一种分泌蛋白Caspase1在早期心梗诊断试剂中的应用的制作方法

本发明涉及生物医学领域，尤其是涉及分泌蛋白caspase1在早期心梗诊断试剂中的应用。

背景技术：

目前急性心肌梗死(ami)检测的主要生化标志物有肌酸磷酸激酶同工(ck-mb)、乳酸脱氢酶(ldh)、心肌肌钙蛋白(ctnt)和心肌肌钙蛋白i(ctni)等。ck-mb、ldh广泛分布于体内，因此特异性较低，许多疾病都可导致它们的升高，且在血液中维持时间较短；ctnt与骨骼肌肌钙蛋白t(stnt)同源性较高，容易发生交叉反应。而ctni具有特异性高、出现时间早、敏感度高和在血液中持续时间长等优点，可作为ami早期诊断指标，所以目前的试剂盒检测方式主要围绕心肌肌钙蛋白i(ctni)。

心肌肌钙蛋白i(ctni)的检测方法，包括酶联免疫吸附测定(elisa)免疫分析纸条检测等。尽管心肌肌钙蛋白i(ctni)特异性更高，但它的对于心肌损伤的预见性不高。免疫分析试纸条检测，该方法主要采用胶体金免疫层析法或荧光免疫层析法的原理，操作简单、方便快捷但灵敏度较低，准确性低易出现漏检情况。

cn1227533c利用人心肌钙结合蛋白s100a1在心肌梗塞患者血浆中的特异表现，将经标记后的人心肌钙结合蛋白s100a1单克隆或多克隆抗体固定在支持物上作为检测试剂，采用elisa方法或金标法，根据检测试剂与样品中抗原反应后颜色的变化测定血液中抗原一心肌钙结合蛋白s100a1的含量，作出诊断结论。该方法在准确度上还待提高，并且容易出现漏检的情况。

技术实现要素：

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种检测结果精确的分泌蛋白caspase1在早期心梗诊断试剂中的应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明中分泌蛋白caspase1在早期心梗诊断试剂中具有较好的应用，其中分泌蛋白caspase1由casp1基因编码而成，分泌蛋白caspase1的氨基酸序列如附件中seqidno.1所示。该蛋白质的中文名称为半胱氨酸蛋白酶-1，还可称为interleukin-1betaconvertase(il-1bc)或interleukin-1beta-convertingenzyme(ice)。其中casp1基因来自人体。

本发明中分泌蛋白caspase1在早期心梗诊断试剂中的应用，分泌蛋白caspase1的氨基酸序列如seqidno.1所示。

进一步地，心肌损伤后，外周血中分泌蛋白caspase1含量增加。caspase1分泌蛋白可以作为一个重要的蛋白分子标识物，在心梗早期检测疾病的发生。

进一步地，外周血中分泌蛋白caspase1含量由酶联免疫吸附实验获得。

进一步地，所述的免疫吸附实验中采用caspase1作为抗原。

进一步地，所述的免疫吸附实验中使用的caspase1浓度为10～20μg/ml。

进一步地，所述的免疫吸附实验中通过酶标仪测试吸光度来获得分泌蛋白caspase1的浓度。

进一步地，通过caspase1活性检测试剂盒对外周血中分泌蛋白caspase1含量进行检测。

进一步地，所述的caspase1活性检测试剂盒采用分光光度法检测外周血细胞或组织裂解液中caspase1酶活性或纯化的caspase1酶活性，以此得到分泌蛋白caspase1含量的变化趋势。

进一步地，分光光度法检测时选取405nm或400nm处的吸收峰值。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1)应用本发明技术方案的诊断试剂有助于早期诊断，可以反映心肌损伤的严重程度，可以作为早期心梗诊断预测的指标，并且检测方法较为简单易操，并且具有较好的检测灵敏度，具有较小的系统误差，可避免漏检情况，可将casp1基因编码的分泌蛋白caspase1在心肌损伤诊断试剂中的应用进行广泛的推广。

2)利用本发明的试剂盒检测方法简单、成本低、检测结果直接、结果稳定可靠，适用于大规模的筛检和诊断。

附图说明

图1为本发明中心梗模型构建实物图；

图2为本发明中心超检测图中对照组的心超图；

图3为本发明中心超检测图中心梗72小时的心超图；

图4为本发明中massen染色实验中对照组的染色图；

图5为本发明中massen染色实验中心梗72小时的染色图；

图6为本发明中心梗72小时焦亡相关基因gesa分析图；

图7为本发明中心梗72小时相关基因表达热图；

图8为本发明中心梗72小时免疫组化分析图；

图9为本发明中心梗72小时westernblot分析图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例

动物实验建模：在本发明中，为了寻找心肌梗死过程中发生明显变化的蛋白和基因，采用模型鼠c57构建心肌梗死模型。首先采用对冠状动脉中的左前降支进行结扎的方法构建心梗模型，图1为本实施例中的心梗模型构建实物图。结扎之后，可见到心尖部位的心脏组织(白色箭头指示的位置)明显发白，表明手术之后，这一区域心脏供血明显减少，表明模型构建成功。

为了进一步检验建模的效果及准确性，本实施例中对心梗72小时之后的小鼠进行心脏超声检测。心脏超声检测结果显示，心梗72小时之后的小鼠的心脏的收缩能力相比对照组明显减低(见图2的对照小鼠)，图3的心梗小鼠)，因此心梗72小时之后小鼠的心脏的泵血能力大幅下降，使得小鼠的心脏的正常功能受到了显著的影响。

作为本实施例中的进一步测试，本实施例通过massen染色方法检测心梗之后小鼠的心脏的组织变化情况。在小鼠的心脏心梗72小时之后，分别将对照组和心梗组的小鼠心脏组织染色，结果发现，对照组心脏组织心肌细胞整齐排列，可以看到清晰的肌纤维和细胞核(参见图4)，而相反，心梗组的心脏组织心肌细胞排列紊乱，细胞中间出现大量的空隙，部分肌纤维边界模糊和破碎，由此可见，心梗导致心肌细胞的大量死亡和心肌组织的重塑(参见图5)。

然后，本实施中将对照组和心肌组72小时的小鼠的心脏组织进行rna-seq测序，分析表达谱变化。通过gsea聚类分析检测发现，相比于对照组，心梗组中与焦亡相关的基因大量表达，因此可明确地推测在心梗过程中，焦亡可能发挥着重要的作用(见图6)。之后本实施例又采用热图的方法，对焦亡相关的基因进行分别的分析，与之前结果相符的是，在心梗组中，许多基因的表达都显著的上调(见图7)，这些结果证实，在心肌梗死过程中，细胞焦亡发挥着重要的作用。

最后，caspase1是细胞焦亡过程中表达显著升高的一个重要的标识物，本实施例中的图7中可它的表达在心梗发生之后显著升高，为了进一步检测它的变化，本实施例又通过免疫染色的方法(参见图8)和westernblot的方法(参见图9)对它进行检测，结果都证实相比于对照组，它在心梗组中的表达显著上升，这些结果证实，caspase1分泌蛋白可以作为一个重要的蛋白分子标识物，在心梗早期检测疾病的发生。

具体的检测过程：

外周血中分泌蛋白caspase1含量由酶联免疫吸附实验获得，其中免疫吸附实验中采用caspase1作为抗原，使用的caspase1浓度为10～20μg/ml，并通过酶标仪测试吸光度来获得对应的分泌蛋白caspase1的浓度。

a.包被抗原

1)用50mm的碳酸盐包被缓冲液(ph9.6)溶解抗原，使抗原浓度为10-20μg/ml，加100μl/孔到96孔酶标板，3～6℃放置过夜。

2)第二天弃去包被液后，用pbst洗涤2～5次，每孔加入150μl1％bsa35～40℃封闭1小时。

3)pbst洗涤3次后，每孔加入100μl不同倍比稀释度的血清，并加入对照样品，35～40℃孵育2小时。

4)pbst洗涤5次后，加入100μl稀释后的hrp标记的二抗，35～40℃孵育1小时。

5)pbst洗涤5次后，显色剂显色20min后，酶标仪上读取a405或a400吸收值。

b.包被细胞

1)在96孔培养板上接种细胞数为1×104cells/well，35～40℃过夜培养。

2)第二天用pbs洗涤培养板2～3次。

3)加入125μl/well10％formalin(1:10稀释)，室温下固定15min。

4)用ddh2o洗涤培养板3次，并晾干，储藏在0～10℃备用。

5)用pbst洗涤3次，每孔加入150μl1％bsa35～40℃封闭1小时。

6)pbst洗涤3次后，每孔加入100μl不同倍比稀释度的血清，并加入对照样品，35～40℃孵育2小时。

7)pbst洗涤5次后，加入100μl稀释后的hrp标记的二抗，35～40℃孵育1小时。

8)pbst洗涤5次后，显色剂显色20min后，酶标仪上读取a405或a400吸收值。

9)以吸光度od值为纵坐标(y)，相应的待测物质标准品浓度为横坐标(x)，做得相应的曲线，样品的待测物质含量可根据其od值由标准曲线换算出相应的浓度。

最后对照由实验确定心肌损伤程度与分泌蛋白caspase1的检测浓度范围的对应关系，可判断受试者的心肌损伤情况。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>同济大学

<120>一种分泌蛋白caspase1在早期心梗诊断试剂中的应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

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