本发明涉及栀子黄含量测定领域，具体的说是涉及基于色价和高效液相色谱法测定栀子黄含量的方法。
背景技术：
：栀子黄色素是一种非常稀有的水溶性天然色素，其主要成分为藏红花素和藏红花酸。栀子黄色素水溶液在可见光区具有藏红花素和藏红花酸的吸收波长为440nm。国标(gb7912-2010)中配制栀子黄色素浓度为0.15mg/ml，色素公式为是试样液浓度为1％时，采用1cm玻璃比色皿，在440±5nm范围内的最大吸收波长处测得的色价值；a为在440nm出测定栀子黄色素溶液的吸光度；c为被测溶液的浓度，单位是g/ml)。该标准执行以来能够较好地反映出栀子黄色素的质量。《gb5009.149-2016食品安全国家标准食品中栀子黄的测定》修改了《gb5009.149-2003栀子黄的测定》，把原标准第一法高效液相色谱法测定栀子苷修改为高效液相色谱法测定藏花素和藏花酸。gb5009.149-2016标准样品处理等用甲醇处理进样峰型不好，采用了梯度洗脱，分析时间较长。同时无法从色价获知栀子黄含量，又无法从栀子黄色素含量获知色价结果。因此，我们系统研究了比色法测定色价和高效液相色谱法测定栀子黄含量，找出二者之间的关系，力求做到色价和含量互相预测。技术实现要素：本专利一种基于色价和高效液相色谱法测定栀子黄含量的方法，利用光度法测定色价方法进行含量测定，对色谱条件进行了改进。本发明采用的技术方案：一种基于色价和高效液相色谱法测定栀子黄含量的方法，其特征在于按下述步骤操作：精密称取一定质量的栀子黄色素粗品，用50％乙醇溶解稀释定容，配置成0.01mg/ml的试样溶液，以50％乙醇溶液为空白对照，测定其在440nm的吸光值，根据色价公式计算其色价；在给定的色谱条件下，测定栀子黄色素粗品溶液，得到试液的峰面积及含量，所述色谱条件：c18色谱柱，柱长250mm，内径4.6mm，粒径5μm，流动相：乙腈-0.1％磷酸缓冲溶液55∶45，进样量：20μl，流速：0.7ml/min，确定波长：440nm；根据所得色价-含量相关性方程y＝0.0018x-0.0336，计算出栀子黄色素含量。下面通过实验检验该测定方法的合理性。1、比色法测定栀子黄色素色价条件的选择(1)色价测定条件的确定精密称取色价为560和583的两种栀子黄色素分别配制成0.01mg/ml的标准储备液，选用440nm作为比色测量下的确定波长，以蒸馏水为空白对照，采用玻璃比色杯测定其吸光值a，根据计算公式计算其色价e，如表1所示：表1实验方法测得的栀子黄色价通过上表数据可以看出，实验所测色价与工厂所给标准栀子黄色素色价数值相差不大，说明用蒸馏水作为溶剂定容稀释栀子黄色素的色价测定方法可行。(2)栀子黄色素色价标准曲线的绘制取上述配好的两种栀子黄色素标准品储备液，通过配制得到的浓度为0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009mg/ml的标准溶液，以蒸馏水为空白对照组，在确定波长为440nm条件下测定两种栀子黄色素标准品的吸光值，然后通过色价公式得出其色价，如表2所示：表2两种标准品不同浓度下所测吸光值及色价栀子黄色素浓度，mg/ml0.0020.0030.0040.0050.0060.0070.0080.009标准品1吸光值0.1070.1470.2110.2440.320.3650.430.478标准品2吸光值0.1050.1770.2250.2910.3240.390.4420.486标准品1的色价107147211244320365430478标准品2的色价105177225291324390442486注：*t0.05＝2.447；**t0.01＝3.707以标准品色价值为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线，栀子黄色素标准品1的线性回归方程y＝54.167x+44(相关系数r＝0.998)，栀子黄色素标准品2的回归方程为y＝53.81x+62.857(r＝0.998)。说明在0-0.01mg/ml浓度范围内，栀子黄色素色价与吸光值之间具有良好的线性关系。2、高效液相色谱法测定栀子黄色素含量的结果与分析(1)线性关系考察分别吸取标准溶液配制得到0.01、0.03、0.05、0.07、0.09、0.11、0.13、0.15mg/ml的梯度标准溶液，精密吸取各水平的标准溶液20μl分别注入色谱仪中，得到其峰面积，如表3所示：表3液相色谱法线性关系考察实验结果编号浓度/(mg/ml)出峰时间/min峰面积10.012.84340189.3120.032.8231539462.8830.052.7822506340.5040.072.8233391619.5050.092.8324405890.0060.112.845510026.0070.132.8156864692.0080.152.8577862561.50注：*t0.05＝2.447；**t0.01＝3.707以峰面积为y轴，以质量浓度为x轴的线性回归方程为y＝50000000x-200168(r＝0.999)。当df＝8-2＝6时，t0.05＝2.447；t0.01＝3.707。计算得sr＝0.066，t＝r/sr＝15.13＞t0.01。说明在0.01-0.15mg/ml范围内，栀子黄色素浓度和峰面积之间呈极显著相关(r＝0.999**)，高效液相色谱法测定栀子黄色素峰面积的条件以及对样品处理方法是合理的。(2)精密度实验取浓度为0.2mg/ml的标准溶液储备液，配制得到0.09mg/ml的试液。精密吸取此试液20μl注入色谱仪中，连续进5针，并记录峰面积，计算栀子黄色素峰面积的标准偏差和相对标准偏差(rsd)，结果如表4所示：表4精密度实验测定结果编号浓度，mg/ml出峰时间，min峰面积10.12.843937905.5020.12.8483888704.2530.12.8483678590.5040.12.843847505.5050.12.8233811485.50平均值3832838.25标准偏差98264.41rsd0.51％结果显示精密度实验的rsd值为0.51％，低于5％的标准，说明仪器设备精密度高。(3)重现性实验精密称取5份栀子黄色素样品各1mg，分别用50％乙醇溶解后流动相定容配制成浓度为0.1mg/ml的试样溶液梯度，将5支试管中的试液各进1针，进样量为20μl，并记录其峰面积，计算样品栀子黄色素峰面积的标准偏差和相对标准偏差(rsd)，结果如表5所示：表5重现性实验测定结果结果表明：试样溶液重现性的rsd值为1.25％，低于5％的标准，说明该条件下的实验操作符合要求。(4)回收率实验在选定的色谱条件下，取上述配好的五份样品溶液，测定栀子黄色素的含量后，加入0.1mg/ml的标样溶液各0.1ml，混合后分别进样高效液相色谱仪，进样量为20μl做加标回收实验，平行测定5次，并记录其加标前后峰面积，计算得到其回收率及平均加标回收率，如表6所示。表6加标回收率测定的结果根据表6数据可知，平均回收率为112.98％，回收率较高，说明待测物在样品分析过程中的损失较少，证明样品处理是可靠的。5、相关性分析分别采用比色法和高效液相色谱法测定同一标准品的色价及其峰面积，结合所得浓度-色价拟合方程和浓度-峰面积拟合方程，得到相同浓度下栀子黄色素标准品的色价及其含量，结果如表7所示。表7相同浓度栀子黄色素标准品色价与含量的测定注：t0.05＝2.447；**t0.01＝3.707栀子黄色素的色价和其含量的相关性方程为y＝0.0018x-0.0336。当df＝8-2＝6时，t0.05＝2.447；t0.01＝3.707。计算得sr＝0.021，t＝r/sr＝47.53＞t0.01，说明在0-500色价范围内，栀子黄色素色价和含量之间呈极显著相关(r＝0.998**)，栀子黄色素色价和含量之间的相关性是合理、可行的。本发明具有以下优点：本发明根据《gb7912-2010食品安全国家标准食品添加剂栀子黄》、《gb5009.149-2016食品安全国家标准食品中栀子黄的测定》等标准采用比色法进行色价测定和高效液相色谱法测定栀子黄都是在波长440nm下测定来评价栀子黄的品质。因此，以比色测色价和高效液相色谱法测定栀子黄含量，通过二者之间的关系，做到色价和含量互相预测。同时gb5009.149-2016标准样品处理等用甲醇处理进样峰型不好，采用了梯度洗脱，分析时间较长。对gb5009.149-2016色谱条件等进行了改进，从线性关系考察、精密度实验、重现性实验、回收率实验、相关性分析和验证性实验等方面验证了结果的可靠性。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明，但它并不是对本发明的限定。一种基于色价和高效液相色谱法测定栀子黄含量的方法，具体按下述步骤操作：精密称取一定质量的五种栀子黄色素粗品，用50％乙醇溶解稀释定容，配置成0.01mg/ml的试样溶液，以50％乙醇溶液为空白对照，分别测定其在440nm的吸光值，根据色价公式计算其色价。色谱条件：c18色谱柱，柱长250mm，内径4.6mm，粒径5μm，流动相：乙腈-0.1％磷酸缓冲溶液(55：45)，进样量：20μl，流速：0.7ml/min，确定波长：440nm；在上述给定的高效液相色谱条件下，测定五份栀子黄色素粗品溶液，得到五份试液的峰面积及含量，结果见表8：表8栀子黄色素理论含量和实际含量的比较验证性实验：精密称取一定质量的五种栀子黄色素粗品，用50％乙醇溶解稀释定容，配置成0.01mg/ml的试样溶液。以50％乙醇溶液为空白对照，分别测定其在440nm的吸光值，根据色价公式计算其色价。在选定的高效液相色谱条件下，测定上述五份试样溶液，得到五份试液的峰面积及含量。根据色价-含量相关性方程y＝0.0018x-0.0336，计算出理论含量。当前第1页12