏差小于10ppm且相对离子丰度一致，则判定该化合物在该样品中为阳性。

所述步骤(2)的a)中，对于试样为肌肉或禽蛋，其提取液为3.0mlmcllvaine-na2edta缓冲溶液和10ml乙腈的混合溶液，mcllvaine-na2edta缓冲溶液中edta的浓度为0.1mol/l；对于试样为牛奶或羊奶，其提取液为20ml乙腈。

所述步骤(2)的b)中，净化所用固相萃取柱为hypersepretainpep小柱；

所述步骤(3)、(4)中，液相色谱的条件为：色谱柱：c18(150mm×3.0mm，粒径1.8μm)，亦可用相当型号色谱柱；柱温：30℃；进样量：10μl；流速：0.3ml/min；流动相：a：正离子模式，含0.1％甲酸的水溶液，负离子模式，含0.03％氨水的水溶液；流动相b：正离子模式，含0.1％甲酸的乙腈溶液，负离子模式，含0.03％氨水的乙腈溶液，正离子模式梯度洗脱程序见表2，负离子模式梯度洗脱程序见表3。

表2正离子模式流动相梯度洗脱程序

表3负离子模式流动相梯度洗脱程序

所述步骤(3)、(4)中，质谱的条件为：

离子源：电喷雾离子源(esi+和esi-)；

扫描方式：全扫描加自动触发二级扫描模式；

毛细管电压：3.2kv(esi+)、2.8kv(esi-)；

离子传输管温度：325℃；

雾化气温度：350℃；

鞘气压：40arb；

辅助气压：40arb；

一级质谱驻留时间：100ms；

二级质谱驻留时间：60ms；

扫描质量范围：50～1000m/z；

碰撞能量：20、40、60ev。

所述步骤(2)的a)或b)中，振荡、离心的条件均为：振荡频率为6000rpm，振荡的时间为10min，离心的转速为4000～7000r/min，离心时间为5min。

相对于现有技术，本发明使用了液相色谱-串联高分辨质谱技术，其优点在于：

1.能够采集高质量准确度的数据，降低了假阳性率；

2.对待测物直接进行全扫描，单位时间扫描的化合物没有数量限制，仪器方法建立方便快捷；

3.通过二级扫描，得到二级碎片离子，建立质谱数据库，样品数据通过和质谱数据库的比对，可以实现方便快速的筛查，特别适合多类化合物的筛查和确证；

4.为动物性食品中添加多种兽药及添加剂提供了一种完整的检测方法，填充了国家动物性食品的检测方法，增添了动物性食品中多残留的检测筛查技术手段，为国家畜牧行业及食品安全提供了安全保障。

附图说明

图1是恩诺沙星一级离子提取色谱图。

图2是恩诺沙星一级质谱图。

图3是恩诺沙星二级质谱图。

图4是磺胺二甲嘧啶一级母离子色谱图。

图5是磺胺邻二甲氧嘧啶一级母离子色谱图。

图6是磺胺异噁唑一级母离子色谱图。

图7是磺胺脒一级母离子色谱图。

图8是磺胺甲嘧啶一级母离子色谱图。

图9是磺胺甲噻二唑一级母离子色谱图。

图10是磺胺甲恶唑一级母离子色谱图。

图11是磺胺对甲氧嘧啶一级母离子色谱图。

图12是磺胺甲氧哒嗪一级母离子色谱图。

图13是磺胺间甲氧嘧啶一级母离子色谱图。

图14是磺胺二甲唑一级母离子色谱图。

图15是磺胺吡啶一级母离子色谱图。

图16是磺胺喹恶啉一级母离子色谱图。

图17是磺胺噻唑一级母离子色谱图。

图18是磺胺二甲异嘧啶一级母离子色谱图。

图19是甲氧苄啶一级母离子色谱图。

图20是二甲氧苄啶/敌菌净一级母离子色谱图。

图21是酞磺胺噻唑一级母离子色谱图。

图22是苯酰磺胺一级母离子色谱图。

图23是磺胺醋酰/乙酰磺胺一级母离子色谱图。

图24是磺胺氯哒嗪一级母离子色谱图。

图25是磺胺氯吡嗪一级母离子色谱图。

图26是磺胺嘧啶一级母离子色谱图。

图27是磺胺间二甲氧嘧啶一级母离子色谱图。

图28是洛美沙星一级母离子色谱图。

图29是麻保沙星/马波沙星一级母离子色谱图。

图30是那氟沙星一级母离子色谱图。

图31是萘啶酸一级母离子色谱图。

图32是诺氟沙星一级母离子色谱图。

图33是氧氟沙星一级母离子色谱图。

图34是奥比沙星一级母离子色谱图。

图35是恶喹酸一级母离子色谱图。

图36是培氟沙星一级母离子色谱图。

图37是吡哌酸一级母离子色谱图。

图38是西诺沙星一级母离子色谱图。

图39是沙拉沙星一级母离子色谱图。

图40是司帕沙星一级母离子色谱图。

图41是环丙沙星一级母离子色谱图。

图42是达氟沙星一级母离子色谱图。

图43是二氟沙星一级母离子色谱图。

图44是依诺沙星一级母离子色谱图。

图45是恩诺沙星一级母离子色谱图。

图46是氟罗沙星一级母离子色谱图。

图47是氟甲喹一级母离子色谱图。

图48是加替沙星一级母离子色谱图。

图49是甲苯咪唑/甲苯达唑一级母离子色谱图。

图50是氨基甲苯哒唑一级母离子色谱图。

图51是2-氨基氟苯咪唑一级母离子色谱图。

图52是奥芬达唑一级母离子色谱图。

图53是奥苯达唑一级母离子色谱图。

图54是丁苯咪唑/帕苯咪唑一级母离子色谱图。

图55是5-羟基噻苯达唑一级母离子色谱图。

图56是噻苯达唑一级母离子色谱图。

图57是阿苯达唑一级母离子色谱图。

图58是阿苯达唑砜一级母离子色谱图。

图59是阿苯达唑亚砜一级母离子色谱图。

图60是阿苯达唑氨基砜一级母离子色谱图。

图61是苯并咪唑一级母离子色谱图。

图62是非班太尔一级母离子色谱图。

图63是拉苯咪唑/洛苯达唑一级母离子色谱图。

图64是喷布特罗一级母离子色谱图。

图65是苯乙醇胺a一级母离子色谱图。

图66是莱克多巴胺一级母离子色谱图。

图67是沙丁胺醇一级母离子色谱图。

图68是沙美特罗一级母离子色谱图。

图69是特布他林一级母离子色谱图。

图70是马布特罗一级母离子色谱图。

图71是妥布特罗一级母离子色谱图。

图72是班布特罗一级母离子色谱图。

图73是溴布特罗一级母离子色谱图。

图74是西马特罗一级母离子色谱图。

图75是西布特罗一级母离子色谱图。

图76是克伦特罗一级母离子色谱图。

图77是克伦丙罗一级母离子色谱图。

图78是盐酸可乐定一级母离子色谱图。

图79是盐酸赛庚啶一级母离子色谱图。

图80是非诺特罗一级母离子色谱图。

图81是拉贝洛尔/拉贝特罗一级母离子色谱图。

图82是倍他米松双丙酸酯一级母离子色谱图。

图83是倍他米松戊酸酯一级母离子色谱图。

图84是醋酸氯地孕酮一级母离子色谱图。

图85是17a-甲基睾丸酮一级母离子色谱图。

图86是氯倍他索丙酸酯一级母离子色谱图。

图87是氯倍他松丁酸酯一级母离子色谱图。

图88是皮质酮一级母离子色谱图。

图89是氢化可的松一级母离子色谱图。

图90是醋酸可的松一级母离子色谱图。

图91是可的松一级母离子色谱图。

图92是地夫可特一级母离子色谱图。

图93是地塞米松一级母离子色谱图。

图94是二氟拉松双醋酸酯一级母离子色谱图。

图95是表睾酮一级母离子色谱图。

图96是苯甲酸雌二醇一级母离子色谱图。

图97是醋酸氟氢可的松一级母离子色谱图。

图98是特戊酸氟米松一级母离子色谱图。

图99是氟米松/双氟美松一级母离子色谱图。

图100是氟轻松一级母离子色谱图。

图101是氟米龙一级母离子色谱图。

图102是氟氢缩松一级母离子色谱图。

图103是氟替卡松丙酸酯一级母离子色谱图。

图104是丙酸诺龙一级母离子色谱图。

图105是哈西奈德一级母离子色谱图。

图106是己烷雌酚一级母离子色谱图。

图107是醋酸甲羟孕酮一级母离子色谱图。

图108是醋酸甲地孕酮一级母离子色谱图。

图109是醋酸美伦孕酮一级母离子色谱图。

图110是美雄酮一级母离子色谱图。

图111是甲基泼尼松龙一级母离子色谱图。

图112是炔诺酮一级母离子色谱图。

图113是诺龙(19-去甲睾酮)一级母离子色谱图。

图114是炔诺孕酮一级母离子色谱图。

图115是泼尼卡酯一级母离子色谱图。

图116是泼尼松龙一级母离子色谱图。

图117是泼尼松一级母离子色谱图。

图118是黄体酮一级母离子色谱图。

图119是去氢睾酮一级母离子色谱图。

图120是睾丸酮一级母离子色谱图。

图121是群勃龙一级母离子色谱图。

图122是曲安奈德一级母离子色谱图。

图123是倍氯米松一级母离子色谱图。

图124是倍他米松一级母离子色谱图。

图125是地美硝唑一级母离子色谱图。

图126是异丙硝唑一级母离子色谱图。

图127是甲硝唑一级母离子色谱图。

图128是奥硝唑一级母离子色谱图。

图129是羟基地美硝唑一级母离子色谱图。

图130是罗硝唑一级母离子色谱图。

图131是塞克硝唑一级母离子色谱图。

图132是替硝唑一级母离子色谱图。

图133是金刚烷胺一级母离子色谱图。

图134是金刚乙胺一级母离子色谱图。

图135是克林霉素一级母离子色谱图。

图136是林可霉素一级母离子色谱图。

图137是氯霉素一级母离子色谱图。

图138是氟苯尼考一级母离子色谱图。

图139是甲砜霉素一级母离子色谱图。

图140是头孢噻呋一级母离子色谱图。

图141是氟氯西林一级母离子色谱图。

图142是氯唑西林一级母离子色谱图。

图143是萘夫西林一级母离子色谱图。

图144是哌拉西林一级母离子色谱图。

图145是青霉素g一级母离子色谱图。

图146是喹烯酮一级母离子色谱图。

图147是非那西丁一级母离子色谱图。

图148是水杨酸一级母离子色谱图。

图149是氨基比林一级母离子色谱图。

图150是安替比林一级母离子色谱图。

图151是氨苯砜一级母离子色谱图。

图152是氟尼辛葡甲胺一级母离子色谱图。

图153是对乙酰氨基酚一级母离子色谱图。

图154是奥沙西泮一级母离子色谱图。

图155是匹莫林一级母离子色谱图。

图156是奋乃静一级母离子色谱图。

图157是异丙嗪一级母离子色谱图。

图158是丙酰丙嗪一级母离子色谱图。

图159是舒必利一级母离子色谱图。

图160是甲苯噻嗪一级母离子色谱图。

图161是乙酰丙嗪一级母离子色谱图。

图162是阿扎哌醇一级母离子色谱图。

图163是阿扎哌隆一级母离子色谱图。

图164是卡马西平一级母离子色谱图。

图165是氯丙嗪一级母离子色谱图。

图166是地西泮一级母离子色谱图。

图167是苯海拉明一级母离子色谱图。

图168是氟哌利多一级母离子色谱图。

图169是氟哌啶醇一级母离子色谱图。

图170是丙咪嗪一级母离子色谱图。

图171是硝西泮一级母离子色谱图。

图172是艾司唑仑一级母离子色谱图。

图173是克拉霉素一级母离子色谱图。

图174是泰妙菌素一级母离子色谱图。

图175是红霉素一级母离子色谱图。

图176是吉他霉素一级母离子色谱图。

图177是替米考星一级母离子色谱图。

图178是泰乐菌素一级母离子色谱图。

图179是托曲珠利亚砜一级母离子色谱图。

图180是氯羟吡啶一级母离子色谱图。

图181是二硝托胺一级母离子色谱图。

图182是常山酮一级母离子色谱图。

图183是左旋咪唑一级母离子色谱图。

图184是萎锈灵一级母离子色谱图。

图185是3-羟基呋喃丹一级母离子色谱图。

图186是噻虫胺一级母离子色谱图。

图187是环丙氨嗪一级母离子色谱图。

图188是敌草隆一级母离子色谱图。

图189是乙氧酰胺苯甲酯一级母离子色谱图。

图190是氟虫腈一级母离子色谱图。

图191是氟啶草酮一级母离子色谱图。

图192是乙酰甲胺磷一级母离子色谱图。

图193是环嗪酮一级母离子色谱图。

图194是抑霉唑一级母离子色谱图。

图195是吡虫啉一级母离子色谱图。

图196是利谷隆一级母离子色谱图。

图197是嗪草酮一级母离子色谱图。

图198是腈菌唑一级母离子色谱图。

图199是啶虫脒一级母离子色谱图。

图200是氟草敏一级母离子色谱图。

图201是炔苯酰草胺一级母离子色谱图。

图202是莠去津一级母离子色谱图。

图203是西玛津一级母离子色谱图。

图204是去乙基锈去津一级母离子色谱图。

图205是嘧菌酯一级母离子色谱图。

图206是解草嗪一级母离子色谱图。

图207是噻嗪酮一级母离子色谱图。

图208是东莨菪碱一级母离子色谱图。

图209是沃尼妙林一级母离子色谱图。

图210是阿托品一级母离子色谱图。

具体实施方式

一种动物性食品中207种兽药及添加物的筛查与确证方法，具体步骤如下：

所述207种兽药及添加物为：

(a)磺胺类：磺胺二甲嘧啶、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺异噁唑、磺胺脒、磺胺甲嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺甲恶唑、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲唑、磺胺吡啶、磺胺喹恶啉、磺胺噻唑、磺胺二甲异嘧啶、甲氧苄啶、二甲氧苄啶、酞磺胺噻唑、苯酰磺胺、乙酰磺胺、磺胺氯哒嗪、磺胺氯吡嗪、磺胺嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶；

(b)氟喹诺酮类：洛美沙星、马波沙星、那氟沙星、萘啶酸、诺氟沙星、氧氟沙星、奥比沙星、恶喹酸、吡哌酸、培氟沙星、西诺沙星、沙拉沙星、司帕沙星、环丙沙星、达氟沙星、二氟沙星、依诺沙星、恩诺沙星、氟罗沙星、氟甲喹、加替沙星；

(c)苯并咪唑类：甲苯达唑、氨基甲苯哒唑、2-氨基氟苯咪唑、奥芬达唑、奥苯达唑、帕苯咪唑、5-羟基噻苯达唑、噻苯达唑、阿苯达唑、阿苯达唑砜、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑氨基砜、苯并咪唑、非班太尔、洛苯达唑；

(d)兴奋剂类：赛庚啶、非诺特罗、拉贝特罗、喷布特罗、苯乙醇胺a、莱克多巴胺、沙丁胺醇、沙美特罗、特布他林、马布特罗、妥布特罗、班布特罗、溴布特罗、西马特罗、西布特罗、克伦特罗、克伦丙罗、可乐定；

(e)激素类：醋酸氯地孕酮、17a-甲基睾丸酮、氯倍他索丙酸酯、氯倍他松丁酸酯、皮质酮、氢化可的松、醋酸可的松、可的松、地夫可特、地塞米松、二氟拉松双醋酸酯、表睾酮、苯甲酸雌二醇、醋酸氟氢可的松、特戊酸氟米松、双氟美松、氟轻松、氟米龙、氟氢缩松、氟替卡松丙酸酯、丙酸诺龙、哈西奈德、己烷雌酚、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸美伦孕酮、美雄酮、甲基泼尼松龙、炔诺酮、丙酸诺龙、炔诺孕酮、泼尼卡酯、泼尼松龙、泼尼松、黄体酮、去氢睾酮、睾丸酮、群勃龙、曲安奈德、倍氯米松、倍他米松双丙酸酯、倍他米松戊酸酯、倍他米松；

(f)硝基咪唑类:地美硝唑、异丙硝唑、甲硝唑、奥硝唑、羟基地美硝唑、罗硝唑、塞克硝唑、替硝唑；

(g)抗病毒类：金刚烷胺、金刚乙胺；

(h)林可胺类：克林霉素、林可霉素；

(i)酰胺醇类：氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素；

(j)青霉素类：头孢噻呋、氟氯西林、氯唑西林、萘夫西林、哌拉西林、青霉素g；

(k)喹噁啉类：喹烯酮；

(l)解热镇痛类：非那西丁、水杨酸、氨基比林、安替比林、氨苯砜、氟尼辛葡甲胺、对乙酰氨基酚；

(m)精神类：氟哌啶醇、丙咪嗪、硝西泮、奥沙西泮、匹莫林、奋乃静、异丙嗪、盐酸丙酰丙嗪、舒必利、甲苯噻嗪、乙酰丙嗪、阿扎哌醇、阿扎哌隆、卡马西平、氯丙嗪、地西泮、苯海拉明、氟哌利多、艾司唑仑、克拉霉素、泰妙菌素、红霉素、吉他霉素、替米考星、泰乐菌素；

(n)驱虫类：托曲珠利亚砜、氯羟吡啶、二硝托胺、常山酮、左旋咪唑；

(o)农药类：噻嗪酮、萎锈灵、3-羟基呋喃丹、噻虫胺、环丙氨嗪、敌草隆、乙氧酰胺苯甲酯、氟虫睛、氟啶草酮、乙酰甲胺磷、环嗪酮、抑霉唑、吡虫啉、利谷隆、嗪草酮、腈菌唑、啶虫脒、氟草敏、炔苯酰草胺、莠去津、西玛津、去乙基锈去津、嘧菌酯、解草嗪；

(p)其它类：东莨菪碱、沃尼妙林、阿托品；

1标准工作溶液的配制：

1.1标准储备液的配制：

取各标准对照品10mg，精密称定，于10ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度为1mg/ml的标准储备液；其中，诺氟沙星用水溶解，农药类均用丙酮溶解，二甲氧苄啶、阿苯达唑、阿苯达唑砜、非班太尔均用甲酸溶解，然后再用甲醇定容至刻度，对于其他难溶物质，利用甲醇与氨水的混合溶剂或甲醇与二甲基亚砜的混合溶剂进行溶解后，再用甲醇定容至刻度；其中，对于其他难溶物质，以甲醇为主溶剂、二甲基亚砜为辅溶剂，其加入量以能使难溶物质完全溶解为准。

1.2标准工作液的配制：

①准确移取标准储备液各100μl于10ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，按药物类别分组如图1所示，配制成16个浓度为10μg/ml的混合标准中间液ⅰ，分别准确移取混合标准中间液ⅰ各100μl，用甲醇定容至10ml，配制成浓度为100ng/ml的混合标准中间溶液ⅱ；②准确移取混合标准中间液ⅱ100μl、500μl、1ml、5ml，分别用20％甲醇水溶液定容至10ml，配制成浓度为1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml的混合标准工作溶液；

2待测样品的前处理：

2.1制样：

2.1.1组织样品：取适量新鲜或解冻的空白或供试组织，绞碎，并使均质。

2.1.2牛奶与羊奶：取适量新鲜或解冻的空白或供试牛奶样品，混合均匀。

2.1.3禽蛋：取适量新鲜的供试蛋，去壳，并使均质。

注：所取得上述样品均－20℃以下保存。

2.2提取：

2.2.1对于试样为肌肉或禽蛋：

对于试样为肌肉或禽蛋时的提取条件为：称取试样5g于50ml离心管中，加入3.0mlmcllvaine-na2edta缓冲溶液和10ml乙腈的混合溶液进行提取，涡旋混匀后，6000rpm振荡10min、4000r/min离心5min，转移上清液于另一50ml离心管中，残渣用提取液重复提取，合并两次提取的上清液，上清液加入6g无水硫酸钠和1.5g氯化钠，涡旋30s，静置10min后7000r/min离心5min，得到二次上清液备用；其中，mcllvaine-na2edta缓冲溶液的制备过程为：取磷酸氢二钠44.08g，乙二胺四乙酸二钠37.2g，枸橼酸8.08g，用水溶解并稀释至1000ml，即可得到0.1mol/lmcllvaine-na2edta缓冲溶液。

2.2.2对于试样为牛奶或羊奶：

对于试样为牛奶或羊奶时的提取条件为：称取试样5g于50ml离心管中，加入20ml乙腈溶液进行提取，涡旋混匀后，6000rpm振荡10min，7000r/min离心5min，转移上清液于另一50ml离心管中，上清液加入4g无水硫酸钠和1g氯化钠，涡旋30s，静置10min后7000r/min离心5min，得到二次上清液备用；

2.3净化：

净化条件为：hypersepretainpep固相萃取柱依次用4ml甲醇和4ml水活化平衡后，先取2ml二次上清液润洗固相萃取柱，弃去流出液，再移取5ml二次上清液通过固相萃取柱，用离心管收集流出液；准确移取流出液4ml，40℃下氮吹干，加入200μl甲醇后涡旋混匀10s，再加入800μl纯水涡旋混匀30s，过0.22μm尼龙滤膜，备用；

3仪器条件

3.1液相色谱条件

表2正离子模式流动相梯度洗脱程序

表3负离子模式流动相梯度洗脱程序

3.2质谱条件

质谱参数为：离子源：电喷雾离子源(esi+和esi-)；毛细管电压：3.2kv(esi+)、2.8kv(esi-)；离子传输管温度：325℃；雾化气温度：350℃；鞘气压：40arb；辅助气压：40arb；一级质谱驻留时间：100ms；二级质谱驻留时间：60ms；扫描质量范围：50～1000m/z；碰撞能量：20、40、60ev；扫描方式：全扫描加自动触发二级扫描模式。

4.高分辨质谱数据库的建立：

将207种兽药及添加物按类别将药物分成16组，分组情况如图1所示，每组混合标准液浓度为1μg/ml，用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱仪对混合标准液进行正负模式下的全扫描和二级扫描，通过q-exactiveplus自带tracefinder工作软件分析得到各化合物的保留时间、母离子精确分子量、加合方式、二级碎片离子和同位素丰度比、三个碰撞能量分别为20ev、40ev和60ev下叠加的二级谱图，完成质谱数据库的构建，如表1所示。其中同分异构体通过进单标进行确认。

表1化合物质谱库信息

5化合物检测：

用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱仪对前处理后的样品进行检测，得到样品检测原始数据；

6化合物筛查：

将提取质量窗口设为5ppm，使用tracefinder工作软件对样品检测原始数据在5ppm质量窗口范围内进行自动提取，当化合物同时满足以下条件时得到该样品中测得的疑似阳性化合物：

目标物信号响应s/n>3；

②目标物保留时间与质谱数据库中的保留时间参数偏差±2.5％以内且不超过0.5min或者≤0.2min；

③目标物和高分辨质谱数据库相比，匹配上一级母离子和一个二级碎片离子，且一级母离子质量精度偏差<5ppm，二级碎片离子质量精度偏差<10ppm；

7化合物确证：

对于样品中的疑似阳性化合物，需将其二级碎片谱图与标准溶液中该化合物的二级碎片谱图进行比较，若两张谱图中主要碎片离子的准确分子量精度偏差小于10ppm且相对离子丰度一致，则判定该化合物在该样品中为阳性。

8灵敏度：

本发明中207种兽药及添加物的检出限为符合上述步骤6化合物筛查和上述步骤7的化合物确证条件的样品中能检出该化合物的最低浓度，207种兽药及添加物的检出限如表4所示：

207种兽药及添加物标准溶液一级离子提取色谱图如附图4-附图210，兽药及添加物的浓度为10ng/ml。

9方法学验证

本研究的内容主要是化合物的筛查和确证，因此本方法的以定性为主，定量为辅。

本方法主要考察的技术指标为：检出限、回收率、精密度和基质效应。

9.1检出限

空白试样按相同的步骤处理后，测定结果表明：在相应的保留时间，空白试样对所测药物无干扰。如果空白试样在相应的保留时间处有被测药物峰出现，应扣除空白试样值进行结果计算。

添加适量混合标准溶液于5g空白基质中，经上述前处理方法进行样品处理后测定，依据化合物确证的条件，确定鸡肉、猪肉、羊肉、牛肉、鸡蛋、鸭蛋、牛奶和羊奶中各化合物的检出限。结果如表4所示。

9.2回收率和精密度

采用标准添加法，在空白样品中添加检出限附近的浓度。各浓度进行5个样品平行试验，重复3次，求批内、批间相对标准偏差，结果为药物回收率范围为40％～130％，批内批间相对偏差小于30％。计算结果如表4所示：

9.3基质效应

本研究通过比较标准溶液和样品净化液氮吹前加标的峰面积得到样品的基质效应，结果发现不同基质种类均表现出基质抑制现象或基质增强现象，其中基质效应值介于0.85和1.15之间表明无明显基质效应，大于1.15是基质增强，小于0.85是基质抑制。基质效应范围为0.11～8.03。因此若需定量，采用基质匹配的标准曲线进行定量。

以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明整体构思前提下，还可以作出若干改变和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。