固体支持物包被产物及其制备方法、应用和产品与流程

1.本发明涉及免疫检测领域，具体而言，涉及一种固体支持物包被产物及其制备方法、应用和产品。


背景技术：

2.固体支持物又称固相载体或固相，在免疫检测中，固体支持物上包被有允许特异性结合的部分，以实现目的检测物的捕获与分离。固体支持物的材质例如是塑料(如聚苯乙烯、聚氯乙烯)、衍生化的塑料、磁性或非磁性金属、玻璃或硅，固体支持物的构型例如微粒、珠子、试管、微孔滴定板、比色皿、膜、支架分子、薄膜、滤纸、圆盘或芯片。目前免疫检测中常用的固相支持物有磁性微球(磁珠)、微孔滴定板、硝酸纤维素膜、聚苯乙烯胶乳等。
3.以磁性微球为例，它是一种均匀、具有超顺磁性及保护性壳的球形小粒子，基本上由载体微球和配基结合而成。其核心为顺磁性粒子，核心外层包裹一层高分子，最外层是配基，配基的作用是与目标分子上的活性基团进行偶联，实现目标分子在固相载体上的包被。通常目标分子为特异性结合对成员之一，特异性结合对例如抗原和抗体，生物素或其衍生物和抗生物素蛋白或其衍生物，碳水化合物和凝集素，互补的核苷酸序列、效应物和受体分子、辅因子和酶、酶抑制剂和酶，地高辛和地高辛配基。以双抗体夹心法检测抗原为例，在磁性微球上包被抗体，通过加入含抗原的待测样本，可检测标记物标记的抗体，形成磁性微球-抗体-待检抗原-抗体-可检测标记物复合物，此复合物在外加磁场的作用下发生定向移动，从而达到分离和检测待检抗原的目的。
4.此外，磁珠的制备通常是在磁珠最外层偶联上功能基团如羟基(-oh)、氨基(-nh2)、醛基(-cho)、羧基(-cooh)、甲苯磺酰基、巯基(-sh)、硅基等，再与目标分子的基团进行偶联；常用的磁珠包被方法包括物理吸附、共价偶联、亲和偶联、蛋白a/蛋白g定向偶联等方法。其中，物理吸附是通过静电吸附，疏水作用等分子间作用力将抗体固定在磁珠表面；共价偶联是通过特定的化学试剂对抗体蛋白或固相表面官能团进行处理，通过共价键将抗体固定在基底表面；亲和偶联最经常应用的是链霉亲和素-生物素体系，将链霉亲和素与磁珠共价偶联，再与生物素标记的抗体形成复合物；蛋白a/蛋白g定向偶联是利用蛋白a和蛋白g能够特异性结合蛋白fc端，将蛋白a或蛋白g偶联到磁珠上。
5.然而，不管是哪种偶联方式，固体支持物与目标分子偶联后，可能会出现某些性能不理想的问题，如临床特异性差、包被产物稳定性差、cv值高(如跳孔)等等，所以，提高包被产物性能具有重要意义。
6.有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

7.本发明的第一目的在于提供一种固体支持物包被目标分子的方法。
8.本发明的第二目的在于提供上述方法得到的包被产物。
9.本发明的第三目的在于提供包被产物在制备免疫诊断试剂中的应用。
10.本发明的第四目的在于提供含有本发明提供的包被产物的试剂盒。
11.为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
12.一种固体支持物包被目标分子的方法，将目标分子与惰性蛋白共包被在固体支持物上，得到包被产物。
13.例如所述惰性蛋白包括牛血清白蛋白、血蓝蛋白、卵清蛋白、酪蛋白、组蛋白、脱脂奶粉、多聚赖氨酸、明胶或胰蛋白胨。
14.进一步地，所述目标分子包括特异性结合对的成员之一，所述特异性结合对包括抗原和抗体，生物素及其衍生物和抗生物素蛋白及其衍生物，碳水化合物和凝集素，互补的核苷酸序列，效应物和受体分子，辅因子和酶，酶抑制剂和酶，或者，地高辛和地高辛配基。
15.进一步地，所述固体支持物的材质例如是塑料、衍生化的塑料、磁性或非磁性金属，或者，玻璃或硅；
16.所述固体支持物的构型例如是微粒、珠子、试管、微孔滴定板、比色皿、膜、支架分子、滤纸、圆盘或芯片；
17.所述固体支持物例如是磁性微粒、微孔滴定板、硝酸纤维素膜或聚苯乙烯胶乳；
18.磁性微粒例如是羧基磁珠、氨基磁珠、nhs磁珠、羟基磁珠、甲苯磺酰基磁珠或环氧基磁珠。
19.进一步地，目标分子和惰性蛋白的质量比为(1-8)：1。
20.进一步地，对固体支持物进行活化后，和/或，对目标分子和惰性蛋白进行活化后，再将目标分子与惰性蛋白共包被在固体支持物上；
21.进一步地，共包被后还包括封闭的步骤，再得到包被产物。
22.上述的方法制备得到的包被产物。
23.上述的包被产物在免疫诊断或制备免疫诊断试剂中的应用。
24.进一步地，所述免疫诊断包括感染性疾病相关抗原或特异性结合抗原的抗体免疫检测、心肌标志物免疫检测、肿瘤相关标志物免疫检测、炎症标志物免疫检测或内分泌相关抗原免疫检测；
25.优选地，所述感染性疾病包括病毒感染疾病、细菌感染疾病、真菌感染疾病、衣原体感染疾病、支原体感染疾病或寄生虫感染疾病；
26.优选地，所述感染性疾病相关抗原包括艾滋病毒抗原、甲型肝炎病毒抗原、乙型肝炎病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原、丁型肝炎病毒抗原、戊型肝炎病毒抗原、庚型肝炎病毒抗原、风疹病毒抗原、人巨细胞病毒抗原、单纯疱疹病毒1型抗原、单纯疱疹病毒2型抗原、狂犬病毒抗原、人类t淋巴细胞白血病病毒抗原、登革热病毒抗原、人乳头瘤病毒抗原、西尼罗河病毒抗原、森林脑炎病毒抗原、麻疹病毒抗原、流感病毒抗原、副流感病毒抗原、水痘病毒抗原、艾柯病毒型抗原、柯萨奇病毒抗原、乙型脑炎病毒抗原、柯萨奇病毒抗原、eb病毒抗原、腮腺炎病毒抗原、梅毒螺旋体抗原、包柔氏螺旋体抗原、沙眼衣原体抗原、肺炎衣原体抗原、鹦鹉热衣原体抗原、解脲脲原体抗原、肺炎支原体抗原、结核分枝杆菌抗原、幽门螺旋杆菌抗原、淋球菌抗原、疟原虫抗原、枯氏锥虫抗原或弓形虫抗原；
27.优选地，所述心肌标志物包括肌钙蛋白、肌红蛋白、肌酸激酶同工酶、n末端脑钠肽前体、心脏型脂肪酸结合蛋白、d-二聚体、脂蛋白相关磷脂酶a2、髓过氧化物酶或生长刺激表达基因2蛋白；
28.优选地，肿瘤相关标志物包括：胃泌素释放肽前体、糖类抗原、细胞角质蛋白19、附睾蛋白4、甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特异性抗原、鳞状细胞癌抗原或人前列腺特异性基因1；
29.优选地，炎症标志物包括c反应蛋白、降钙素原、白细胞介素6、血清淀粉样蛋白a、α-抗胰蛋白酶、α-酸性糖蛋白、铜蓝蛋白、结合珠蛋白、c1酯酶抑制剂或α2-巨球蛋白。
30.一种试剂盒，包括上述的包被产物。
31.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
32.本发明提供一种固体支持物包被目标分子的方法，将目标分子与惰性蛋白共包被在固体支持物上，得到包被产物。该方法通过引入惰性蛋白与目标分子共包被可以通过包被竞争关系减少固体支持物与目标分子的不正确偶联，如降低目标分子在固体支持物表面的互相遮挡，利于在固体支持物表面形成目标分子-惰性蛋白-目标分子-惰性蛋白的相间排列形式，使目标分子偶联到固体支持物上的结构更正确，同时降低活化剂对目标分子的影响，减少包被过程中由于活化剂的参与产生的化学反应或包被缓冲液剧烈的变化对目标分子结构及稳定性的影响，提高有效偶联效率及包被产物的稳定性。
33.利用上述方法制备得到包被产物，应用于免疫检测中，能够改善临床特异性，稳定性和重复性。
具体实施方式
34.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
35.除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
36.一种固体支持物包被目标分子的方法，将目标分子与惰性蛋白共包被在固体支持物上，得到包被产物。
37.该方法引入惰性蛋白，与目标分子共包被于固体支持物上，可以通过包被竞争的方式减少固体支持物与目标分子的不正确偶联，如降低目标分子在固体支持物表面的互相遮挡，利于在固体支持物表面形成目标分子-惰性蛋白-目标分子-惰性蛋白的相间排列形式，使目标分子偶联到固体支持物上的结构更正确，同时降低活化剂对目标分子的影响，减少包被过程中由于活化剂的参与产生的化学反应或包被缓冲液剧烈的变化对目标分子结构及稳定性的影响，提高有效偶联效率及包被产物的稳定性。由此得到的包被产物，应用于免疫检测中，能够改善临床特异性，稳定性和重复性。
38.需要说明的是，本发明中“共包被”是指目标分子与惰性蛋白作为包被物，同时包被在同一固体支持物上，例如，将目标分子和惰性蛋白混合，与固体支持物进行包被反应。本发明中的目标分子和固体支持物的包被反应可以是本领域常规的包被技术方案，在此并不作特定的限定。固体支持物例如磁珠包被产物的制备过程中，可以将惰性蛋白与目标分子的混合物，与磁珠进行包被。
39.本发明中的惰性蛋白是指不与免疫反应体系发生反应的蛋白，例如可以但不限于牛血清白蛋白、血蓝蛋白、卵清蛋白、酪蛋白、组蛋白、脱脂奶粉、多聚赖氨酸、明胶或胰蛋白
胨等等。
40.本发明中目标分子为本领域常规的与固体支持物进行包被的物质，可以为特异性结合对的成员之一，特异性结合对例如可以为抗原和抗体，生物素及其衍生物和抗生物素蛋白及其衍生物，碳水化合物和凝集素，互补的核苷酸序列，效应物和受体分子，辅因子和酶，酶抑制剂和酶，或者，地高辛和地高辛配基等等。可以理解的是，本发明中“目标分子为特异性结合对的成员之一”是指，例如该特异性结合对为抗原和抗体时，目标分子为抗原或抗体，即可以为抗原，也可以为抗体；例如该特异性结合对为碳水化合物和凝集素时，目标分子为碳水化合物或凝集素，即可以为碳水化合物，也可以为凝集素。
41.本发明中的固体支持物是指本领域常用的固相载体，材质例如可以是塑料(例如聚苯乙烯、聚氯乙烯等等)、衍生化的塑料、磁性或非磁性金属、玻璃或硅等等；构型例如可以是微粒、珠子、试管、微孔滴定板、比色皿、膜、支架分子、滤纸、圆盘或芯片等等；固体支持物例如可以为本领域常用的磁性微球(磁珠)、微孔滴定板、硝酸纤维素膜、聚苯乙烯胶乳等等。固体支持物为磁性微粒，例如是羧基磁珠、氨基磁珠、nhs磁珠、羟基磁珠、甲苯磺酰基磁珠或环氧基磁珠。
42.在优选地实施方式中，目标分子和惰性蛋白的质量比为(1-8)：1。目标分子和惰性蛋白的质量比典型但非限制性的为1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1或8:1。
43.在优选地实施方式中，目标分子与固体支持物的配比可以采用本领域常规的用量，在此不作特定的限定。优选地，目标分子与固体支持物的质量比为1：(10-100)，进一步为1：(45-55)。目标分子与固体支持物的质量比典型但非限制性的为1:10、1:20、1:30、1:40、1:45、1:47、1:50、1:52、1:55、1:60、1:70、1:80、1:90或1:100。
44.在优选地实施方式中，对固体支持物进行活化后，和/或，对目标分子和惰性蛋白进行活化后，再将目标分子与惰性蛋白共包被在固体支持物上。在目标分子和惰性蛋白共包被在固体支持物上之前，还包括将固体支持物活化，或，将目标分子和惰性蛋白活化，或，将固体支持物、目标分子和惰性蛋白三者均进行活化的步骤。
45.在优选地实施方式中，目标分子与惰性蛋白共包被在固体支持物上后，还包括对固体支持物进行封闭的步骤，再得到包被产物。本发明中封闭可以为本领域常规的封闭方法，在此不做特定的限定，优选为使用牛血清白蛋白、明胶或酪蛋白等等对固体支持物进行封闭。
46.本发明利用上述方法制备得到包被产物，应用于免疫检测中，能够改善临床特异性，稳定性和重复性。
47.上述包被产物在免疫诊断或制备免疫诊断试剂中的应用。
48.在优选地实施方式中，免疫诊断包括感染性疾病相关抗原或特异性结合抗原的抗体免疫检测、心肌标志物免疫检测、肿瘤相关标志物免疫检测、炎症标志物免疫检测或内分泌相关抗原免疫检测。
49.优选地，感染性疾病包括病毒感染疾病、细菌感染疾病、真菌感染疾病、衣原体感染疾病、支原体感染疾病或寄生虫感染疾病。
50.优选地，感染性疾病相关抗原包括艾滋病毒抗原、甲型肝炎病毒抗原、乙型肝炎病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原、丁型肝炎病毒抗原、戊型肝炎病毒抗原、庚型肝炎病毒抗原、风疹病毒抗原、人巨细胞病毒抗原、单纯疱疹病毒1型抗原、单纯疱疹病毒2型抗原、狂犬病毒
抗原、人类t淋巴细胞白血病病毒抗原、登革热病毒抗原、人乳头瘤病毒抗原、西尼罗河病毒抗原、森林脑炎病毒抗原、麻疹病毒抗原、流感病毒抗原、副流感病毒抗原、水痘病毒抗原、艾柯病毒型抗原、柯萨奇病毒抗原、乙型脑炎病毒抗原、柯萨奇病毒抗原、eb病毒抗原、腮腺炎病毒抗原、梅毒螺旋体抗原、包柔氏螺旋体抗原、沙眼衣原体抗原、肺炎衣原体抗原、鹦鹉热衣原体抗原、解脲脲原体抗原、肺炎支原体抗原、结核分枝杆菌抗原、幽门螺旋杆菌抗原、淋球菌抗原、疟原虫抗原、枯氏锥虫抗原或弓形虫抗原。
51.优选地，心肌标志物包括肌钙蛋白、肌红蛋白、肌酸激酶同工酶、n末端脑钠肽前体、心脏型脂肪酸结合蛋白、d-二聚体、脂蛋白相关磷脂酶a2、髓过氧化物酶或生长刺激表达基因2蛋白。
52.优选地，肿瘤相关标志物包括：胃泌素释放肽前体、糖类抗原、细胞角质蛋白19、附睾蛋白4、甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特异性抗原、鳞状细胞癌抗原或人前列腺特异性基因1。
53.优选地，炎症标志物包括c反应蛋白、降钙素原、白细胞介素6、血清淀粉样蛋白a、α-抗胰蛋白酶、α-酸性糖蛋白、铜蓝蛋白、结合珠蛋白、c1酯酶抑制剂或α2-巨球蛋白。
54.本发明最后提供含有上述包被产物的试剂盒。
55.下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
56.实施例1 hiv项目用羧基磁珠的包被
57.1)hiv-i(菲鹏生物)2mg/ml
×
1.0ml透析至活化缓冲液(50mm mes ph5.5)；
58.2)取磁珠merck em1-100/40 0.1ml(100mg/ml,10mg)，用活化缓冲液(50mm mes ph5.5)洗涤3次，每次2ml，最后加1ml活化缓冲液，超声分散；
59.3)称取3mg edc，用0.3ml活化缓冲液(2-8℃预冷)溶解至10mg/ml，得到活化剂。立刻在振荡条件下往磁珠混合液中加入0.2ml活化剂(约100mm的edc)，充分混匀，室温旋转(30rpm)反应0.5-1小时，磁分离，弃去上清，再用0.5ml的ph5.5的50mm mes重悬活化羧基磁珠；
60.4)取0.2mg的hiv-i抗原，加入到2ml的ph5.5的50mm mes中，然后加入10μl的10mg/ml的bsa水溶液，混匀得到目标分子和惰性蛋白的混合液；
61.5)将步骤3)中重悬的活化羧基磁珠与步骤4)中的混合液进行混合，室温反应2小时；
62.6)用洗涤液(50mm tris-hcl，150mm nacl，0.05％tween-20，0.1％proclin 300，ph7.4)洗2次，每次3ml；加3ml封闭液(洗涤液+1％bsa)，室温反应2小时；
63.7)用洗涤液洗3次，每次3ml；最后加1ml羧基磁珠保存液重悬，终浓度10mg/ml固体含量。2～8℃保存。
64.实施例2 tp项目用氨基磁珠的包被
65.1)、取10mg氨基磁珠(merck)用1
×
pbs洗3次，加0.9ml 1
×
pbs重悬为10mg/ml。称好smcc((n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯)，用dmf(n,n-二甲基甲酰胺)溶解为12mm/l；称取2mg 2it(2-亚氨基硫烷盐酸盐，2-iminothiolane hcl)、用1
×
pbs溶解成10mm/l。加100μl smcc于重悬的氨基磁珠中混匀，取2it溶液10μl加入到上述氨基磁珠混合液中，混匀25℃旋转孵育30min。
66.2)取0.2mg的tp-17抗原，加入到1ml的1
×
pbs中，然后加入10μl的10mg/ml的bsa水溶液，混匀得到目标分子和惰性蛋白的混合液；
67.3)将活化好的氨基磁珠用1
×
pbs清洗1次，加0.5ml的1
×
pbs重悬。
68.4)将步骤2)中的混合液与步骤3)中的活化氨基磁珠混合、混匀，室温孵育2小时；
69.5)用洗涤液(50mm tris-hcl+150mm nacl+0.05％tween-20+0.1％proclin 300,ph7.4)洗2次，每次3ml；加3ml封闭液(洗涤液+1％bsa)，室温反应2小时；
70.6)用洗涤液洗3次，每次3ml；最后加1ml氨基磁珠保存液重悬，终浓度10mg/ml固体含量。2～8℃保存。
71.实施例3 hiv项目用羧基磁珠的包被
72.本实施例的磁珠包被产物的制备方法可以参见实施例1中的步骤，不同点在于步骤4)：取0.2mg的hiv-i抗原，加入到2ml的ph5.5的50mm mes中，然后加入20μl的10mg/ml的bsa水溶液，混匀得到目标分子和惰性蛋白的混合液。
73.实施例4 hiv项目用羧基磁珠的包被
74.本实施例的磁珠包被产物的制备方法可以参见实施例1中的步骤，不同点在于步骤4)：取0.2mg的hiv-i抗原，加入到2ml的ph5.5的50mm mes中，然后加入2.5μl的10mg/ml的bsa水溶液，混匀得到目标分子和惰性蛋白的混合液。
75.实施例5 tp项目用氨基磁珠的包被
76.本实施例的磁珠包被产物的制备方法可以参见实施例2中的步骤，不同点在于步骤2)：取0.2mg的tp-17抗原，加入到1ml的1
×
pbs中，然后加入20μl的10mg/ml的bsa水溶液，混匀得到目标分子和惰性蛋白的混合液。
77.实施例6 tp项目用氨基磁珠的包被
78.本实施例的磁珠包被产物的制备方法可以参见实施例2中的步骤，不同点在于步骤2)：取0.2mg的tp-17抗原，加入到1ml的1
×
pbs中，然后加入2.5μl的10mg/ml的bsa水溶液，混匀得到目标分子和惰性蛋白的混合液。
79.实施例7 hiv项目用羧基磁珠的包被
80.本实施例的磁珠包被产物的制备方法可以参见实施例1中的步骤，不同点在于步骤4)：取0.2mg的hiv-i抗原，加入到2ml的ph5.5的50mm mes中，然后加入10μl的10mg/ml的酪蛋白水溶液，混匀得到目标分子和惰性蛋白的混合液。
81.实施例8 tp项目用氨基磁珠的包被
82.本实施例的磁珠包被产物的制备方法可以参见实施例2中的步骤，不同点在于步骤2)：取0.2mg的tp-17抗原，加入到1ml的1
×
pbs中，然后加入10μl的10mg/ml的明胶水溶液，混匀得到目标分子和惰性蛋白的混合液。
83.对比例1 hiv项目用羧基磁珠的包被
84.1)hiv-i(菲鹏生物自产)2mg/ml
×
1.0ml透析至活化缓冲液(50mm mes ph5.5)；
85.2)取磁珠merck em1-100/40 0.1ml(100mg/ml,10mg)，用活化缓冲液(50mm mes ph5.5)洗涤3次，每次2ml，最后加1ml活化缓冲液，超声分散；
86.3)称取3mg edc，用0.3ml活化缓冲液(2-8℃预冷)溶解至10mg/ml，得到活化剂。立刻在振荡条件下往磁珠混合液中加入0.2ml活化剂(约100mm的edc)，充分混匀，室温旋转(30rpm)反应0.5-1小时，磁分离，弃去上清，再用0.5ml的ph5.5的50mm mes重悬活化羧基磁
珠；
87.4)取0.2mg的hiv-i抗原，加入到2ml的ph5.5的50mm mes中，混匀；
88.5)将步骤3)中重悬的活化羧基磁珠与步骤4)中的混合液进行混合，室温反应2小时；
89.6)用洗涤液(50mm tris-hcl，150mm nacl，0.05％tween-20，0.1％proclin 300，ph7.4)洗2次，每次3ml；加3ml封闭液(洗涤液+1％bsa)，室温反应2小时；
90.7)用洗涤液洗3次，每次3ml；最后加1ml羧基磁珠保存液重悬，终浓度10mg/ml固体含量。2～8℃保存。
91.对比例2 tp项目用氨基磁珠的包被
92.1)、取10mg氨基磁珠(merck)用1
×
pbs洗3次，加0.9ml 1
×
pbs重悬为10mg/ml。称好smcc((n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯)，用dmf(n,n-二甲基甲酰胺)溶解为12mm/l；称取2mg 2it(2-亚氨基硫烷盐酸盐，2-iminothiolane hcl)、用1
×
pbs溶解成10mm/l。加100μl smcc于重悬的氨基磁珠中混匀，取2it溶液10μl加入到上述氨基磁珠混合液中，混匀25℃旋转孵育30min。
93.2)取0.2mg的tp-17抗原，加入到1ml的1
×
pbs中，混匀；
94.3)将活化好的氨基磁珠用1
×
pbs清洗1次，加0.5ml的1
×
pbs重悬。
95.4)将步骤2)中的混合液与步骤3)中的活化氨基磁珠混合、混匀，室温孵育2小时；
96.5)用洗涤液(50mm tris-hcl+150mm nacl+0.05％tween-20+0.1％proclin 300,ph7.4)洗2次，每次3ml；加3ml封闭液(洗涤液+1％bsa)，室温反应2小时；
97.6)用洗涤液洗3次，每次3ml；最后加1ml氨基磁珠保存液重悬，终浓度10mg/ml固体含量。2～8℃保存。
98.试验例1 临床特异性
99.评价方法：将实施例1-2(本发明工艺)和对比例1-2(现有技术工艺)中的磁珠包被产物分别搭配相应的吖啶酯标记物工作液利用双抗原夹心法进行血清样本对比。
100.采用磁微粒化学发光的形式检测、依据双抗原夹心检测抗体的原理、用包被好的磁珠配置成工作液、阳性质控品、阴性质控品、其他临床标本、吖啶酯标记物工作液。实验流程：反应杯中加入100μl标本(阳性质控、阴性质控、临床标本)、50μl磁珠工作液混匀温育15min/磁分离后、用1
×
pbst清洗液洗涤4次/加入100μl吖啶酯工作液、震荡混匀后37度温育10min/磁分离后、用1
×
pbst清洗液洗涤4次/加入100μl激发液a、加入100μl激发液b、利用发光仪测试发光值。
101.结果如下:
[0102][0103]
由以上数据得出结论：本发明提供的磁珠包被目标分子的方法所得的磁珠包被产
物在hiv、tp项目的临床特异性上有显著的改善，假阳检出率明显降低。
[0104]
试验例2 稳定性
[0105]
评价方法：将实施例1-8和对比例1-2得到的磁珠包被产物均配置成工作液，即用磁珠包被产物保存液稀释40倍，每个样本均独立地分装成3个管子，每管4ml。分别标注2-8℃存放(作为考核的对照)、37度3天(第4天放入37度恒温箱)、37度7天(0天放入37度恒温箱)进行热稳定性加速考核。第七天取出37度的3天和7天的样品，与2-8℃样品平衡到室温进行检测，同步测试活性，方法同试验例1。
[0106]
由以下数据得出结论：本发明提供的磁珠包被目标分子的方法得到的磁珠包被产物在hiv、tp两个项目的磁珠包被产物稳定性上有提高。
[0107]
[0108][0109][0110]
试验例3 重复性
[0111]
方法：将阴性质控、阳性质控分别12孔重复加样进行试验、测试孔间重复性即孔间cv，测试方法同试验例1。由以下数据可得出结论，本发明提供的磁珠包被目标分子的方法在hiv、tp两个项目上对阴性质控和阳性质控的cv有较大改善，跳孔现象明显改善。
[0112][0113][0114][0115]
对比例3 bsa包被羧基磁珠
[0116]
bsa和羧基磁微粒采用化学交联法进行偶联，步骤如下：
[0117]
1)bsa 2mg/ml
×
1.0ml透析至活化缓冲液(50mm mes ph5.5)；
[0118]
2)取merck em1-100/40 0.1ml(100mg/ml,10mg)，用活化缓冲液(50mm mes ph5.5)洗涤3次，每次2ml，最后加1ml活化缓冲液，超声分散；
[0119]
3)称取3mg edc，用0.3ml活化缓冲液(2-8度预冷)溶解至10mg/ml。立刻在振荡条件下往混合液中加入0.2ml edc(约100mm的edc)溶液，充分混匀。室温旋转(30rpm)反应0.5
～1小时，磁分离，弃去上清；用0.5ml的ph5.5的50mm mes重悬；
[0120]
4)取0.2mg的透析后的bsa、加入到2ml的ph5.5的50mm mes中、混匀；
[0121]
5)将重悬的磁珠与稀释后的bsa进行混合，室温旋转(30rpm)反应2小时；
[0122]
6)用洗涤液(50mm tris-hcl+150mm nacl+0.05％tween-20+0.1％proclin 300,ph7.4)洗2次，每次3ml；加3ml封闭液(洗涤液+1％bsa)，室温旋转(30rpm)反应2小时；
[0123]
7)用洗涤液洗3次，每次3ml；最后加1ml磁珠保存液重悬，终浓度10mg/ml固体含量。+2～+8℃保存。
[0124]
将对比例1的包被磁珠与本对比例的包被磁珠混合，进行活性测试。
[0125]
bsa包被磁珠后与抗原包被磁珠后混合使用效果验证。
[0126][0127]
从表中可以看出，添加bsa磁珠后，对活性没有提高，对本底也没有改善，反而使临床本底变差，cv显著增大，出现跳孔。
[0128]
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的
精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。