一种测定甘薯中硒含量的响应面法优化原子荧光光谱法的制作方法

本发明涉及一种测定硒含量的方法，特别涉及一种测定甘薯薯块中硒含量的响应面法优化原子荧光光谱法。

背景技术：

硒是人体的必需微量元素之一，具有清除体内自由基、提高机体免疫力等多种生物学功能，但摄入不足或过量均会导致人体疾病发生。人体自身无法合成硒，食用富硒食品是人体获取硒的主要途径，而富硒甘薯可以作为人体补充硒的良好载体。目前，食品中硒含量的测定方法主要依据国标法测定，而针对甘薯中硒含量的测定标准则未见报道。因此，开展甘薯中硒含量测定方法的研究十分必要。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

技术实现要素：

本发明以富硒甘薯品种为材料，选择混合酸比例、消解时间、屏蔽剂浓度、载液浓度、介质浓度和还原剂含量为研究因素，通过测定单个因素条件下的荧光值大小，确定各个因素的水平，进一步通过box-behnken设计结合响应面分析法，建立一种基于原子荧光光谱法的快速、准确测量甘薯总硒含量的检测方法，同时对无机硒含量测定的提取液种类和浓度，提取温度和时间进行了优化，通过计算得知有机硒含量。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：

一种测定甘薯中硒含量的响应面法优化原子荧光光谱法，包含以下操作步骤：

(1)制备待测样品溶液：称取前处理后所得甘薯样品0.5000g，加混合酸冷消解过夜，电热板赶酸，加入体积浓度为20％的介质盐酸水溶液定容，即得待测样品溶液，同时制备空白溶液；

(2)标准曲线的绘制：取100μg/ml硒标准储备液100μl，置于10ml容量瓶中，加体积浓度为20％介质盐酸水溶液稀释至1.0μg/ml，制得硒标准中间溶液，分别精密量取0、10、20、40、60、80、100μl硒标准中间溶液于10ml容量瓶中，用体积浓度为20％的介质盐酸水溶液容至刻度，混合均匀，配置成含硒浓度分别为0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0ug/l的系列标准溶液；

将0ug/l～10.0ug/l不同梯度的硒标准溶液上机进行测试，得出标准曲线，硒标准曲线方程为：fu＝69.447×ρ-31.068，式中：fu表示荧光值，ρ表示溶液中硒的质量浓度，其相关系数r为0.9967，连续对空白样品进行11次测定，以3s除以工作曲线的斜率得到方法检出限为0.0314ug/l；

(3)原子荧光光度计法测定硒含量：仪器为rgf-6200原子荧光光度计，设置原子荧光光谱仪灯电流为80ma，负高压为280v，载气流量为400ml/min，屏蔽气流量为900ml/min，载气为99.99％的氩气，测量方式为标准曲线法，开机预热30min中，移取10.0ml步骤(1)中所得待测样品溶液和空白溶液于原子荧光分光光度计样品架上，载液为体积浓度为5％的盐酸溶液，还原剂为质量浓度为3％的硼氢化钾溶液，读取所得荧光值，读数时间为16.0s，延迟时间为1.0s，所得荧光值代入步骤(2)所得标准曲线方程中，计算出样品溶液中硒的质量浓度ρ，然后再根据下列公式，

计算出待测样品的硒含量x，即得；

式中：

x：样品中硒的含量，单位为毫克每千克(mg/kg)；

ρ：样品溶液中硒的质量浓度，单位为微克每升(ug/l)；

v：样品消化液的总体积，单位为毫升(ml)；

m：样品的称样量，单位为克(g)；

1000：换算系数。

优选的是，步骤(1)中所述的前处理为将甘薯清洗、晾干、切丝、烘干后，粉碎过70目筛，转入封口袋中保存备用。

优选的是，步骤(1)中所述的混合酸为硝酸和高氯酸的按照体积比5：1混合所得。

优选的是，步骤(1)中当测定的为总硒含量时，制备待测样品溶液具体操作为：称取甘薯样品粉末0.5000g于聚四氟乙烯消解管中，加入混合酸10ml，加盖过夜冷消解，次日加热至150℃～180℃(120℃加热30min，150℃加热1h，180℃加热2h)，赶酸至2ml左右，当样品清澈透明且冒出白烟时停止加热，继续加热至溶液到2ml左右，冷却后加入6mol/l的盐酸5.00ml加热至冒出白烟时，停止加热，冷却后将液体转移至10ml容量瓶中，加入2.5ml浓度为100g/l的铁氰化钾，并用体积浓度为20％的介质盐酸水溶液定容得到待测样品溶液，即得。

优选的是，步骤(1)中当测定的为无机硒含量时，制备待测样品溶液具体操作为：称取0.5000g甘薯样品粉末，加入体积浓度为45％的乙醇溶液20ml，于60℃水浴提取30min，然后置于超声清洗器中超声30min，冷却，4000r/min离心30min，上清液即为无机硒的提取液，将提取液加热蒸去大部分溶液后作为样品，再加入混合酸、赶酸、加热，加体积浓度为20％的介质盐酸水溶液定容得到待测样品溶液，即得。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明建立了响应面优化氢化物发生-原子荧光光谱法测定甘薯薯块中总硒含量和无机硒含量，以及通过计算间接测定有机硒含量的方法，为甘薯中无机硒和有机硒的检测提供了一种快速检测的方法；本发明方法简洁、易操作、测定结果样品硒回收率为97.25％～100.68％，检出限为0.0314μg·l^-1。

附图说明

图1是本发明不同因素对样品荧光值的影响；其中，图1a为介质盐酸浓度对样品溶液荧光值的影响，图1b为载体盐酸浓度对样品溶液荧光值的影响，图1c为硼氢化钾浓度对样品溶液荧光值的影响，图1d为混合酸(硝酸和高氯酸)体积比对样品溶液荧光值的影响，图1e为铁氯化钾含量对样品溶液荧光值的影响，图1f为水浴温度对样品溶液荧光值的影响，图1g为水浴时间对样品溶液荧光值的影响，图1h为乙醇含量对样品溶液荧光值的影响。

具体实施方式

下面结合附图具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。实施例中100μg·ml^-1硒的标准储备液(中国计量科学研究院)，硼氢化钾，氢氧化钠，盐酸、硝酸、高氯酸、乙醇、铁氰化钾等均为优级纯，实验用水均为超纯水。所有玻璃器皿均用20％hno3浸泡24h，并依次用自来水和超纯水洗涤，待用。甘薯样品采集于广西农业科学院明阳基地，rgf-6200原子荧光光度计(北京博晖创新光电技术股份有限公司)。

实施例1

一种测定甘薯中硒含量的响应面法优化原子荧光光谱法，操作步骤如下：

(1)制备待测样品溶液：将甘薯清洗、晾干、切丝、烘干后，粉碎过70目筛，转入封口袋中保存备用，称取备用的甘薯样品0.5000g，加混合酸(混合酸为硝酸和高氯酸的按照体积比5：1混合所得)冷消解过夜，电热板赶酸，加入介质盐酸水溶液定容，即得待测样品溶液；

测定的为总硒含量时，制备待测样品溶液具体操作为：分别称取8份0.5000g的甘薯样品粉末于聚四氟乙烯消解管中，编号为1、2、3、4、5、6、7、8，向各个编号的聚四氟乙烯消解管中加入混合酸10ml，加盖过夜冷消解，次日加热至150℃～180℃(120℃加热30min，150℃加热1h，180℃加热2h)，赶酸至2ml左右，当样品清澈透明且冒出白烟时停止加热，继续加热至溶液到2ml左右，冷却后加入6mol/l的盐酸5.00ml加热至冒出白烟时，停止加热，冷却后将液体转移至10ml容量瓶中，加入2.5ml浓度为100g/l的铁氰化钾，并用体积浓度为20％的介质盐酸水溶液定容分别得到编号为1、2、3、4、5、6、7、8的待测样品溶液ⅰ，即得；

测定的为无机硒含量时，制备待测样品溶液具体操作为：分别称取8份0.5000g的甘薯样品粉末，编号为1、2、3、4、5、6、7、8，向各个编号的甘薯样品粉末中加入体积浓度为45％的乙醇溶液20ml，于60℃水浴提取30min，然后置于超声清洗器中超声30min，冷却，4000r/min离心30min，上清液即为无机硒的提取液，将提取液加热蒸去大部分溶液后作为样品，再加入混合酸、赶酸、加热，即加入2.5ml浓度为100g/l的铁氰化钾，加体积浓度为20％的介质盐酸水溶液定容分别得到编号为1、2、3、4、5、6、7、8的待测样品ⅱ，即得；

(2)标准曲线的绘制：取100μg/ml硒标准储备液100μl，置于10ml容量瓶中，加体积浓度为5％介质盐酸水溶液稀释至1.0μg/ml，制得硒标准中间溶液，精密量分别取0、10、20、40、60、80、100μl硒标准中间溶液于10ml容量瓶中，用体积浓度为5％的介质盐酸水溶液容至刻度，混合均匀，配置成含硒浓度分别为0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0ug/l的系列标准溶液；将0ug/l～10.0ug/l不同梯度的硒标准溶液上机进行测试，得出标准曲线，硒标准曲线方程为：fu＝69.447×ρ-31.068，式中：fu表示荧光值，ρ表示溶液中硒的质量浓度，其相关系数r为0.9967，连续对空白样品进行11次测定，以3s除以工作曲线的斜率得到方法检出限为0.0314ug/l；

(3)原子荧光光度计法测定硒含量：仪器为rgf-6200原子荧光光度计，设置原子荧光光谱仪灯电流为80ma，负高压为280v，载气流量为400ml/min，屏蔽气流量为900ml/min，载气为99.99％的氩气，测量方式为标准曲线法，开机预热30min中，分别移取10.0ml步骤(1)中所得待测样品溶液ⅰ、ⅱ于样品架上，载液为5％的盐酸溶液，还原剂为3％的硼氢化钾，读取所得荧光值，读数时间为16.0s，延迟时间为1.0s，所得荧光值代入步骤(2)所得标准曲线方程中，计算出样品溶液中硒的质量浓度ρ，然后再根据公式：

计算出待测样品的硒含量x，即得，所得结果如表1所示；

式中：

x：样品中硒的含量，单位为毫克每千克(mg/kg)；

ρ：样品溶液中硒的质量浓度，单位为微克每升(ug/l)；

v：样品消化液的总体积，单位为毫升(ml)；

m：样品的称样量，单位为克(g)；

1000：换算系数。

表1

表1中，无机硒百分比为无机硒占总硒含量的百分比，有机硒百分比为有机硒占总硒含量的百分比。

检测结果表明，甘薯植株可以有效地将无机硒转化为有机硒，且薯块中的有机硒含量最高可占总硒含量的89.68％，说明富硒甘薯是一种适宜的绿色补硒食品。

对比实施例1

选取相同硒标准溶液(4.0ug/l)，在载液盐酸浓度为5％(v/v)，硼氢化纳溶液浓度为1.0％(g/g)的条件下，介质盐酸浓度分别为5％、10％、15％、20％、25％(v/v)条件下，其余操作完全与实施例1相同，测定介质盐酸对试液荧光值的影响。

对比实施例2

选取相同硒标准溶液(4.0ug/l)，在介质盐酸浓度为5％(v/v)，硼氢化纳溶液浓度为1.0％(g/g)的条件下，载液盐酸浓度分别为2.5％、7.5％、10％、12.5％、15％(v/v)，其余操作完全与实施例1相同，测定载体盐酸对试液荧光值的影响。

对比实施例3

选取相同硒标准溶液(4.0ug/l)，在介质盐酸浓度为5％(v/v)，载液盐酸浓度分别为5％(v/v)的条件下，硼氢化钾溶液浓度分别为0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.5％、4.0％(g/g)，其余操作完全与实施例1相同，测定还原剂硼氢化钾对试液荧光值的影响。

对比实施例4

选取相同硒标准溶液(4.0ug/l)，在介质盐酸浓度为5％(v/v)，载液盐酸浓度分别为5％(v/v)的条件下，硼氢化纳溶液浓度为1.0％(g/g)的条件下，混合酸(硝酸/高氯酸)体积比值依次为6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1条件下进行冷消解和电热板消解，其余操作完全与实施例1相同，测定混合酸对试液荧光值的影响。

对比实施例5

选取相同硒标准溶液(4.0ug/l)，在介质盐酸浓度为5％(v/v)，载液盐酸浓度分别为5％(v/v)的条件下，硼氢化纳溶液浓度为1.0％(g/g)的条件下，铁氰化钾浓度分别为0mg/ml、1.25mg/ml、12.5mg/ml、25.0mg/ml，其余操作完全与实施例1相同，测定铁氰化钾浓度对试液荧光值的影响。

对比实施例6

无机硒提取水浴温度分别称取15份甘薯样品0.5000g，水浴温度分别为20℃、40℃、60℃、80℃、100℃，水浴时间为30min，提取液为水，其余操作与实施例1相同，测定水浴温度对试液荧光值的影响。

对比实施例7

无机硒提取水浴时间分别称取12份甘薯样品0.5000g，水浴时间分别为15min、30min、45min、60min，水浴温度为100℃，提取液为水其余操作与实施例1相同，测定水浴时间对试液荧光值的影响。

对比实施例8

无机硒提取液乙醇含量：分别称取15份甘薯样品0.5000g，乙醇提取液浓度分别为0％、15％、30％、45％、60％，水浴时间为30min，水浴温度为100℃，其余操作与实施例1相同，测定乙醇溶液对试液荧光值的影响。

结果与分析

从图1-a中可以看出，不同介质盐酸浓度对样品荧光值的影响差异显著。介质盐酸浓度为20％(v/v)时，样品的荧光值最高。因此，20％的介质盐酸为最优选项。

从图1-b中可以看出，不同载液盐酸浓度对样品荧光值的影响差异显著，载液盐酸浓度为10％(v/v)时获得的样品荧光值最高。因此，10％的载液盐酸为最优选项。

从图1-c中可以看出，不同硼氢化钾含量对样品荧光值影响差异显著。当硼氢化钾含量为3.0％(g/g)时，样品荧光值最高。因此，3.0％的硼氢化钾含量为最优选项。

从图1-d中可以看出，不同比例的硝酸和高氯酸组成的混合酸对于样品中硒的提取量有很大差异。当硝酸和高氯酸体积比为5：1时，获得的荧光值最高，即所测甘薯样品的硒含量最大。因此，硝酸和高氯酸体积比为5：1为最优选项。

从图1-e中可以看出，不同铁氰化钾含量对样品荧光值影响差异显著。当铁氰化钾含量为25mg/ml时，样品荧光值含量最高。因此，25mg/ml的铁氰化钾含量为最优选项。

从图1-f中可以看出，不同水浴温度对样品无机硒含量测定时的荧光值影响差异显著。当水浴温度为20℃、40℃和60℃时，荧光值差异未达到显著水平，但60℃时样品的荧光值最高。因此，60℃的水浴温度为最优选项。

从图1-g中可以看出，不同水浴时间对样品无机硒含量测定时的荧光值影响差异显著。水浴时间在15min、30min、45min、60min时的荧光值差异不显著，但30min时的荧光值最高。因此，水浴时间30min为最优选项。

从图1-h中可以看出，不同乙醇含量对样品无机硒提取时的荧光值影响差异显著。当提取液乙醇含量为45％时，提取液的荧光值最高。因此，45％的乙醇含量为最优选项。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。