一种低溶剂用量快速检测牛奶中多环芳烃的方法与流程

本发明涉及食品安全领域分析方法，尤其是涉及一种低溶剂用量快速检测牛奶中多环芳烃的方法。

背景技术：

多环芳烃(polycyclicaromatichydrocarbons，简称pahs)是一大类常见的有机污染物的总称，其在结构上包含了两个或以上的稠合芳香环，是环境中普遍存在的半挥发性有害物。多环芳烃具有较强的亲脂性，容易在动植物脂肪组织中富集，并进一步随着食物链或食物网逐级向更高级的生物体传递或富集。虽然国内外对牛奶等含脂食品中多环芳烃含量的检测方法已做过相关研究，但大多存在前处理操作复杂、试剂耗费量大、检测时间长、定量不准确等问题。牛奶中含量丰富的脂肪、蛋白质和其乳液的性质也阻碍了多环芳烃的提取和净化。目前，欧盟对于婴儿奶中苯并[a]芘的限量标准已达1μg/kg，这对于前处理与定量检测技术提出了很高的要求。

艾连峰等在《气相色谱-串联质谱法测定牛奶中多氯联苯及多环芳烃》中使用60ml正己烷作为提取溶剂，提取过程中还涉及旋转蒸发、固相萃取柱净化等繁琐的步骤，效率不高。

殷婧在《临汾市食物中多环芳烃的污染特征及暴露风险评价》中使用20ml乙腈结合微波萃取器对牛奶中多环芳烃进行提取。该方法虽然一定程度上提高了提取率，但微波过程的较高温度(100℃)对于轻质多环芳烃存在影响，且另需要硅胶-氧化铝层析柱进行净化，操作时间仍较长。

与传统方法不同，快速、简便、廉价、有效、耐用和安全(quick,easy,cheap,effective,ruggedandsafe，即quechers)方法是最有前途的简单易行和快捷高效提取程序之一，该方法能够减少样品量、有机溶剂以及实验室玻璃器皿的消耗，并符合绿色化学的原则。quechers的原理是基于盐的分散提取(盐析效应)，从复杂基质中分离出多种目标分析物。该方法与色谱技术相结合，已成为一种分析不同类型食品污染物(包括天然或合成添加剂、包装迁移污染物和加工中产生的有害物质)可靠而简单的方法。

技术实现要素：

本发明的目的就是为了克服现有技术存在的耗时长、溶剂用量大的缺陷而提供一种低溶剂用量快速检测牛奶中多环芳烃的方法，该方法的预处理时间大大缩短，有机试剂用量显著减少。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明提供一种低溶剂用量快速检测牛奶中多环芳烃的方法，该方法包括以下步骤：

第一步，采用标准品制作各种多环芳烃的标准曲线；

第二步，利用液液萃取和quechers方法对牛奶中多环芳烃进行提取；

第三步，利用高效脂质定向吸附材料emr-lipid进行净化并浓缩；

第四步，净化处理后的样品经气相色谱-三重四级杆串联质谱检测后，参考第一步制得的标准曲线，得到牛奶中各种多环芳烃的含量。

在本发明的一个实施方式中，第一步中采用标准品制作各种多环芳烃的标准曲线的具体方法如下：

分别以二氯甲烷作为溶剂配制1、2、5、10、30、60、100、200μg/kg共八个水平的多环芳烃标准溶液，分别加入浓度为50μg/kg的氘代苯并[a]芘(bap-d12)标准品作为内标物，以标准溶液中多环芳烃的浓度为纵坐标、以经气相色谱-三重四级杆串联质谱检测并经内部标准校正后多环芳烃的响应值，即峰面积为纵坐标，制成各种多环芳烃的标准曲线。

在本发明的一个实施方式中，所述的多环芳烃包括na(萘)、ap(苊烯)、ac(苊)、f(芴)、ant(蒽)、phe(菲)、fl(荧蒽)、pyr(芘)、baa(苯并[a]蒽)、chr(屈)、bkf(苯并[k]荧蒽)、bbf(苯并[b]荧蒽)、bap(苯并[a]芘)、ip(茚并[1,2,3-cd]芘)、dbaha(二苯并[a,h]蒽)或bghip(苯并[g,h,i]苝)。

在本发明的一个实施方式中，所述的气相色谱-三重四级杆串联质谱检测的条件如下：

色谱柱：安捷伦的db-5ms毛细管色谱柱，色谱柱的规格为30m×0.25mm×0.25μm；

升温程序：80℃保持2min，以20℃/min的速度升至140℃，接着以5℃/min的速度升至310℃；

进样温度、传输线、离子源和四级杆的温度分别为260℃、300℃、230℃和150℃；

进样量：1μl；

载气：氦气(纯度为99.999％)；

载气流速：1ml/min，无分流；

电离方式：ei+，70ev；

光电倍增管电压：1506v；

扫描方式：全扫描，33-300amu，采用多重反应检测(mrm)；

选择离子监测：128、152、154、166、178、202、228、252、276、278。

在本发明的一个实施方式中，第二步中利用液液萃取和quechers方法对牛奶中多环芳烃进行提取的具体方法如下：

(1)液液萃取：在50ml第一离心管中准确称取约5g牛奶，加入10ml乙腈：丙酮混合溶剂并充分混合，将第一离心管在涡流振荡器上涡流振荡1min，后进行超声水浴；

(2)quechers提取：将安捷伦quechers萃取盐包(aoac法，含6g硫酸镁和1.5g乙酸钠)和陶瓷均质子加入第一离心管，涡流振荡1min，而后置于高速冷冻离心机中进行第一次离心。

优选地，牛奶与乙腈：丙酮混合溶剂的总用量之比为5g:10ml。

优选地，乙腈：丙酮混合溶剂的体积比为3:2。

优选地，超声水浴时间为30min；

优选地，第一次离心速度、温度和时间分别为8000rpm、4℃和10min。

在本发明的一个实施方式中，第三步中利用高效脂质定向吸附材料emr-lipid进行净化并浓缩的具体方法如下：

将5ml水加入到含有安捷伦quechersdspeemr-lipid(含1g吸附剂)的第二离心管中，涡流振荡3s以活化吸附剂，将第一离心管中的上清液5ml加入到已活化的第二离心管中，涡流振荡1min，而后置于高速冷冻离心机中进行第二次离心；

将第二离心管中的全部上清液加入到含有quechersemr-lipidpolish的第三离心管中，第三离心管的quechersemr-lipidpolish含1.6g硫酸镁和0.4g氯化钠，快速剧烈震荡并涡流振荡1min，将第三离心管置于高速冷冻离心机中进行第三次离心，而后取上清液4ml转移至已称量的玻璃管中并在20℃氮气流中浓缩至约20mg。

优选地，第二次离心速度、温度和时间分别为8000rpm、4℃和15min。

优选地，第三次离心速度、温度和时间分别为10000rpm、4℃和20min。

目前，对于含脂食品中多环芳烃的提取主要以gb/t24893-2010《动植物油脂多环芳烃的测定》(iso15753)为参考依据。简言之，其采用两步乙腈：丙酮(3:2)液液萃取和两步c18柱和佛罗里硅土柱固相萃取对多环芳烃进行提取和净化。以六个实验样品为一批次，约需要600ml有机溶剂(每个样品约100ml)，整个预处理过程接近九小时。与之对比的是，本发明对于每批次实验样品仅需要60ml有机溶剂(每个样品10ml)，整个预处理过程仅三小时。此外，本发明对于复杂基质具有良好的清除作用，针对保留时间大于36min的大分子量化合物具有更优的清除效果。

总而言之，本发明采用quechers方法提高了处理效率，采用高效脂质定向吸附材料emr-lipid增强了复杂基质清除能力，相比其他方法节省了时间、减少了有机溶剂的使用和废物的产生，对于富集牛奶等含脂食品中的痕量分析物应用前景广阔。

本发明基于quechers方法结合高效脂质定向吸附材料emr-lipid，对牛奶中脂质干扰物吸附能力强，且整个方法溶剂用量少、时间快，符合绿色环保的要求，满足μg/kg(ppb)级别多环芳烃的快速高效定量检测。

附图说明

图1为16种多环芳烃标准品(200μg/kg)和氘代苯并[a]芘内标(50μg/kg)的色谱图；

图2为图1中a处放大示意图；

图3为实施例1的牛奶中16种多环芳烃的色谱图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

以下实施例中，所有试剂均是hplc级。

实施例1

第一步，制作各种多环芳烃的标准曲线，具体步骤包括：

1.1分别以二氯甲烷作为溶剂配制1、2、5、10、30、60、100、200μg/kg共八个水平的多环芳烃标准溶液，分别加入浓度为50μg/kg的氘代苯并[a]芘(bap-d12)标准品作为内标物。以标准溶液中多环芳烃的浓度为纵坐标、以经气相色谱-三重四级杆串联质谱检测并经内部标准校正后多环芳烃的响应值(峰面积)为纵坐标，制成各种多环芳烃的标准曲线。以每种化合物信噪比(s/n＝3)时的标准品浓度确定为方法检出限，以信噪比(s/n＝10)时的标准品浓度确定为方法定量限。

1.2所述的气相色谱-三重四级杆串联质谱检测的条件如下：

色谱柱：安捷伦的db-5ms毛细管色谱柱，色谱柱的规格为30m×0.25mm×0.25μm；

升温程序：80℃保持2min，以20℃/min的速度升至140℃，接着以5℃/min的速度升至310℃；

进样温度、传输线、离子源和四级杆的温度分别为260℃、300℃、230℃和150℃；

进样量：1μl；

载气：氦气(纯度为99.999％)；

载气流速：1ml/min，无分流；

电离方式：ei+，70ev；

光电倍增管电压：1506v；

扫描方式：全扫描，33-300amu，采用多重反应检测(mrm)；

选择离子监测：128、152、154、166、178、202、228、252、276、278；

16种多环芳烃的色谱-质谱检测参数如下表1所示。16种多环芳烃的标准曲线线性、检出限和定量限如下表2所示。16种多环芳烃标准品(200μg/kg)和氘代苯并[a]芘内标(50μg/kg)的色谱图如图1、图2所示。可见，本实施例对于16种多环芳烃的检出限为0.08-0.14μg/kg，定量限为0.26-0.46μg/kg，并且各物质的色谱分离度高，符合痕量物质的定性定量检测要求。

表116种多环芳烃的色谱-质谱检测参数

表216种多环芳烃的标准曲线线性、检出限和定量限

第二步，利用液液萃取和quechers方法对牛奶中多环芳烃进行提取，具体步骤包括：

2.1液液萃取

在50ml离心管(以下简称“管①”)中准确称取约5g牛奶，加入10ml乙腈：丙酮(3:2，v/v)并充分混合。将管①在涡流振荡器上涡流振荡1min，超声水浴30min。

2.2quechers提取

将安捷伦quechers萃取盐包(aoac法，含6g硫酸镁和1.5g乙酸钠)和陶瓷均质子加入管①，涡流振荡1min，而后置于高速冷冻离心机中以8000rpm、4℃低温离心10min。

第三步，利用高效脂质定向吸附材料emr-lipid进行净化并浓缩，具体步骤包括：

将5ml水加入到安捷伦quechersdspeemr-lipid(含1g吸附剂，以下简称“管②”)，涡流振荡3s以活化吸附剂。将管①中的上清液5ml加入到已活化的管②中，涡流振荡1min，而后置于高速冷冻离心机中以8000rpm、4℃低温离心15min。将管②中的全部上清液加入到quechersemr-lipidpolish(含1.6g硫酸镁和0.4g氯化钠，以下简称“管③”)，快速剧烈震荡并涡流振荡1min。将管③置于高速冷冻离心机中以10000rpm、4℃低温离心20min，而后取上清液4ml转移至已称量的玻璃管中并在20℃氮气流中浓缩至约20mg。

第四步，净化处理后的样品经气相色谱-三重四级杆串联质谱检测后，参考第一步制得的标准曲线，得到牛奶中各种多环芳烃的含量。

本实施例中，牛奶中16种多环芳烃的色谱图如图3所示。可见，本实施例对于食品中脂质等复杂基质的清除能力好，主要目标物质响应高，未见明显基线噪音、漂移等现象，可用于准确定量分析。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。