D-PAS染色相关试剂在诊断肝脏损伤中的用途的制作方法

文档序号：19742878发布日期：2020-01-21 17:45阅读：4427来源：国知局

本发明涉及医学领域，具体涉及d-pas染色相关试剂在诊断肝脏损伤中的用途。

背景技术：

典型药物性肝脏损伤患者诊断依据：(1)应用可疑药物史；(2)临床表现及肝脏生化学异常；(3)影像学表现；(4)肝脏病理学表现。一般情况下，上述四点即可明确诊断，但有时需要借助肝脏病理染色法辅助，常规的染色方法包括：

(1)苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosinstaining)，简称he染色法，苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。胞浆内嗜酸性颗粒呈反光强的鲜红色。

(2)masson三色染色：又称马松染色，是经典结缔组织染色方法，胶原纤维呈蓝色(被苯胺蓝所染)或绿色(被亮绿所染)，肌纤维呈红色(被酸性品红和丽春红所染)，i型、iii型胶原呈绿色。

(3)网状纤维染色：又称嗜银纤维，常用gordonsweet或渡边改良法。网状纤维黑色，核红色。网状纤维主要成分是iii型胶原蛋白，可反映肝脏病变网状支架形态，肝细胞的脱失、增生、结节性病变、肿瘤以及纤维化程度。

(4)红氨酸法：显示肝内铜颗粒沉积部位及程度，呈黑绿色，用于wilson病诊断，此外慢性肝病时，也可见铜染色阳性。

(5)铁染色(普鲁士蓝染色)：显示肝内铁颗粒沉积部位、程度，呈蓝色，显示铁颗粒，用于诊断血色病、酒精性肝病和陈旧性出血灶。

其他免疫染色：乙型肝炎病毒标志物：hbsag和hbcag；胆管染色ck19。

临床常见一些不明原因肝脏损伤患者，多查体或因其他疾病就诊发现肝功能异常，通过血清免疫学检查可除外常见的嗜肝或非嗜肝病毒感染、酒精或非酒精性脂肪性肝病、遗传代谢性肝病等，且患者不具备上述四点依据，上述常规肝脏病理染色法也不能发现特异性改变。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，发明人进行了大量的探索，意外地发现，在肝脏病理常规染色基础上，加用d-pas染色可清楚显示中央静脉周围和/或汇管区的品红色吞噬细胞，可提示近期曾有急性肝细胞坏死。从而完成本发明。

本发明一方面提供了d-pas染色相关试剂在制备用于诊断肝脏损伤的试剂盒中的用途，所述相关试剂包括淀粉酶、pas染色相关试剂。

糖原染色是病理学中常规的染色方法之一，该法常用来显示糖原和其他多糖，该染色液不仅能够显示糖原，还能显示中性黏液性物质和某些酸性物质。

在本发明的一些实施方案中，所述淀粉酶的浓度为1％。

在本发明的另一些实施方案中，所述pas染色相关试剂包括过碘酸和shiff试剂。

过碘酸(又称高碘酸)是一种强氧化剂，它能氧化糖类及有关物质中的1，2-二乙醇基，使之变为二醛，醛与schiff试剂能结合成一种口红化合物，产生紫红色。

在本发明的一些具体实施方案中，所述shiff试剂的配制方法为：1g碱性品红溶于200ml煮沸的蒸馏水中，摇荡5分钟；冷却至60℃左右，过滤，并向滤液中入1mol/lhcl20ml，混匀；冷至25℃时，加2g偏重亚硫酸钠(na2s2o5)；置于带塞的棕色玻璃瓶中，放暗处24小时，保存于冰箱中。

在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒进一步包括肝脏病理常规染色试剂。

在本发明的一些具体实施方案中，所述常规染色选自以下组中的至少一种：he染色、masson三色染色、网状纤维染色、红氨酸法染色、普鲁士蓝染色、免疫组化染色。其中，优选地，所述免疫组化染色选自ck19染色、hbsag染色、hbcag染色中的至少一种。

在本发明中，所述肝脏损伤是指药物或毒物性肝脏损伤。

在本发明的一些实施方案中，利用所述试剂盒对对象肝脏组织进行染色，如果在中央静脉周围和/或汇管区发现品红色蜡质样细胞，则提示药物或毒物性肝脏损伤的发生。

在本发明的一些具体实施方案中，所述利用所述试剂盒对对象肝脏组织进行染色包括以下步骤：

(1)对组织切片进行常规染色；

(2)将组织切片进行pas染色。

优选地，所述d-pas染色方法包括：

(1)将组织切片经淀粉酶37℃消化30min；

(2)对步骤(1)处理过的组织切片进行pas染色。

更优选地，所述pas染色方法包括：

1.脱蜡至水；

2.用1％淀粉酶37℃消化30min；

3.蒸馏水洗片；

4.1％过碘酸氧化液氧化10min；

5.蒸馏水洗片3遍；

6.置schiff试剂中室温染色10～15min；

7.流水冲洗5min；

8.苏木精复染1～2min；

9.自来水冲洗返蓝；

10.常规脱水、透明、封固。

本发明的有益效果

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

利用本发明，对肝脏组织切片加做d-pas染色，可在中央静脉周围和/或汇管区发现品红色蜡质样细胞，提示近期曾有急性肝细胞坏死，并被肝脏kupffer细胞吞噬，有助于提示药物或毒物性肝脏损伤的诊断线索，可以帮助临床确定患者是否有药物、保健品、环境毒物等接触史，有无染发史等，有助于明确肝脏损伤原因，减少临床误诊、漏诊，提高临床诊治水平。

附图说明

图1示出了肝脏病理常规he染色汇管区结果，显示汇管区大量炎细胞浸润。

图2示出了肝脏病理常规he染色中央静脉周围结果，中央静脉周围肝细胞脱失，少数炎细胞浸润。

图3示出肝脏病理d-pas染色汇管区结果，显示汇管区有较多品红色(箭头)吞噬细胞。

图4示出肝脏病理d-pas染色中央静脉周围结果，显示中央静脉周围有较多品红色(箭头)吞噬细胞。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例

本实施例用到的肝脏组织切片来源于：

一、常规染色(he染色)：

1.试剂

苏木精染液：称取苏木精粉0.5g，铵矾24g溶解于70ml蒸馏水中，然后取naio31g，水5ml，再加入甘油30ml和冰醋酸2ml，混合均匀，滤纸过滤，备用。

伊红染液：称取1g水溶性伊红染液，溶于100ml蒸馏水中。

分化液：用70％乙醇配制1％盐酸。

返蓝液：氢氧化氨0.5ml，蒸馏水99.5ml。

系列浓度(95％、85％、75％)的乙醇、二甲苯、中性树胶。

he染色步骤：

1.肝脏组织切片入二甲苯i脱蜡，5min；

2.二甲苯ii脱蜡，5min；

3.二甲苯iii脱蜡，5min；

4.无水乙醇i，1min；

5.无水乙醇ii，30s；

6.95％乙醇，30s；

7.85％乙醇，30s；

8.75％乙醇，30s；

9.自来水冲洗；

10.苏木精染液，5～10min；

11.自来水冲洗；

12.1％盐酸酒精分化数秒(镜下控制)；

13.自来水冲洗；

14.0.5％氨水返蓝数秒；

15.自来水冲洗1min，镜下控制细胞核分化程度；

16.1％伊红染液1～3min；

17.适度自来水洗；

18.85％乙醇脱水10s；

19.95％乙醇脱水10s；

20.95％乙醇脱水10s；

21.无水乙醇i脱水30s；

22.无水乙醇ii脱水30s；

23无水乙醇iii脱水1min；

24.二甲苯i透明1min；

25.二甲苯ii透明1min；

26.二甲苯iii透明1min；

27.中性树胶封固。

d-pas染色：

主要试剂

1.过碘酸氧化液：

hio4·h2o21g，蒸馏水加至100ml。此液溶解后保存于冰箱中待用。

2.schiff试剂：

0.5克碱性品红加入100毫升沸水中，震荡5分钟，使之充分溶解；冷却至50℃后过滤加入10毫升1n盐酸；冷却至25℃，加入0.5～1克偏重硫酸钠；在室温中12～24小时，密封冰箱保存。

1g碱性品红溶于200ml煮沸的蒸馏水中，摇荡5分钟；

冷却至60℃左右，过滤，并向滤液中入1mol/lhcl20ml，混匀；

冷至25℃时，加2g偏重亚硫酸钠(na2s2o5)；

置于带塞的棕色玻璃瓶中，放暗处24小时，保存于冰箱中。

3.苏木精染色液

苏木精2.5g，无水乙醇25ml，硫酸铝钾50g，蒸馏水500ml，氧化汞1.25g，冻乙酸20ml。

a液：将苏木精溶于无水乙醇中，加热至完全溶解。b液：将硫酸铝溶于蒸馏水中加热溶解。a液倒入b液中加热使溶液尽快沸腾，去火缓慢加入氧化汞，防止溶液溢出。然后再煮沸1～2min，立即浸入冷水冷却后备用。临用时加入冰乙酸过滤即可。

4.淀粉酶

将麦芽糖淀粉酶0.1～1.0g溶于0.02mol/l磷酸盐缓冲液(ph6.0)100ml中。

d-pas染色步骤：