依诺肝素钠中硫酸根与羧酸根摩尔比的检测分析方法与流程

本发明涉及天然药物化学以及其质量控制
技术领域：
，具体为依诺肝素钠中硫酸根与羧酸根摩尔比的检测分析方法。
背景技术：
：依诺肝素钠是肝素解聚体的钠盐，它是通过肝素苯甲酯在碱性条件下解聚制成的。依诺肝素钠是在临床上主要是用于预防和治疗深静脉血栓或肺栓塞的抗凝血剂的低分子量肝素。依诺肝素钠的双糖结构含硫酸根和羧酸根，其摩尔比值反映了双糖单位的结构特征，硫酸根的数目和位置与其活性密切相关。美国药典usp38-nf33中收载了依诺肝素钠硫酸根与羧酸根摩尔比值的方法：将供试品溶液注入高效离子色谱仪，通过阴离子交换柱和阳离子交换柱分离，在阳离子交换柱出口收集洗脱液至烧杯中，直至离子检测器的读数回到基线值，将洗脱液用0.1n氢氧化钠溶液进行电导滴定，根据氢氧化钠的消耗量与电导率变化，计算出硫酸根与羧酸根的摩尔比值，该方法需借助高效离子色谱仪收集供试品洗脱液，实验过程较为复杂。技术实现要素：(一)解决的技术问题针对现有技术的不足，本发明提供了依诺肝素钠中硫酸根与羧酸根摩尔比的检测分析方法，解决了实验过程较为复杂的问题。(二)技术方案为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：依诺肝素钠中硫酸根与羧酸根摩尔比的检测分析方法，采用阴离子交换树脂、阳离子交换树脂进行洗脱，并用0.1n的氢氧化钠溶液对洗脱液进行电导滴定，具体包括以下步骤：s1、用蠕动泵将去二氧化碳水冲洗阴、阳离子交换柱，阳离子交换柱出口端收集洗出液，先冲洗200ml洗出液后弃去，另收集10ml洗出液进行电导率测定，重复上述操作，直至电导值的读数稳定；s2、用蠕动泵将20ml浓度为5mg/ml的供试品溶液由阴离子交换柱进样端进样，再用去二氧化碳水冲洗阴、阳离子交换柱，并且用三角瓶在阳离子交换柱出口端收集洗出液，收集60ml的洗出液作为供试品溶液，另收集洗出液10ml进行电导率测定，重复上述操作，直至电导率值读数稳定；s3、将收集液转移至带有磁力搅拌棒的三角瓶中，将三角瓶放在磁力搅拌器上，并浸入电极，记录最初的电导率值；s4、每次向电导池中加入100μl0.1n的氢氧化钠溶液，每加入一次氢氧化钠溶液，记录加入体积和电导率值，当记录的电导率值大于供试品溶液最初的电导率值时，停止继续增加氢氧化钠溶液；s5、以电导值为y轴，氢氧化钠的体积数为x轴，绘制曲线，曲线中有三条近似线性的部分：最初是下滑线，中间轻度上升线，最后上升线，对每一段进行最佳线性回归分析，第一条和第二条线的相交处得出加入样品硫酸根消耗氢氧化钠的体积vs，第二条和第三条线的相交处得出加入样品硫酸根和羧酸根消耗氢氧化钠的体积vt，然后根据公式result＝vs/(vt-vs)计算硫酸根与羧酸根的摩尔比。优选的，所述阴离子交换树脂以l64为填充剂，所述阳离子交换树脂以l65为填充剂。优选的，所述步骤s1中电导率值读数稳定指每次测得的电导率数值相差不超过3μs/cm。优选的，所述步骤s2中收集的10ml洗出液若与前一次收集的洗出液电导率值超过3μs/cm，则前一次收集的洗出液应与供试品溶液合并，若与前一次收集的洗出液电导率值低于3μs/cm，则该洗出液应弃去。优选的，所述步骤s2中电导率值读数稳定指每次测得的电导率数值相差不超过3μs/cm。优选的，所述步骤s5中绘制曲线时，选取点以得出曲线的相关系数绝对值尽量大。(三)有益效果本发明提供了依诺肝素钠中硫酸根与羧酸根摩尔比的检测分析方法。与现有技术相比具备以下有益效果：该依诺肝素钠中硫酸根与羧酸根摩尔比的检测分析方法，采用阴离子交换树脂、阳离子交换树脂进行洗脱，并用0.1n的氢氧化钠溶液对洗脱液进行电导滴定，具体包括以下步骤：s1、用蠕动泵将去二氧化碳水冲洗阴、阳离子交换柱，阳离子交换柱出口端收集洗出液，先冲洗200ml洗出液后弃去，另收集10ml洗出液进行电导率测定，重复上述操作，直至电导值的读数稳定；s2、用蠕动泵将20ml浓度为5mg/ml的供试品溶液由阴离子交换柱进样端进样，再用去二氧化碳水冲洗阴、阳离子交换柱，并且用三角瓶在阳离子交换柱出口端收集洗出液，收集60ml的洗出液作为供试品溶液，另收集洗出液10ml进行电导率测定，重复上述操作，直至电导率值读数稳定；s3、将收集液转移至带有磁力搅拌棒的三角瓶中，将三角瓶放在磁力搅拌器上，并浸入电极，记录最初的电导率值；s4、每次向电导池中加入100μl0.1n的氢氧化钠溶液，每加入一次氢氧化钠溶液，记录加入体积和电导率值，当记录的电导率值大于供试品溶液最初的电导率值时，停止继续增加氢氧化钠溶液；s5、以电导值为y轴，氢氧化钠的体积数为x轴，绘制曲线，曲线中有三条近似线性的部分：最初是下滑线，中间轻度上升线，最后上升线，对每一段进行最佳线性回归分析，第一条和第二条线的相交处得出加入样品硫酸根消耗氢氧化钠的体积vs，第二条和第三条线的相交处得出加入样品硫酸根和羧酸根消耗氢氧化钠的体积vt，然后根据公式result＝vs/(vt-vs)计算硫酸根与羧酸根的摩尔比，通过对美国药典usp38-nf33中依诺肝素钠硫酸根与羧酸根摩尔比方法进行优化，该药典方法需要使用高效离子色谱仪将供试品溶液注入离子柱，通过离子检测器判定分离出来的溶液收集节点，优化后的方法只需要蠕动泵、电导率仪等常规设备，即可完成溶液的收集，该方法检测成本低、操作方便。附图说明图1为本发明实验装置图；图2为本发明实施例1中样品溶液1滴定数据线性回归方程的第一条线；图3为本发明实施例1中样品溶液1滴定数据线性回归方程的第二条线；图4为本发明实施例1中样品溶液1滴定数据线性回归方程的第三条线；图5为本发明实施例1中样品溶液2滴定数据线性回归方程的第一条线；图6为本发明实施例1中样品溶液2滴定数据线性回归方程的第二条线；图7为本发明实施例1中样品溶液2滴定数据线性回归方程的第三条线；图8为本发明实施例2中样品溶液1滴定数据线性回归方程的第一条线；图9为本发明实施例2中样品溶液1滴定数据线性回归方程的第二条线；图10为本发明实施例2中样品溶液1滴定数据线性回归方程的第三条线；图11为本发明实施例2中样品溶液2滴定数据线性回归方程的第一条线；图12为本发明实施例2中样品溶液2滴定数据线性回归方程的第二条线；图13为本发明实施例2中样品溶液2滴定数据线性回归方程的第三条线。图中，1l64阴离子树脂、2l65阳离子树脂、3蠕动泵、4电导率仪、5去二氧化碳水瓶、6洗脱液收集瓶。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例部分所使用的仪器包括：电子天平(型号：xs205du，生产厂家：梅特勒托利多有限公司)、电导率仪4(型号：fe30，生产厂家：梅特勒托利多有限公司)、蠕动泵3(型号：bt100l-ce，生产厂家：保定雷弗流体科技有限公司)、磁力搅拌器(型号：90-2，生产厂家：上海精科实业有限公司)、移液枪(规格：20-200μl，100～1000μl，生产厂家：艾本德中国有限公司)、l65阳离子树脂2(品牌：bio-rad，型号ag50w-x2)、l64阴离子树脂1(品牌：bio-rad，型号：ag1-x8)。实施例部分试剂包括：氢氧化钠(级别：分析纯，生产厂家：国药集团化学试剂有限公司，批号：20161128)；盐酸(分析纯，生产厂家：国药集团化学试剂有限公司，批号：20160416)。实施例实验样品：依诺肝素钠(生产厂家：湖北亿诺瑞生物制药有限公司，批号：es180901、es181001)。请参阅图1-13，本发明实施例提供两种技术方案：依诺肝素钠中硫酸根与羧酸根摩尔比的检测分析方法，具体包括以下实施例：实施例11.试液供试品溶液：取批号为es180901的供试品依诺肝素钠0.10g，置于25ml容量瓶中，加20ml去二氧化碳水溶解，混匀，即得5mg/ml的依诺肝素钠水溶液。2.色谱条件流动相：去二氧化碳水(新沸放冷的纯化水)。色谱柱：2根检测柱——1.5×2.5cm填充物为l64阴离子树脂和1.5×7.5cm填充物为l65阳离子树脂，阴离子树脂柱的出口连于阳离子树脂柱的入口。流速：1ml/min。3.检测过程：t1、先利用蠕动泵3将去二氧化碳水冲洗阴、阳离子交换柱，阳离子交换柱出口端收集洗出液，冲洗大约200ml洗出液后弃去，另收集洗出液约10ml进行电导率测定，重复上述操作，直至电导值的读数稳定(相差不超过3μs/cm)；t2、停止冲洗，弃去收集的洗出液，然后用蠕动泵3将20ml供试品溶液由阴离子交换柱进样端进样，再用去二氧化碳水冲洗阴阳离子交换柱，并且用三角瓶在阳离子交换柱出口端收集洗出液，收集60ml的洗出液作为供试品溶液，另收集洗出液10ml进行电导率测定，重复上述操作，直至电导率值读数稳定(相差不超过3μs/cm),在两次进样之间，将阴离子树脂柱用1n的氢氧化钠溶液在1ml/min条件下，冲洗2小时，再用去二氧化碳水冲洗2小时；将阳离子树脂柱用1n的盐酸溶液在1ml/min条件下，冲洗2小时，再用去二氧化碳水冲洗2小时；；t3、停止收集，若与前一次收集的洗出液电导率值超过3μs/cm，则前一次收集的洗出液应与供试品溶液合并，若与前一次收集的洗出液电导率值低于3μs/cm，则该洗出液应弃去；t4、将供试品溶液转移至带有磁力搅拌棒的三角瓶中，将三角瓶放在磁力搅拌器上，并浸入电极，记录最初的电导率值，每次向电导池中加入100μl0.1n的氢氧化钠溶液，每加入一次氢氧化钠溶液，记录加入体积和电导率值，当记录的电导率值大于供试品溶液最初的电导率值时，停止继续增加氢氧化钠溶液；4.进样次数要求：平行测试2份供试品溶液。5.计算：以电导值为y轴，氢氧化钠的体积数为x轴，用数据处理软件(如excel)绘制曲线，曲线中有三条近似线性的部分：最初是下滑线，中间轻度上升线，最后上升线，对每一段进行最佳线性回归分析，选取点以得出曲线的相关系数绝对值尽量大，计算令y1＝y2，y2＝y3；解在第一条线y1和第二条线y2的相交处、第二条y2和第三条y3的相交处的x值，即得出相交时消耗的氢氧化钠的体积，第一条和第二条线的相交处得出加入样品硫酸根消耗氢氧化钠的体积vs，第二条和第三条的相交处得出加入样品硫酸根和羧酸根消耗氢氧化钠的体积vt，根据下面公式计算硫酸根与羧酸根的摩尔比：result＝vs/(vt-vs)6.实验结果6.1实验数据样品溶液1滴定数据：样品溶液2滴定数据：6.2实验结果样品溶液检测结果12.422.4实施例21.试液供试品溶液：取批号为es181001的供试品依诺肝素钠0.10g，置于25ml容量瓶中，加20ml去二氧化碳水溶解，混匀，即得5mg/ml的依诺肝素钠水溶液。2.色谱条件流动相：去二氧化碳水(新沸放冷的纯化水)。色谱柱：2根检测柱——1.5×2.5cm填充物为l64阴离子树脂和1.5×7.5cm填充物为l65阳离子树脂，阴离子树脂柱的出口连于阳离子树脂柱的入口。流速：1ml/min。3.检测过程t1、先利用蠕动泵3将去二氧化碳水冲洗阴阳离子交换柱，阳离子交换柱出口端收集洗出液，冲洗大约200ml洗出液后弃去，另收集洗出液约10ml进行电导率测定，重复上述操作，直至电导值的读数稳定(相差不超过3μs/cm)；t2、停止冲洗，弃去收集的洗出液，然后用蠕动泵3将20ml供试品溶液由阴离子交换柱进样端进样，再用去二氧化碳水冲洗阴阳离子交换柱，并且用三角瓶在阳离子交换柱出口端收集洗出液，收集60ml的洗出液作为供试品溶液，另收集洗出液10ml进行电导率测定，重复上述操作，直至电导率值读数稳定(相差不超过3μs/cm),在两次进样之间，将阴离子树脂柱用1n的氢氧化钠溶液在1ml/min条件下，冲洗2小时，再用去二氧化碳水冲洗2小时；将阳离子树脂柱用1n的盐酸溶液在1ml/min条件下，冲洗2小时，再用去二氧化碳水冲洗2小时；t3、停止收集，若与前一次收集的洗出液电导率值超过3μs/cm，则前一次收集的洗出液应与供试品溶液合并，若与前一次收集的洗出液电导率值低于3μs/cm，则该洗出液应弃去；t4、将供试品溶液转移至带有磁力搅拌棒的三角瓶中，将三角瓶放在磁力搅拌器上，并浸入电极，记录最初的电导率值，每次向电导池中加入100μl0.1n的氢氧化钠溶液，每加入一次氢氧化钠溶液，记录加入体积和电导率值，当记录的电导率值大于供试品溶液最初的电导率值时，停止继续增加氢氧化钠溶液；4.进样次数要求：平行测试2份供试品溶液。5.计算：以电导值为y轴，氢氧化钠的体积数为x轴，用数据处理软件(如excel)绘制曲线，曲线中有三条近似线性的部分：最初是下滑线，中间轻度上升线，最后上升线，对每一段进行最佳线性回归分析，选取点以得出曲线的相关系数绝对值尽量大，计算令y1＝y2，y2＝y3；解在第一条线y1和第二条线y2的相交处、第二条y2和第三条y3的相交处的x值，即得出相交时消耗的氢氧化钠的体积，第一条和第二条线的相交处得出加入样品硫酸根消耗氢氧化钠的体积vs，第二条和第三条的相交处得出加入样品硫酸根和羧酸根消耗氢氧化钠的体积vt，根据下面公式计算硫酸根与羧酸根的摩尔比：result＝vs/(vt-vs)6.实验结果6.1实验数据样品溶液1滴定数据：样品溶液2滴定数据：6.2实验结果需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。当前第1页12