微电极和含有微电极的探针及其在脑内测定氧气含量中的用途的制作方法

本发明涉及材料及电化学分析技术领域。具体地，本发明涉及微电极和含有微电极的探针及其在脑内测定氧气含量中的用途。

背景技术：

脑神经化学已逐渐成为热点研究领域。通过对脑内神经活性物质的检测，电化学方法可以揭示其中的分子机制，为神经科学研究提供最直接的信息。氧气作为脑内重要的神经化学小分子，与人体内诸多生理病理过程相关，因此氧气浓度的精准测定对活体内的生理病理过程研究有重要意义。在现有的各类氧气检测方法中，电化学方法以其高时空分辨率、高灵敏度和高选择性的优点而广受关注。植入clark型碳纤维电极进行电化学分析是早期常用的脑内氧气原位检测方法。该方法选用7μm左右的碳纤维电极作为探针，可以实现对生物体损伤较小的实时原位检测，并具有一定的生物相容性。然而，氧气在碳纤维表面的电化学还原经历两电子转移过程，会形成具有细胞毒性的过氧化氢进而损伤脑组织。因此，clark电极不适用于长时间氧气检测，逐渐被铂电极所取代。氧气在铂电极表面经历直接四电子转移的电化学还原，适合长时间脑内原位检测氧气。然而，由于活体检测环境复杂，生理病理过程中产生的过氧化氢会在铂电极表面被还原，从而带来电流干扰，使得氧气测定结果不精准。综上，该领域的挑战在于：在直接四电子氧还原的过程中，不受到过氧化氢还原电流干扰。因此，急需发展一种用于脑内氧气原位精准测定的微电极。

单原子催化剂是一种新型的催化剂材料，因其独特的配位环境、增强的金属-基底相互作用和量子尺寸效应展现出优异且独特的催化性能，例如独特的催化选择性。并且，通过对原子级分散的单个催化位点进行结构和电子构型设计，可使得单原子催化剂不仅具有产物选择性，还具有一定的底物选择性。因此，修饰特定的单原子催化剂，并将其制成微电极在脑神经电化学分析领域有广泛的应用前景。

碳纤维电极的电催化剂修饰常采用手工滴涂方法，即取少量电催化剂分散液滴涂在玻璃片表面，然后手工反复滚动碳纤维电极使得电催化剂吸附于碳纤维表面上，经过烘干获得电催化剂修饰的碳纤维电极。这种方法对操作精度要求较高，需要熟练的操作才能将电催化剂完整地覆盖于电极表面。此外，获得的碳纤维电极上催化剂的修饰量也难以精确控制导致不同批次电极重现性差。

因此，目前将单原子催化剂应用于微电极以检测氧气含量，尤其是脑内氧气含量仍有待研究。

技术实现要素：

本发明旨在解决现有活体原位氧气检测技术中存在的过氧化氢干扰、电极重现性差以及分析过程中产物对脑组织损伤等技术问题。

为此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种微电极。根据本发明的实施例，所述微电极包括：碳纤维电极；疏水修饰层，所述疏水修饰层形成于所述碳纤维电极的外表面；以及催化剂修饰层，所述催化剂修饰层形成于所述疏水修饰层的外表面，形成所述催化剂修饰层的材料包括isas-co/hncs。

根据本发明实施例的微电极采用高选择性的单原子催化剂isas-co/hncs作为电极修饰材料，在该电极上实现了直接四电子氧还原过程，同时不受过氧化氢还原电流干扰。虽然，目前有很多单原子催化剂应用于微电极上，但是，发明人发现大多催化剂无法同时兼具上述效果，修饰有isas-co/hncs的微电极性能最优。因此，根据本发明实施例的微电极应用于氧气检测，尤其是在活体脑内氧气测定时，既不会产生过多具有细胞毒性的过氧化氢，也可以精准测定氧气，具有广泛的应用前景。

根据本发明实施例的微电极在碳纤维电极与催化剂修饰层之间形成单层疏水修饰层，可以根据修饰时间控制单原子催化剂的修饰量，提供可控且稳定的电极界面，避免了手工修饰过程中电极重现性低和对操作精度要求高且耗时的缺点，大大降低了活体氧气检测的复杂程度，提高了电极检测的稳定性，实现定量检测目的。

根据本发明的实施例，所述微电极还可以具有下列附加技术特征：

根据本发明的实施例，形成所述疏水修饰层的材料包括：正己胺、正戊胺或正庚胺，优选正己胺。发明人对已公开的众多疏水性修饰层材料进行研究分析，发现采用上述疏水修饰层可以进一步有效地使修饰单原子催化剂时达到定量目的。

根据本发明的实施例，所述催化剂修饰层的厚度为1～3μm。由此，进一步更好地实现直接四电子氧还原过程，不受过氧化氢还原电流的干扰。

在本发明的另一方面，本发明提出了一种制备前面所述微电极的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：在所述碳纤维电极的外表面形成疏水修饰层；以及在所述疏水修饰层的外表面修饰isas-co/hncs，以便形成催化剂修饰层。由此，根据本发明实施例的方法所得到的微电极能够有效地在体内/体外定量检测氧气含量，尤其是脑内氧气原位检测，实现了直接四电子氧还原过程，同时不受过氧化氢还原电流干扰，避免产生过多细胞毒性的过氧化氢，具有可控且稳定的电极界面，电极检测的稳定性强，重复性好。并且，该方法操作简便、快捷、成本低，适于规模化生产。

根据本发明的实施例，通过下列方式形成疏水修饰层：提供含有1～5mmol/lliclo4和0.5～3mg/ml正己胺的乙醇溶液作为修饰液；将碳纤维电极、pt电极和ag/agcl(liclo4)电极插入所述修饰液中，在-0.2v～1.4v范围内进行循环伏安扫描，扫速为5～20mv/s，重复40～60圈，随后取出所述碳纤维电极，以水与乙醇交替冲洗三次，再静置于水中20～40分钟，以便在所述碳纤维电极外表面形成疏水修饰层。发明人经过大量实验得到上述较佳的疏水修饰层获得方式，采用正己胺在碳纤维电极外表面形成单层疏水修饰层，从而使其修饰的单原子催化剂时定量，从而提供可控且稳定的电极界面。

根据本发明的实施例，通过下列方式形成催化剂修饰层：将形成有所述疏水修饰层的碳纤维电极置于含有0.5～3mg/ml的isas-co/hncs水相分散液中12～24小时，以便在所述疏水修饰层外表面形成催化剂修饰层。发明人经过大量实验得到上述较佳的催化剂修饰层获得方式，由此，可以实现直接四电子氧还原过程，同时不受过氧化氢还原电流干扰。

根据本发明的实施例，为了提高isas-co/hncs在水相中的分散性，该分散液在修饰前进行超声分散。同时，将碳纤维电极置于该水相分散液中修饰时，每隔1小时将碳纤维电极取出，对分散液进行超声分散，再将碳纤维电极置入，由此，可以获得定量的isas-co/hncs修饰的碳纤维电极。

根据本发明的实施例，所述碳纤维电极是通过下列方式获得的：将碳纤维用导电胶黏附于导电金属丝上，并穿入已拉制好的两端开口的玻璃毛细管中，玻璃管前端露出部分碳纤维，将玻璃管前后两端用绝缘胶封住，再浸入溶液中进行超声清洗，以便得到所述碳纤维电极。由此，以便获得性能较佳的碳纤维电极。

根据本发明的实施例，所述导电金属丝选自铜丝或铁丝，所述超声清洗是依次在丙酮、乙醇和二次水中进行。由此，以便进一步提高碳纤维电极的性能。

根据本发明的实施例，对所述碳纤维电极进行如下后处理：将所述碳纤维电极浸入0.5～3mol/l的氢氧化钠溶液中，在1.5v电压下安培法处理60～100s，然后以0.1～0.5v/s的扫描速度在0～1v电压范围内进行循环伏安处理10～20圈；其中，所述安培法处理和循环伏安处理均在三电极体系中进行，工作电极为所述碳纤维电极，参比电极为ag/agcl电极，对电极为pt电极。由此，以便实现碳纤维电极的活化。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种检测脑内氧气含量的探针。根据本发明的实施例，所述探针包括前面所描述的微电极或利用前面所描述的制备微电极的方法所获得的微电极。由此，根据本发明实施例的探针能够有效地定量检测脑内氧气含量，实现了直接四电子氧还原过程，同时不受过氧化氢还原电流干扰，避免产生过多细胞毒性的过氧化氢，具有可控且稳定的电极界面，电极检测的稳定性强，重复性好。

在本发明的又一方面，本发明提出了前面所描述的微电极或利用前面所描述的制备微电极的方法所获得的微电极或前面所描述的探针在测定氧气含量中的用途。如前所述，根据本发明实施例的微电极能够有效地在体内/体外定量检测氧气含量，尤其是脑内氧气原位检测，实现了直接四电子氧还原过程，同时不受过氧化氢还原电流干扰，避免产生过多细胞毒性的过氧化氢。具有可控且稳定的电极界面，电极检测的稳定性强，重复性好，具有广泛的应用前景。

根据本发明的实施例，所述氧气含量为脑内的氧气含量。由此，该微电极不受到过氧化氢还原电流干扰，避免产生过多细胞毒性的过氧化氢，可以有效地检测脑内氧气含量，实现活体检测目的。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1a显示了根据本发明实施例1的碳纤维电极扫描电镜图；

图1b显示了根据本发明实施例1的单原子催化剂isas-co/hncs修饰后的碳纤维电极扫描电镜图；

图2a显示了根据本发明实施例1的isas-co/hncs修饰碳纤维电极对氧气选择性实验电流-时间曲线；

图2b显示了根据本发明实施例1的isas-co/hncs修饰碳纤维电极对氧气选择性实验电流响应柱状图；

图3显示了根据本发明实施例1的微电极活体检测后对氧气浓度梯度响应电流-时间曲线；

图4显示了根据本发明实施例1的微电极活体检测后对氧气响应电流校正曲线；

图5a显示了根据本发明实施例1的微电极脑内原位检测结果；

图5b显示了根据本发明实施例1的镀铂碳纤维电极脑内原位检测结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

单原子催化剂材料isas-co/hncs的制备：

首先由经典共沉淀法制备材料衬底的二氧化硅小球，由水、乙醇溶液中的teos冷凝以及氨催化水解完成。具体步骤如下：teos快速注射于水、乙醇和氨水中，该溶液经10小时搅拌，离心抽滤获得沉淀物。沉淀物由乙醇冲洗三次后静置干燥，随后获得尺寸约为190nm直径的二氧化硅小球，作为材料合成衬底。

随后将co-tipp、tipp和上述二氧化硅小球共同置于圆底烧瓶，辅以dmf作为溶剂，最后再注射α,α-二溴对二甲苯，在110℃加热下搅拌一天。产物离心后，依次以dmf、乙醇冲洗，在80℃中真空干燥12小时。之后，取出产物，将其置于管式炉中，加热到800℃持续三小时，再冷却到室温。最后，材料衬底以naoh水溶液在60℃刻蚀，整个过程持续24小时，经过水与乙醇清洗后得到最终产物isas-co/hncs。

碳纤维电极的制备：

碳纤维电极采用如下方式制备：首先将玻璃毛细管(外径：1.5mm；内径：0.89mm；长度：10cm)在微电极拉制仪(wd-1型，成都仪器厂)上拉制成两个尖端很细的锥形毛细管，在光学显微镜下，使用手术刀将玻璃尖端切断，保留的端口内径约为30～50μm。随后通过导电银胶将约2cm长的碳纤维粘在一根约10cm的铜丝上，并将其穿入拉好的毛细管中，使碳纤维在毛细管的尖端外暴露出3mm的长度。再使用环氧树脂(乙二胺)作为固化剂，封住尖端的空隙，防止测试溶液进入毛细管内。毛细管和碳纤维上多余的环氧树脂依次用丙酮、乙醇和二次水超声清洗除去，放置过夜，使环氧树脂固化。用绝缘胶将毛细管的另外一端封住，使铜丝和毛细管固定在一起。然后在光学显微镜下，用手术刀将碳纤维突出毛细管部分截为0.3mm左右，即制成碳纤维微电极(cfe)。对制备好的cfe进行电化学活化处理：将所述碳纤维电极浸入1mol/l的氢氧化钠溶液中，在1.5v电压下安培法处理80s，然后以0.1～0.5v/s的扫描速度在0～1v电压范围内进行循环伏安处理10～20圈，即可制备好用于修饰单原子催化剂的碳纤维电极。其中，安培法处理和循环伏安处理均在三电极体系中进行，工作电极为所述碳纤维电极，参比电极为ag/agcl电极，对电极为pt电极。

单层疏水定量修饰单原子催化剂的碳纤维电极修饰：

该方法包括：

s100：对碳纤维电极进行单层疏水修饰层修饰

在该步骤中，碳纤维电极制作完成后，需要进行单层疏水修饰层修饰才可用于后续催化剂材料修饰。其修饰作用力主要来源于疏水作用，因此需要先在碳纤维电极表面修饰一层致密的疏水层。具体地，首先取5.32mgliclo4、5.05mg正己胺溶于5ml乙醇中，将制作好的碳纤维电极与参比电极ag/agcl(liclo4)、对电极pt电极组成三电极体系，插入该修饰液中。随后以循环伏安模式设定扫描，在-0.2～1.4v扫描范围内，以10mv/s扫速，进行循环伏安扫描50圈。完成后将碳纤维电极依次以水和乙醇清洗，并静置于水中30分钟以清除电极表面未修饰上的吸附态正己胺。

s200：对修饰单层疏水修饰层的碳纤维电极进行单原子定量修饰

对步骤s100中修饰完单层疏水修饰层的碳纤维电极进行下一步处理，在其表面修饰单原子电催化剂isas-co/hncs。首先将isas-co/hncs以1mg/ml的浓度分散于二次水中，成为水相分散液。随后将分散液超声分散，使得分散液中的isas-co/hncs相对均匀分散。之后使用100μl移液枪头将步骤s100中的碳纤维电极卡于中间，并在1ml离心管中置入0.3ml单原子分散液。最后将配有移液枪头外壳的碳纤维电极放于1ml离心管中，isas-co/hncs是碳基疏水材料，在水相分散液中会趋向于同样疏水的步骤s100中修饰后的碳纤维电极上，形成相对均匀覆盖的单原子修饰层。该修饰持续18小时，时间长短决定修饰量，并在前一半时间(18小时)内，每1小时将电极取出后再次超声分散液并再次放回电极，以此往复。修饰完成后，依次以乙醇、水清洗电极，最终获得isas-co/hncs修饰的碳纤维电极。图1a为扫描电子显微镜对电极中的碳纤维表面进行表征，该方法修饰的碳纤维见图1b，催化剂修饰层的厚度为1～3μm。

实施例2

1、使用实施例1的方法获得的单原子碳纤维电极活体原位检测氧气

使用步骤s200中修饰isas-co/hncs的碳纤维电极进行活体原位检测之前，需要在体外证实采用上述方法获得的电极对氧气具有很好的选择性。发明人对比检测了脑内常见的电化学干扰物质在电极上的响应。参考图2a和图2b，对工作电极施加-0.1v的电压，待背景电流稳定后，向电解液(此处采用人工脑脊液，其组成为nacl(126mmol/l)、kcl(2.4mmol/l)、kh2po4(0.5mmol/l)、mgcl2(0.85mmol/l)、nahco3(27.5mmol/l)、na2so4(0.5mmol/l)、cacl2(1.1mmol/l)，用于模拟脑脊液环境)中加入20μmol/l的多巴胺(da)溶液、20μmol/l的肾上腺素(e)溶液、20μmol/l的去甲肾上腺素(ne)溶液、50μmol/l的过氧化氢(h2o2)溶液、50μmol/l的五羟色胺(5-ht)溶液、50μmol/l二羟基苯乙酸(dopac)溶液，均没有产生明显的电流响应，当加入脑内基础浓度100μmol/l的o2后，电流显著升高，说明电极对o2具有优异的选择性。其中，电化学安培法测定电流过程是在三电极体系中，电极为工作电极，参比电极为ag/agcl电极，对电极为pt电极。表现该方法修饰的碳纤维电极与镀铂碳纤维电极相比，具有良好的氧气监测选择性。

2、为了证明获得的微电极对氧气存在较好的线性关系，将该电极按照活体后校正曲线的步骤，绘制氧气的浓度矫正曲线。具体地，首先将活体实验后的isas-co/hncs修饰的碳纤维电极作为工作电极，在10ml的acsf电解质溶液中与pt丝、ag/agcl参比电极组成三电极体系。配置饱和氧气的acsf溶液，视为1.2mm氧气标准溶液，通过与饱和氮气的acsf溶液按比例混合，可获得不同浓度的氧气溶液。随后对工作电极施加-0.1v的电压，待背景电流稳定后，控制电解液中氧气浓度每隔50s增加50μmol/l，同时实时检测上述过程中的电极电流。参考图3，电极还原电流能够随氧气浓度上升呈梯度增长，而图4为图3所对应的活体实验后氧气响应电流矫正曲线。

3、为了证明获得的微电极在实际体系中能够精准测定氧气，将该电极在大鼠2-vo缺血过程内进行活体脑内实时检测，检测脑区为皮层脑区(立体定位：ap；-4.2mm，ml：-2.5mm，v：-1mm)。选用传统pt修饰的碳纤维电极与实施例1所获得的微电极进行同条件对照，通过实际体系中电极电流对比，来证明实施例1的微电极确实拥有高氧气检测选择性。参考图5a和图5b，缺血手术实施时，300s内过氧化氢含量增加，此时微电极与镀铂电极产生完全不同的电极电流响应。由于在体外，微电极对过氧化氢的响应极小，完全不同于镀铂碳纤维电极对过氧化氢的电流响应，因此活体实验的电极电流差异也证实了本发明isas-co/hncs修饰的碳纤维电极能够精准测定氧气含量。

从上述实施例表明，本发明采用的单层疏水修饰层修饰的isas-co/hncs单原子碳纤维电极对活体内氧气的精准测定具有良好的选择性。该微电极从操作上避免了电极重现性低、手工操作复杂等传统碳纤维修饰电极的缺点，从化学设计上解决了传统氧气电极产生具有细胞毒性的过氧化氢、检测不精准的问题。从而本发明有望成为一种既简便又精准的测定氧气的碳纤维微电极，对研究脑内氧气浓度变化及其相关的生理、病理过程有重要意义，在脑神经化学研究领域具有广泛的应用前景。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。