一种基于强酸盐的提高蛋白质分子电喷雾电荷数的方法与流程

【技术领域】

本发明涉及质谱技术领域，尤其涉及一种基于强酸盐的提高蛋白质分子电喷雾电荷数的方法。

背景技术：

电喷雾离子化是一种软离子化方法，它可以产生带有多个电荷的离子，有利于分析完整的蛋白质等生物大分子。蛋白质在电喷雾电离中所带电荷的多少与其构象有关。一般来说，低电荷状态与折叠的蛋白质结构相关，而高电荷状态与展开的蛋白质结构相关。增加蛋白质分子的电荷状态对基于质谱(ms)的分析是有利的。

首先，它降低了蛋白质的质荷比(m/z)，从而扩展了有效质量范围。蛋白质分子的分子量通常能够达到几十甚至几百kda，如果带的电荷较少，则会超过普通质谱仪所能检测的m/z范围。通过提高电荷数的方法能够使得m/z显著下降，大大提高仪器可检测的质量范围的上限。其次，在自上而下的蛋白质组学中，具有较高电荷状态的蛋白质分子更容易解离并具有更高的序列覆盖率。当使用基于电子的串联质谱法时，这种现象更为显著，例如电子捕获碎裂(electroncapturedissociation，ecd)和电子转移碎裂(electrontransferdissociation，etd)。此外，大多数ms的分辨率随着m/z的降低而增加。在较低的m/z下ms的灵敏度也较高，尤其是对于那些电荷敏感探测器，包括傅里叶变换离子回旋共振(ft-icr)和轨道阱质谱仪。

早期的实验通过几种变性的方法来产生高电荷蛋白质离子。在溶液中的蛋白质如果暴露在极端ph或高温下，分子的结构会被破坏。发生解折叠的扩展结构可以在电喷雾期间保留更多电荷。一些通过在反吹气中引入酸性或碱性蒸气，也可以在esi界面实现蛋白质的解折叠。这种方法所用的酸或者碱通常具有易挥发性并具有一定毒性。

近年来，基于有机溶剂的高电荷试剂的方法也已经被广泛的研究。最常用的添加剂包括m-nba，环丁砜和dmso。这些有机溶剂都具有较高的沸点，溶剂在esi的去溶剂化过程中被富集，最终产生的高浓度的有机溶剂会对液滴的表面张力和蛋白质的构象产生影响。这一方法所用的添加剂的浓度较高，并且具有一定毒性。

此外，电热高电荷离子产生方法(electrothermalsupercharging，ets)和pr-nesi的高电荷离子产生方法也被开发出来。ets在分析之前，将碳酸氢铵(nh4hco3)以100mm的浓度添加到样品溶液中。通过施加更高的喷雾电压可以增加蛋白质的电荷状态。然而，高浓度的碳酸氢铵会影响目标蛋白质的信号响应以及仪器灵敏度。pr-nesi方法需要具有正反双向输出功能的高压电源，一定浓度的高电荷试剂，然后进行一定的电压切换操作才能实现，而且产生高电荷离子信号的持续时间较短。

因此，有必要研究一种基于强酸盐的提高蛋白质分子电喷雾电荷数的方法来应对现有技术的不足，以解决或减轻上述一个或多个问题。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种基于强酸盐的提高蛋白质分子电喷雾电荷数的方法，能够显著提高蛋白质分子在电喷雾离子化时所携带的电荷数，且操作简单、低毒低害。

本发明提供一种基于强酸盐的提高蛋白质分子电喷雾电荷数的方法，采用纳喷雾离子源对蛋白质溶液进行离子化操作，其特征在于，所述蛋白质溶液中添加有强酸盐和弱酸添加剂。

如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述强酸盐为氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐三氟乙酸盐和三氯乙酸盐中的一种或多种。

如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述弱酸添加剂为甲酸、乙酸、草酸、柠檬酸和乳酸中的一种或多种。

如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，添加的所述强酸盐在所述蛋白质溶液中的浓度为1-10mm。

如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，添加的所述弱酸添加剂在所述蛋白质溶液中的体积占比为0.001％-1％。

如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述强酸盐的阳离子种类不限。

如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，蛋白质细胞色素c的平均电荷数为14.4+-19.7+。

如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述蛋白质为含有血红素辅基的肌红蛋白时，离子化后蛋白质细胞色素c的平均电荷数为18.5+-19.7+。

如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述强酸盐的添加浓度为5mm。

如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述弱酸添加剂的体积占比为1％。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：通过在蛋白质样品溶液中添加强酸盐作为高电荷试剂，能够显著提高蛋白质分子在电喷雾离子化时所携带的电荷数；相较于现有技术中所用添加剂的毒性，本申请的强酸盐具有低毒低害、不易挥发的优点；本方法在普通的nano-esi离子源上就可以实现，无需在装置上进行改进，也无需改变离子源条件，操作简单易实现。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

【附图说明】

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1是本发明一个实施例提供的基于强酸盐提高蛋白质分子电喷雾电荷数的结构图；

图2是本发明一个实施例提供的不同量的nacl作为高电荷试剂时细胞色素c的检测结果的质谱图；

图3是本发明一个实施例提供的不同钠盐作为高电荷试剂时细胞色素c的检测结果的质谱图；

图4是本发明一个实施例提供的不同弱酸阴离子作为高电荷试剂时细胞色素c的检测结果的质谱图；

图5是本发明一个实施例提供的不同阳离子的高电荷试剂下细胞色素c检测结果的质谱图；

图6是本发明一个实施例提供的不同阳离子的高电荷试剂下细胞色素c的电荷状态汇总图；

图7是本发明一个实施例提供的nacl作为高电荷试剂和hac作为弱酸添加剂对细胞色素c检测结果的影响；

图8是本发明一个实施例提供的nacl作为高电荷试剂和hac作为弱酸添加剂对含有血红素辅基的肌红蛋白检测结果的影响；

图9是本发明一个实施例提供的用氯乙酸和hcl获得的细胞色素c的质谱图。

其中，图中：

1、高压电源；2、绝缘端盖；3、电极；4、纳喷针；5、质谱进样口；6、蛋白质溶液。

【具体实施方式】

为了更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图对本发明实施例进行详细描述。

应当明确，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本发明。在本发明实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。

针对上述现有技术中的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种方便、实用，且低毒低害并且能够长时间产生的稳定的高电荷离子信号的基于强酸盐的提高蛋白质分子电喷雾电荷数的方法。

本申请基于强酸盐的提高蛋白质分子电喷雾电荷数的方法，如图1所示，其电喷雾装置与普通nano-esi一样，不做任何改动；在蛋白质样品溶液中添加1-10mm(mm即10^-3mol/l)高电荷试剂，即强酸盐。盐的种类有一定的要求，需要是强酸的盐，如氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硝酸盐三氟乙酸盐和/或三氯乙酸盐等。弱酸的盐是无法成为高电荷试剂的，如硫化物、碳酸盐、甲酸盐和醋酸盐。盐的阳离子的种类对高电荷试剂的效果没有显著影响。li⁺、na⁺、k⁺和nh4⁺等的强酸盐均可作为高电荷试剂。

另外，在蛋白质溶液中添加体积比为0.001％-1％弱酸添加剂。常用的弱酸如甲酸、乙酸、草酸、柠檬酸和乳酸等均可使用。

下面通过具体的实施例验证基于强酸盐的提高蛋白质分子电喷雾电荷数方法的检测效果。

实施例1：nacl用于产生高电荷蛋白质分子

本实施例首先选取了nacl和细胞色素c(细胞色素c，来源于马心脏，购自sigmaaldrich)作为研究对象，并对不同浓度的nacl的效果进行了对比。

图2a为使用普通纳喷雾，以1％(v/v)乙酸(hac)为弱酸添加剂，不使用高电荷试剂，对细胞色素c的离子化效果。从图中可以看到两个峰簇，即低电荷峰簇和高电荷峰簇。其中，低电荷峰簇以带有9个电荷的谱峰9+峰为主峰，具有明显较高的信号强度。而高电荷峰簇以带有17个电荷的谱峰17+峰为主峰，具有明显较低的信号强度。加权平均电荷数qav用于计算目标蛋白质分子所带的平均电荷数，可以用于不同方法之间的比较。qav的定义如公式1所示。其中，qi是第i个谱峰所对应的电荷数，wi是第i个谱峰的信号强度，n是谱峰的总数。在上述纳喷雾的检测条件下，细胞色素c的平均电荷数qav＝10.9+。

图2b为其他条件和图2a相同的情况下，以1mmnacl作为高电荷试剂，得到的细胞色素c的检测结果。与没有使用高电荷试剂的检测结果显著不同的是，高电荷峰簇的信号强度显著提高了，而低电荷峰簇相比于之前降低了。从谱峰的种类和信号强度来看，使用1mmnacl高电荷试剂所产生的细胞色素c离子的整体带电数要明显高于不使用高电荷试剂的方法。细胞色素c的平均电荷数qav＝15.1+，比纳喷雾的结果有了一个显著的提升。本申请中平均电荷数中的“+”代表正电荷。

图2c为其他条件和图2a相同的情况下，以5mmnacl作为高电荷试剂，得到的细胞色素c的检测结果。电荷分布以高电荷峰簇为主，低电荷峰簇明显下降。高电荷峰簇以16+电荷为主峰，低电荷峰簇以9+电荷为主峰。细胞色素c的平均电荷数qav＝15.4+，相比于图2b有了进一步提升。

图2d为为其他条件和图2a相同的情况下，以9mmnacl作为高电荷试剂，得到的细胞色素c的检测结果。电荷分布以高电荷峰簇为主，高电荷峰簇中心为16+电荷，低电荷峰簇以8+为主峰。细胞色素c的平均电荷数qav＝15.2+，相比于图2c稍微有一些下降。

从上述结果可以看出，以nacl作为高电荷试剂，我们的方法能够获得高电荷离子的质谱图，在较低浓度(1-9mm)的范围内就可以显著提高蛋白质的电荷数，其中5mmnacl的效果最好。

实施例2：以其它钠盐用于细胞色素c高电荷离子的产生

本发明所建立的方法对盐的种类有一定的要求，需要强酸盐。本实施例在nacl的基础上，改变阴离子的种类，分别对br^-、i^-、no3^-和tfa^-进行了考察，用于细胞色素c高电荷离子的产生。

图3a为以5mmnabr作为高电荷试剂对细胞色素c的检测结果。从图中可以看到两个峰簇，即低电荷峰簇和高电荷峰簇。其中，低电荷峰簇以9+峰为主峰，高电荷峰簇以17+为主峰。高电荷峰簇的丰度远高于低电荷峰簇。细胞色素c的平均电荷数qav＝16.7+，略高于nacl。

图3b为以5mmnai作为高电荷试剂对细胞色素c的检测结果。从图中可以看到高电荷峰簇的丰度远高于低电荷峰簇。细胞色素c的平均电荷数qav＝15.7+。

图3c为以5mmnano3作为高电荷试剂对细胞色素c的检测结果。从图中可以看到高电荷峰簇的丰度远高于低电荷峰簇。细胞色素c的平均电荷数qav＝14.5+。

图3d为以5mmnatfa作为高电荷试剂对细胞色素c的检测结果。当使用natfa时，光谱由natfa簇主导。但仍然可以确定细胞色素c的双峰分布。高电荷峰簇以15+为主峰，低电荷峰簇以9+峰为主峰。细胞色素c的平均电荷数qav＝13.9+。

图4研究了两种弱酸阴离子，包括hs^-和ac^-。当使用5mmnahs时，在光谱中观察到高丰度的nahs簇(图4a)，观察到高电荷和低电荷两个峰簇。其中高电荷峰簇以15+为主峰，低电荷峰簇以9+为主峰。细胞色素c的平均电荷数qav＝11.5+。当使用5mmnaac时，在光谱中观察到高丰度的naac簇(图4b)，观察到一个峰簇，以9+为主峰。细胞色素c的平均电荷数qav＝8.9+。

从上述结果可以看出，当向样品中加入四种强酸钠盐时，细胞色素c的电荷状态接近于用nacl获得的电荷状态。相比之下，当将两种弱酸钠盐加入样品中时，细胞色素c的电荷状态与不含盐时的电荷状态相似。这些盐的阳离子即na+是相同的。他们之间的唯一区别是他们的阴离子。可以推断，强酸阴离子显著增加了细胞色素c的电荷状态，而弱酸阴离子几乎没有影响。

实施例3：以其它氯盐用于细胞色素c高电荷离子的产生

为了检验盐的阳离子对检测效果的影响，我们在nacl的基础上，改变阳离子的种类，分别对li⁺，k⁺，cs⁺，nh4⁺，mg²⁺，ca²⁺，fe³⁺和la³⁺进行了考察，用于细胞色素c高电荷离子的产生。

图5是上述高电荷试剂对细胞色素c的检测结果的质谱图，而细胞色素c的电荷状态总结如图6所示。licl，kcl，cscl和nh4cl四种盐的的浓度均为5mm，质谱图也非常相似。观察到双峰，其中高电荷峰簇高于低电荷峰簇。四种盐的细胞色素c的总qav分别为14.8+，14.4+，14.9+和15.0+。mgcl2和cacl2的浓度为2.5mm。使用该浓度使得样品中cl^-的浓度与5mmnacl的样品相同。获得的两种盐的质谱图与用上述四种盐获得的质谱图非常相似。观察到双峰，其中高电荷峰簇高于低电荷峰簇。两种盐的总qav分别为15.1+和15.2+。

fecl3和lacl3的浓度为1.67mm，因此两个样品中cl^-的浓度为5mm。与上述其他六种盐相比，用fecl3和lacl3得到的细胞色素c的电荷状态略高。虽然仍然观察到双峰电荷分布，但高电荷峰簇显著高于低电荷峰簇。高电荷峰簇的范围从11+到21+，以17+为中心，而低电荷的范围从8+到10+，以9+为中心。两种盐的总qav分别为16.3+和16.1+。

本申请研究了多种阳离子种类，包括强碱和弱碱阳离子，还考虑了具有不同电荷的阳离子。总体而言，与没有添加高电荷试剂的结果比较，在所有这些氯化物的盐上观察到细胞色素c的电荷状态的显著增加。在不同阳离子物质之间未观察到电荷状态的显著差异。在具有不同电荷的阳离子之间获得的电荷状态仅有轻微差异。3+带电阳离子给出了细胞色素c的最高电荷状态。2+带电阳离子产生中等电荷态。在1+电荷阳离子上观察到最低电荷状态。这种微小的差异可能是由于阳离子本身的浓度降低。在强碱和弱碱阳离子之间几乎没有观察到细胞色素c的电荷状态的差异。通过对这些阳离子的研究，可以推断出阳离子种类对细胞色素c的电荷状态几乎没有影响。

实施例4：弱酸添加剂对本发明的作用

样品溶液中存在一定量的弱酸对阴离子的影响至关重要。样品中较高浓度的酸会增强强酸阴离子对电荷状态增加的影响。当没有向样品中加入酸时，几乎没有观察到电荷状态的增加(图7a和b)。当没有向样品中加入弱酸添加剂时，观察到细胞色素c的单峰(图7a)。峰簇范围从7+到12+，以8+为中心。qav是8.9+。当向样品中加入5mmnacl时，光谱由nacl簇主导(图7b)。仍然可以得到细胞色素c的单峰。它的范围从7+到9+，以8+为中心。qav为7.7+，甚至低于没有nacl的情况。

向样品中加入0.1％hac恢复了cl^-的作用(图7c和7d)。当向样品中加入0.1％hac时，观察到双峰。以低电荷峰簇为主峰。峰簇范围从7+到10+，以9+为中心。高电荷峰簇的丰度相当低。它的范围从13+到20+，以18+为主峰。整体qav为9.7+。当样品进一步加入5mmnacl时，高电荷峰簇的丰度显著增加。然而，低电荷峰簇仍然具有更高的丰度。整体qav为13.5+，远高于没有nacl的情况。进一步提高弱酸添加剂的浓度，则可得到图2的结果。

在含有血红素辅基的肌红蛋白(holo-mb)的实验中酸的影响更明显，如图8所示。极少量的hac添加剂就可以诱导nacl的作用。当向样品中加入0.001％hac时，质谱图主要由holo-mb峰簇构成(图8a)。它的范围从8+到15+，以12+为主峰，代表折叠结构。qav是11.6+。还观察到失去血红素辅基的肌红蛋白(apo-mb)，但它只有非常低的丰度。向样品中加入5mmnacl导致电荷状态的显着增加(图8b)。质谱图主要由apo-mb峰簇构成。它的范围从12+到25+，以19+为主峰，代表了一个展开的结构，完全失去了血红素辅基。qav为18.5+，显着高于没有nacl的情况。虽然仍然观察到holo-mb，但它的丰度非常低。

进一步增加hac的浓度，电荷状态会继续增加。当向样品中加入0.01％hac时，质谱图主要由apo-mb峰簇构成(图8c)。它的范围从11+到29+，以17+为主峰。qav是18.9+。还观察到holo-mb，但丰度非常低。向样品中加入5mmnacl使mb的电荷状态增加到更高的水平(图8d)。holo-mb完全被移除，仅观察到apo-mb。它的范围从12+到29+，以20+为主峰。qav增加到19.7+。

对本申请的实施例结果进行机理探讨，本发明利用了强酸盐的阴离子与蛋白质分子的相互作用，研究发现了强酸阴离子在酸性条件下可以显著增加蛋白质的电荷状态，而弱酸阴离子则不能。根据上述实验结果，可以推断出使它们在结果上不同的关键因素是酸性溶液中弱酸阴离子的水解。弱酸阴离子的水解导致其浓度降低，从而减少弱酸阴离子对蛋白质结构的影响。

在esi过程中溶液的ph值会发生变化，在正极，由于纳喷雾尖端内的氧化反应，ph值下降，如2h2o→4h⁺+4e^-+o2。对于未缓冲的溶液，ph值可能会从接近中性的ph值降至ph＝3.43。此外，在esi过程中，由于溶液蒸发和液滴中h⁺的富集也会导致ph值的降低。离子形成时液滴的有效ph值可能比esi之前溶液的ph值低1-3个ph单位。ph值降低加剧了该溶液弱酸阴离子的水解，进一步降低了弱酸阴离子的浓度。结果，弱酸性阴离子的影响衰减到更低的水平。

图9显示了用氯乙酸(mca)和hcl获得的细胞色素c的质谱图。两种样品的初始ph保持与1％hac(ph＝2.74)的初始ph相同。1％hac的摩尔浓度为174mm。hac的酸度系数(pka)为4.74。与hac相比，mca的pka低得多，为2.86。mca的浓度仅为3.9mm(ph＝2.76)。观察到双峰(图9a)，与用hac获得的结果相比，高电荷峰簇的丰度明显增加(图2a)。整体qav增加到12.2+。当使用hcl时，细胞色素c的电荷状态增加到甚至更高的水平(图9b)。hcl的pka为-8.00。hcl的浓度为1.7mm(ph＝2.75)。观察到双峰，高电荷峰簇的丰度高于低电荷峰簇。整体qav增加到15.1+。

尽管具有hac、mca和hcl的三个样品的初始ph相同，但获得的细胞色素c的电荷状态显著不同。细胞色素c的电荷状态随着所用酸的酸度而增加。hac的酸度最弱。得到的总体qav是最低的。相比之下，hcl具有最强的酸性。获得的整体qav是最高的。在去溶剂化过程中，喷雾液滴的ph值降低。ph的降低加剧了弱酸阴离子的水解，导致弱酸阴离子浓度的衰减。

hac是三种酸中最弱的酸，它的水解是最严重的，最终浓度也最低。因此，ac^-对细胞色素c分子构象的影响最弱。mca的酸度比hac强得多。与hac相比，mca^-的水解没有ac^-的严重。mca^-的最终浓度远高于ac^-的浓度。mca^-对细胞色素c分子构象的影响强于ac^-，导致细胞色素c分子产生更多未折叠构象，因此电荷状态增加。hcl是强酸，不会发生水解。液滴中cl^-的最终浓度远高于ac^-和mca^-的浓度。在cl^-的影响下，细胞色素c分子的构象更加展开。因此细胞色素c的电荷状态是最高的。

当将nacl添加到用1％hac缓冲的细胞色素c样品时，情况类似。无论是否向样品中加入nacl，都未观察到ph的变化，如表1所示。四个样品的初始ph值相同。然而，当向样品中加入nacl时，细胞色素c的电荷状态显着增加。样品中cl^-的存在诱导了细胞色素c分子的解折叠并导致细胞色素c的电荷状态增加。

表1

本方法在普通的nano-esi离子源上就可以实现，无需在装置上进行改进，也无需改变离子源条件。其他方法如基于pr-nesi的方法需要具有正反双向输出功能的高压电源，一定浓度的高电荷试剂，然后进行一定的电压切换操作才能产生高电荷离子，但这种高电荷的信号只能持续一小段时间，而本发明仅需在普通的nano-esi离子源的正离子模式下即可实现，大部分可使用的高电荷试剂的种类和浓度均与pr-nesi方法相同，并具有低浓度，低毒或无毒以及良好的生物样品适应性，该方法产生的高电荷离子信号可以长时间稳定存在。

本发明所需高电荷试剂和弱酸添加剂的浓度低，使得蛋白质在溶液中仍然可以保持其天然的折叠结构。强酸盐在溶液中的浓度为1-10mm(10^-3mol/l)级别，弱酸添加剂的浓度一般为0.001％-1％(v/v)，它们不会对蛋白质在溶液中的天然结构造成影响。之前基于普通nano-esi的方法一般使用强酸、强碱等试剂，造成蛋白质在溶液中解折叠甚至失活，也不利于仪器的维护；而基于superchargingregents的方法所用的间硝基苄醇(m-nitrobenzylalcohol，m-nba)，环丁砜或二甲亚砜(dimethylsulfoxide，dmso)的浓度为1％-5％(v/v)，浓度远大于我们所使用的添加剂，几乎达到了它们的溶解度极限。

本发明所使用的高电荷试剂和弱酸试剂常见易得，毒性较低。使用的高电荷试剂(强酸盐：如氯化钠(nacl)，氯化钾(kcl))和弱酸添加剂(如甲酸(fa)，乙酸(hac))为实验室常用化学试剂，这些试剂多为低毒甚至无毒，对人体危害小。

以上对本申请实施例所提供的一种基于强酸盐的提高蛋白质分子电喷雾电荷数的方法，进行了详细介绍。以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本申请的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本申请的限制。

如在说明书及权利要求书当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可理解，硬件制造商可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求书并不以名称的差异来作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求书当中所提及的“包含”、“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含/包括但不限定于”。“大致”是指在可接收的误差范围内，本领域技术人员能够在一定误差范围内解决所述技术问题，基本达到所述技术效果。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃以说明本申请的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求书所界定者为准。

还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的商品或者系统不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种商品或者系统所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系统中还存在另外的相同要素。

应当理解，本文中使用的术语“和/或”仅仅是一种描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，a和/或b，可以表示：单独存在a，同时存在a和b，单独存在b这三种情况。另外，本文中字符“/”，一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

上述说明示出并描述了本申请的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本申请并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述申请构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本申请的精神和范围，则都应在本申请所附权利要求书的保护范围内。