一种检测动物性水产干制品中酸性偶氮类着色剂的液质联用检测方法与流程

本发明属于食品安全检测技术领域，是一种利用液质联用仪测定动物性水产干制品中酸性偶氮类着色剂的方法。

背景技术：

酸性偶氮类着色剂因为分子结构中含有偶氮结构、磺酸基团和酚羟基，亲水性强，着色效果好，在食品加工和工业生产中应用广泛。本研究选取的9种红黄色着色剂中，酸性大红gr是非食用物质，目前尚未有国家规定的标准检测方法，酸性橙ⅱ是卫生部规定的非食用物质，其余7种着色剂可作为食品添加剂在食品加工中使用，但根据gb2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》的规定，在动物性水产干制品中不允许使用该类着色剂。由于动物性水产干制品具有经济价值高、营养丰富的特点，深受消费者欢迎，但也催生了食品生产者违禁违规使用着色剂以提高卖相的现象。

在gb/t9695.6-2008《肉制品胭脂红着色剂测定》和gb5009.35-2016《食品安全国家标准食品中合成着色剂的测定》中，均采用布氏漏斗法进行净化，液相色谱紫外检测器进行测定。但这两项方法均步骤繁杂，工作效率较低，急需对提取和净化方法进行改进，在利用液相色谱法进行多种着色剂的同时检测时，存在分离不完全，无法准确定性等缺陷。高洁等报道利用液相色谱法检测虾仁中的合成色素，其通过对提取剂、nh4ac浓度和离子对种类等因素进行优化，将虾仁中常添加的包括酸性大红gr在内的5种染料完全分离，但是液相色谱法在准确定性方面存在疑问。林慧等利用超高效液相色谱/四极杆-飞行时间质谱建立了102种着色剂的定性筛查谱库，但在准确定量方面略显不足。目前非食用染料的检测以液相色谱和液相色谱-质谱联用仪为主，检测对象主要为饮料、豆制品、面粉等，宁尚勇等采用反相高效液相色谱法检测酸性大红gr等染料的仪器检出限为0.05-10μg/ml，但采用液相色谱-质谱联用法对水产干制品中的酸性偶氮类着色剂进行同时检测，且方法检出限达到0.1～1μg/kg，定量限达到0.25～25μg/kg的，目前还没有报道。徐雪芹等发明了一种纸质食品包装材料中酸性大红gr的测定方法，选用甲醇乙酸水溶液超声萃取样品，过滤膜后直接进入超高效液相色谱-四极杆质谱联用(uplc-ms)进行测定，但是这种前处理方法不适用于动物性水产干制品这类蛋白质含量很高的基质。

技术实现要素：

针对上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于建立动物性水产干制品中酸性偶氮类着色剂的提取、净化和液质联用检测方法。由于酸性偶氮类着色剂在不同ph值时氢键吸附能力随之变化，在提取和净化过程中利用ph值的变化，发挥聚酰胺固相萃取柱高通量的优势，替代传统的布氏漏斗净化法，获得满意的回收率。液质联用检测方法可以对酸性偶氮类着色剂同时进行定性定量分析，获得高灵敏度和准确度。

本发明具体技术方案如下：

本发明的第一个目的是提供一种动物性水产干制品中酸性偶氮类着色剂的液质联用检测方法，将所述方法包括：

s1：将动物性水产干制品样品均质、脱脂处理后，用碱性溶液进行提取，浓缩，得到待净化溶液；

s2：将s1得到的待净化溶液调节ph值至3.0～4.0后，利用聚酰胺固相萃取柱净化，用碱性溶液进行洗脱，定容，备用；优选的，采用200g/l柠檬酸溶液将s1得到的待净化溶液调节ph值至3.0～4.0，促进试液中偶氮类着色剂在聚酰胺spe柱上的吸附；

s3：将s2所得样品用液相色谱-串联四级杆质谱联用仪进行定量检测。

进一步的，所述酸性偶氮类着色剂包括酸性大红gr(cas：5413-75-2)、酸性橙ⅱ(cas：633-96-5)、酸性红(cas：3567-69-9)、苋菜红(cas：633-96-5)、胭脂红(cas：15876-47-8)、诱惑红(cas：25956-17-6)、柠檬黄(cas：1934-21-0)、日落黄(cas：2783-94-0)、新红(cas：220658-76-4)中的一种或多种的混合。

进一步的，s1所述脱脂处理，具体为：采用石油醚对动物性水产干制品样品进行3次脱脂处理；酸性偶氮类着色剂为水溶性偶氮染料，而动物性水产干制品含油脂，在加入水溶性提取液时，易形成油包水结构，影响样品提取率；同时脱脂也是对样品进行初步净化，可以有效避免spe净化小柱堵塞和过载。因此动物性水产干制品样品须进行脱脂处理。

进一步的，s1所述提取，具体为：在脱脂处理所得样品中加入碱性溶液，超声提取5分钟，8000rpm离心5min，取上清液；重复上述步骤2次，合并上清液，得到提取液，所述碱性溶液为体积比7：2：1的乙醇-氨水-水溶液。

优选的，所述提取中，每次加入碱性溶液的量为10ml。

s1所述浓缩，具体为：于60℃氮气吹走提取液中的乙醇和氨，优选的，将所述提取液浓缩至5ml以下。

蛋白质由氨基酸组成，每个氨基酸均含有羟基和氨基，酸性偶氮类着色剂在中性条件下会与蛋白质中的氨基酸分子形成吸附。所以利用乙醇-氨水-水(体积比为7：2：1)的碱性提取液进行提取，可以使酸性偶氮类着色剂分子与蛋白质分子解吸附，在提取液中呈游离状态，而乙醇-氨水-水(体积比为7：2：1)的碱性提取液可以使样品中的酸性偶氮类着色剂充分游离，从而达到最佳提取效果；且于60℃氮气浓缩至5ml以下时回收率均可达到95％以上。

进一步的，s2所述聚酰胺固相萃取柱净化，为先在酸性环境下使着色剂和聚酰胺柱体形成吸附，再在碱性环境下洗脱着色剂；

具体为：先用水活化spe小柱(聚酰胺固相萃取柱)，将调节ph值至3.0～4.0后的所述样品提取液全部转移到聚酰胺固相萃取柱上，分别用水、甲醇-甲酸溶液(体积比6:4)和70℃水淋洗聚酰胺固相萃取柱，以去除天然色素和其他杂质。

s2所述洗脱采用甲醇-1vol％氨水溶液，所述甲醇-1vol％氨水溶液中，甲醇与1vol％氨水溶液的体积比2：8。

进一步的，s2所述定容，具体为：将洗脱液吹至近干后，用体积比2：8为的甲醇-1vol％氨水溶液定容至1ml，用聚四氟乙烯滤头过滤后备用。样品经溶剂提取浓缩后，存在残渣或杂质，采用聚四氟乙烯滤头过滤器对样品进行净化，能够有效防止液相色谱柱堵塞，避免污染串联四级杆质谱，保障筛查结果的准确性，延长仪器使用寿命。

进一步的，s3所述液相色谱条件为：色谱柱为watersacquityuplcrhss-c18(2.1mm×50mm，1.8μm)；柱温40℃；流动相，甲醇(a)和10mm乙酸铵溶液(b)梯度洗脱(0min～2min，10％a；2min～5min，90％a；5min～7min，10％a)；流速0.2ml/min；进样量1μl。

进一步的，s3所述质谱条件：电喷雾离子源(esi)；雾化电压为5500v；离子源温度为550℃；气帘气压力为25psi；辅助加热气gas1压力为50psi；辅助加热气gas2压力为50psi；碰撞气压力为12psi。选择负离子质谱扫描方式；检测方式采用多反应监测模式(multiplereactionmonitoring,mrm)。

进一步的，s3所述定量为外标法定量，具体为：以各物质定量离子在质谱上的响应面积为纵坐标，以标准溶液的浓度为横坐标绘制标准曲线，得到线性方程及相关系数。

进一步的，当使用api5500液相色谱-质谱联用仪时，9种酸性偶氮类着色剂的质谱参数如下表所示：

所述*为定量子离子。

本发明的第二个目的是提供前述动物性水产干制品中酸性偶氮类着色剂的液质联用检测方法在动物性水产干制品中酸性偶氮类着色剂检测中的应用。

进一步的，所述酸性偶氮类着色剂包括酸性大红gr、酸性橙ⅱ、酸性红、苋菜红、胭脂红、诱惑红、柠檬黄、日落黄、新红中的一种或多种的混合。

本发明技术方案所实现的有益效果为：

本发明技术方案特别针对有可能违禁使用或滥用的9种酸性偶氮类着色剂，建立了一种简便快捷、准确有效的检测方法，可用于动物性水产干制品中酸性偶氮类着色剂的检测。对于动物性水产干制品的质量安全控制具有重要的现实意

1、单位时间内样品处理数量提高了至少10倍。本方法以固相萃取法代替布氏漏斗法，以商业化的聚酰胺固相萃取柱代替分散型的聚酰胺粉，既可以保证待处理样品间的平行性，又能发挥固相萃取法高通量的优势。

2、9种酸性偶氮类着色剂的添加回收率达到78.7％-94.2％，相对标准偏差低于7.8％。通过精准控制提取和净化过程中的ph值，并通过降低待净化液中乙醇的浓度(将待净化液体积浓缩至5ml)，有效提高回收率。根据酸性偶氮着色剂含有酚羟基和磺酸基的结构特征，在提取和净化过程中通过ph值变化控制吸附和解吸附，将待测物从样品中充分提取出来，从而获得高回收率。

3、获得了显著优于现行标准或报道的灵敏度。采用液质联用多反应监测模式，结合本研究优化的样品处理方法，实现了对动物性水产干制品中酸性偶氮类着色剂的准确定性和定量测定。其方法检出限达到0.1～1μg/kg，定量限达到0.25～25μg/kg。其中酸性大红gr、酸性橙ⅱ、酸性红的检出限为0.10μg/kg，显著优于文献报道和标准方法的检出限；苋菜红、胭脂红、柠檬黄、日落黄和新红的检出限达到1.0μg/kg，而在现行国家标准gb2009.35-2006中其检出限为0.5mg/kg。

附图说明

图1待净化溶液ph值对回收率的影响(％)

图29种着色剂的多反应监测模式离子色谱图

其中，1号峰为柠檬黄，2号峰为新红，3号峰为苋菜红，4号峰为胭脂红，5号峰为日落黄，6号峰为诱惑红，7号峰为酸性红，8号峰为酸性大红gr，9号峰为酸性橙ⅱ。

具体实施方式

本发明公开了一种利用液质联用仪同时测定动物性水产干制品中9种酸性偶氮类着色剂的方法，本领域技术人员可以参考本文内容，适当改进参数实现。为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1脱脂处理

利用石油醚对动物性水产干制品样品进行3次脱脂处理。因为9种酸性偶氮类着色剂为水溶性偶氮染料，含油脂食品在加入水溶性提取液时，易形成油包水结构，影响样品提取率；同时脱脂也是对样品进行初步净化，可以有效避免spe净化小柱堵塞和过载。所以对于含油脂样品，必须进行脱脂处理。

具体操作为：取干制虾仁样品粉碎均匀后，准确称取试样2.000g(精确至0.001g)于50ml离心管中，向离心管中加入10ml石油醚以去除脂肪，涡旋震荡2分钟后，8000rpm离心5min，弃去石油醚。重复上述步骤3次，将样品中的石油醚吹干。

实施例2提取溶剂选择和验证

提取时先用碱性溶液乙醇-氨水-水[(7：2：1)体积比]进行提取后再将待净化溶液调节至酸性。对提取溶剂进行选择和验证。以酸性大红gr为例，选用5种不同溶剂进行提取，具体操作为：将实施例1脱脂处理所得样品分组，取5组，将5种碱性溶液分别加入各组脱脂处理所得样品中，超声提取5分钟，8000rpm离心5min，取上清液；重复上述步骤2次，合并提取液，结果见表1，可知乙醇-氨水-水[(7：2：1)体积比]的提取效果最好。

其原因是食品中蛋白质由氨基酸组成，每个氨基酸均含有羟基和氨基，9种酸性偶氮类着色剂在中性条件下会与蛋白质中的氨基酸分子形成吸附。所以利用碱性提取液乙醇-氨水-水[(7：2：1)体积比]进行提取，可以使酸性大红gr分子与蛋白质分子解吸附，在提取液中呈游离状态，而乙醇-氨水-水[(7：2：1)体积比]溶液可以使样品中的酸性大红gr分子充分游离，从而达到最佳提取效果。

表15种不同提取溶剂对动物性水产干制品中酸性大红gr的提取效率

实施例3提取液的浓缩体积验证

具体操作为：向实施例1脱脂处理所得样品中加入乙醇-氨水-水溶液(体积比7：2：1)10ml，超声提取5分钟，8000rpm离心5min，取上清液。向沉淀中加入乙醇-氨水-水溶液(体积比7：2：1)10ml进行再次提取，重复上述步骤2次，合并上清液，即为提取液，于60℃氮气吹走乙醇和氨，浓缩至5ml以下。以酸性大红gr为例，对于提取液的浓缩体积进行了验证，验证效果见表2。

表2提取液浓缩体积对动物性水产干制品中酸性大红gr的回收率的影响

从表中数据可以看出，浓缩至10ml时回收率只有32.2％，浓缩至5ml和2ml时回收率均可达到95％以上。分析其原因是经过3次提取获得的提取液合并后约为27ml，固体样品提取液中主要成分为乙醇-氨水-水[(7：2：1)体积比]，经过浓缩，其中的乙醇和氨水挥发后，水的体积约为4.5ml；液体样品提取液经过浓缩，乙醇和氨水优先挥发后，水的体积约为6.5ml。浓缩至10ml时，提取液中还含有约5ml的乙醇，大量乙醇的存在会降低聚酰胺吸附偶氮类着色剂的程度，而浓缩至5ml时乙醇含量极低则影响较小。但是浓缩至2ml耗时较长，时间成本太高，所以选择浓缩至5ml。

实施例4待净化溶液ph值的选择和验证

基于前述分析，为促进试液中偶氮类着色剂在聚酰胺spe柱上的吸附，需要把试液调成酸性环境。用200g/l柠檬酸溶液把试液调节成不同ph值，以酸性大红gr为例，测试其在试液中的回收率，由图1中可以看出在ph值为2和ph值为4时均能获得95％以上的回收率，因此选择采用200g/l柠檬酸溶液将将待净化溶液ph值调节至3.0～4.0之间。

实施例5聚酰胺固相萃取柱净化及洗脱条件选择和验证

用5ml水活化spe小柱(聚酰胺固相萃取柱)，将实施例4中调节ph值至3.0～4.0后的所述样品提取液全部转移到小柱上，分别用10ml水、10ml甲醇-甲酸溶液(体积比6:4)和10ml70℃水淋洗小柱，以去除天然色素和其他杂质。

采用10ml体积比为2：8的甲醇-1vol％氨水溶液洗脱。

将洗脱液吹至近干后，用体积比为2：8的甲醇-1vol％氨水溶液定容至1ml，用聚四氟乙烯滤头过滤后备用。

实施例6聚四氟乙烯过滤器的选择

样品经溶剂提取浓缩后，可能存在一些残渣或杂质，容易导致液相色谱柱堵塞，同时也会污染串联四级杆质谱，影响筛查结果也会损伤仪器，因此需要使用过滤器对样品进行净化。一般实验室常用的过滤器主要有聚醚砜、尼龙和聚四氟乙烯。聚醚砜过滤器是用于过滤水系样品。实验考察尼龙和聚四氟乙烯过滤器对目标化合物的吸附作用。

结果表明，尼龙过滤器对酸性染料、分散染料具有较大的吸附作用，主要是因为其分子结构会与酸性染料、分散染料发生反应；聚四氟乙烯过滤器对染料的吸附作用较小，因此采用聚四氟乙烯过滤器对样品进行净化。

实施例7液相色谱-质谱检测方法的优化

将实施例6所得样品用液相色谱-串联四级杆质谱联用仪进行定量检测。9种着色剂为酸性偶氮类物质，因此选择负离子质谱扫描方式，相应的流动相选择甲醇和10mm乙酸铵溶液进行梯度洗脱。

将watersacquityuplcrhss-c18(2.1mm×50mm，1.8μm)与agilentzorbaxrrhdsb-c18(2.1mm×100mm，1.8μm)色谱柱进行比较，前者具有更广泛的ph耐受性，实验表明其对于9种着色剂可获得尖锐对称、彻底分离的色谱峰(图2)。

液相色谱条件为：色谱柱为watersacquityuplcrhss-c18(2.1mm×50mm，1.8μm)；柱温40℃；流动相，甲醇(a)和10mm乙酸铵溶液(b)梯度洗脱(0min～2min，10％a；2min～5min，90％a；5min～7min，10％a)；流速0.2ml/min；进样量1μl。

质谱条件为：电喷雾离子源(esi)；雾化电压为5500v；离子源温度为550℃；气帘气压力为25psi；辅助加热气gas1压力为50psi；辅助加热气gas2压力为50psi；碰撞气压力为12psi；所述质谱扫描选择负离子质谱扫描方式；所述检测方式采用多反应监测模式。

对9种着色剂在质谱中的定性定量离子对、去簇电压、碰撞电压等参数进行优化和比较，以获得最佳的质谱响应，选择的参数见表3。

表39种着色剂的保留时间及质谱参数(api5500液相色谱-质谱联用仪)

注：*为定量子离子。

实施例89种酸性偶氮类着色剂线性范围、相关系、检出限和定量限的验证

以各物质定量离子在质谱上的响应面积为纵坐标，以标准溶液的浓度为横坐标绘制标准曲线，得到线性方程及相关系数。

在空白样品中添加标准品，以s/n＝3得到方法检出限，以s/n＝10得到方法定量限，结果见表4。酸性橙ⅱ、酸性红1和酸性大红gr在0.1～100μg/l范围内，相关系数(r²)均大于0.998，检出限为和定量限分别为0.10μg/kg和0.25μg/kg。其余6种着色剂在1～1000μg/l范围内，相关系数(r²)均大于0.995，检出限和定量限分别为1.0μg/kg和2.5μg/kg。

表49种着色剂的线性方程、相关系数、检出限和定量限

实施例99种酸性偶氮类着色剂的添加回收率和精密度

在动物性水产干制品中添加浓度为0.25～25μg/kg的9种着色剂，回收率为78.7％～94.2％，相对标准偏差低于7.8％，见表5。

表59种着色剂的添加回收率和精密度(n＝5)