基于唾液特异糖蛋白糖链结构的胃癌筛查、评估的产品及应用的制作方法

本发明涉及一种基于唾液特异糖蛋白的胃癌标志物的确定及其相关产品、应用。

背景技术：

胃癌(gastriccancer，gc)是我国常见的恶性肿瘤，具有极高的发病率和死亡率。目前，胃癌的各种检测方法分别受其技术特点的限制，均存在特异性低、取样不便和不能早期诊断等缺陷。

近年来有研究表明：随着胃癌的发生发展，患者的胃部组织、血清以及唾液的糖蛋白糖型会发生异常改变。有必要指出的是，血液中的一些因子能够随体液循环到达唾液腺，或随唾液分泌进入口腔或导致唾液中的基因转录谱发生改变，引起某些蛋白质的丰度或种类改变，从而反映出血液中部分蛋白质水平的变化。但目前研究发现，人唾液中有1939种蛋白质，人血浆中有3020种蛋白质，仅有27％的唾液蛋白质组与血浆蛋白质组重合。血浆蛋白质组学发现的177个与心血管疾病相关的潜在生物标志物的蛋白质中，也仅有40％的蛋白质出现在唾液蛋白质组中；在已列出的1058个潜在癌症相关生物标志物的蛋白质中，仅有34％的蛋白质出现在唾液蛋白质组中。这表明许多血液循环中的生物标志物并非能够在唾液中得到鉴定。另外，即使是同一种蛋白，较之于血清，其在唾液中的含量通常明显较低。所以在实践中，两者没有必然的联系，往往需要研究人员经过大量的实验和分析，才能判断是否有蛋白质组重合的可能性。

专利文献cn105652002a一种基于唾液蛋白检测糖链标志物的凝集素芯片及其方法。基于唾液检测时当vva，pna，eel，lel，hhl上调，aal，psa下调时可以从健康志愿者(healthyvolunteers，hv)中区分出gc。上述方案在检测样本时所需凝集素较多，且需作组合统计，因此对于胃癌的筛查、诊断以及评估仍不够简便、有效。

技术实现要素：

关于胃癌(gc)的筛查、诊断以及评估等，发明人通过大量实验和分析，确定了以下结论：

一、vva识别的糖链(terminalgalnac,galnacα1-3gal)在胃癌患者的唾液中显著高于健康志愿者与萎缩性胃炎患者组(gc组62.97％，hv&ag组22.71％)。

二、16种n-糖链(m/z.1559.503(2.57％)；1565.491(1.78％)；1625.605(1.11％)；1721.556&1743.538(15.95％)；1787.657(1.00％)；1812.689&1834.671(3.43％)；1828.684&1850.666(3.35％)；1930.623(1.06％)；1938.682(1.13％)；1949.667&1971.649(5.31％)；2110.767(0.68％)；2332.891(0.45％)；2383.771(0.45％)；2921.044&2943.026(2.35％)；2965.107(0.35％)；2979.086&3001.068(0.4％))仅存在于gc患者的唾液中，而未见于hv&ag的唾液中。

根据以上结论，已经可得出以下应用方案：

第一方面，一种凝集素单独作为唾液特异糖蛋白糖链结构识别的试剂以制备相关产品的用途，所述凝集素为vva，用途为胃癌(gc)的筛查、早期诊断、风险评估、药物筛选和/或疗效评估，所述相关产品为试剂盒、设备、可操作系统和/或它们的组合，并提示以下至少一个检测依据：

a)凝集素vva所识别的n-糖链整体若为高表达，则表明唾液样本主体为胃癌(gc)患者；

b)凝集素vva所识别的n-糖链中如果存在以下16种n-糖链之任一或任意组合，则表明唾液样本主体为胃癌(gc)患者；

(1)m/z.1559.503；

(2)m/z.1565.491；

(3)m/z.1625.605；

(4)m/z.1721.556&1743.538；

(5)m/z.1787.657；

(6)m/z.1812.689&1834.671；

(7)m/z.1828.684&1850.666；

(8)m/z.1930.623；

(9)m/z.1938.682；

(10)m/z.1949.667&1971.649；

(11)m/z.2110.767；

(12)m/z.2332.891；

(13)m/z.2383.771；

(14)m/z.2921.044&2943.026；

(15)m/z.2965.107；

(16)m/z.2979.086&3001.068。

这里，“提示检测依据”的具体形式不限，例如：随附的产品说明书中记载该检测依据；涉及到软件的，则还可由相应的算法体现该检测依据。

第二方面，特定糖链的识别单元在构建用于基于唾液样本作胃癌(gc)筛查、早期诊断、风险评估、药物筛选和/或疗效评估的产品方面的用途，其特征在于：所述识别单元识别上述的16种n-糖链之任一或任意组合。

这里，识别单元可以是可执行的软件代码模块，标识出是否存在上述n-糖链，进而可鉴别出唾液样本主体是否为胃癌(gc)患者；相应的，产品可以是与糖链分析设备(如质谱仪)连接的控制装置(例如，可使糖链分析设备按指令进行特定糖链的识别)、信息输出装置(例如，根据糖链分析设备输出带有标识的糖链清单)及其组合等。随着糖链识别技术的发展，识别单元也可能会出现其他具体形式。

第三方面，一种用于胃癌(gc)筛查、早期诊断、风险评估、药物筛选和/或疗效评估的系统，针对唾液样本，该系统包括：

a、凝集素vva；

b、用于偶联凝集素vva的亲和层析固相载体；

c、用于分离出n-糖链的试剂和装置；

d、质谱仪，用于显示对应于各种n-糖链的m/z值；

e、用于根据质谱图识别权利要求1中所述的16种n-糖链的标识、模块或处理器，以得出是否含有权利要求1中所述的16种n-糖链之任一或任意组合的判定结果。

上述用于偶联凝集素vva的亲和层析固相载体可以选择fe3o4磁性微粒、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、玻璃微球等。

第四方面，一种智能终端，包括处理器和程序存储器，所述程序存储器存储的某部分程序被处理器加载时执行以下步骤：

获取唾液样本中凝集素vva所识别的n-糖链信息；

判断其中是否存在上述的16种n-糖链之任一或任意组合；

如果存在，输出表明唾液样本主体为胃癌(gc)患者的提示信息。

这里，智能终端可以与糖链分析设备(如质谱仪)通信，也可以连接移动存储介质等，以获取唾液样本中凝集素vva所识别的n-糖链信息；判断环节也有可能与获取环节合并，即直接获取/判断唾液样本中是否存在上述16种n-糖链之任一或任意组合的信息。

第五方面，一种计算机可读存储介质，存储有计算机程序，所述计算机程序被处理器加载时执行上述步骤。

采用本发明的方案，能够根据唾液样本，快速、准确地鉴别受试者是否为胃癌(gc)患者。

附图说明

图1为凝集素芯片对124例唾液样本进行逐例检测，其中凝集素vva结果的箱图分析。图中，纵坐标表示凝集素芯片上该凝集素所对应的归一化荧光强度nfi，图中横线代表两端所示两组间的比较，p为根据单因素方差分析所获得的p-value，其中p***<0.001表示差异极显著。gc：胃癌患者；hv&ag：健康志愿者和萎缩性胃炎患者。

图2为gc及hv&ag样本vva分离糖蛋白n-糖链结构质谱解析。

具体实施方式

前期的研究发现了胃癌唾液糖蛋白糖型与健康志愿者以及萎缩性胃炎患者存在显著的差异，vva识别的糖链在gc和hv&ag两组间存在显著的差异(图1)。基于此，我们设计并完成了如下实验。

以下详细介绍本申请的相关验证实验及分析，发明人具体的研发过程不限于此。

一、研究方法：

利用一种四氧化三铁纳米磁粒表面偶联上凝集素vva制成凝集素磁性微粒复合物来富集各组唾液混合样本中的特定糖蛋白，利用pngasef酶切法分离特定糖蛋白上的n-糖链，并由基质辅助激光电离飞行时间质谱(matrix-assistedlaserdesorptionionization-timeofflight-massspectrum，maldi-tof-ms)对糖链进行质谱鉴定并对糖链结构进行推测，获得凝集素vva识别的健康志愿者，萎缩性胃炎患者和胃癌患者唾液特定糖蛋白糖链谱并对比分析差异，具体如下。

1.1、唾液样本的收集及预处理

本实验所采用的健康志愿者及萎缩性胃炎患者和胃癌患者唾液样本均严格经过西北大学、陕西省人民医院以及西安交通大学第二附属医院的伦理审批(humanresearchethicscommittees(hrecs))。所有捐赠唾液样本的志愿者连同协助采样指导的临床医师均对本研究工作知情、同意且高度配合，在均一的采样要求之下完成唾液样本的采集。其具体要求为：样本捐献者需无糖尿病，除胃部外其他的器官应无炎症以及肿瘤等慢性疾病，在采样时捐献者需确定在采集唾液前3小时内未进食并且24小时内未服用药物，然后用洁净无菌的生理盐水(0.9％nacl)漱口三次，确保捐献者口腔卫生和无食物残渣的前提下，捐献者舌尖抵住上颚并于舌下收集自然分泌的唾液样本收集至2ml离心管，立即加入10μl蛋白酶抑制剂(proteaseinhibitorcocktail，sigma-aldrich,u.s.a)于冰浴暂存。在临床医师指导下共收集唾液样本124例：其中健康志愿者30例(hv，n＝30)，萎缩性胃炎患者30例(ag，n＝30)，胃癌患者64例(gc，n＝64)，具体的样本信息如表1所示。

唾液采集12小时内，将唾液按1ml分装至离心管中，若有量少不足1ml者可加入1×pbs补足至1ml，10,000g×15min离心，小心吸取上清液，经微量核酸蛋白测定仪(nano-drop)测定浓度后按1mg唾液蛋白10μl蛋白酶抑制剂的量加入蛋白酶抑制剂，随后按质量取每例唾液样本50μg进行混合。获得健康志愿者&萎缩性胃炎组(hv&ag)和胃癌组(gc)唾液混合样本。利用bca蛋白定量试剂盒(碧云天生物技术，中国上海)测定混合样本浓度。

表1用于胃癌诊断凝集素芯片逐例检测的唾液样本信息

1.2、凝集素vva磁性微粒复合体的制备

取2mg环氧化修饰的fe3o4磁性微粒至2ml离心管中，加入1ml无水乙醇，反复颠倒2min，置于磁性分离器上使磁粒充分吸附在离心管底面与侧面，倒去乙醇，如此重复5次，充分清洗磁性微粒。清洗后的磁性微粒用1ml的偶联缓冲液润洗，重复3遍后加入600μl0.5mg/ml凝集素vva溶液(vva溶解在偶联缓冲液中)，固定在摇床上室温震荡反应6h使充分偶联。偶联结束后将离心管置于磁性分离架上分离，除去液体后取下离心管加入1ml偶联缓冲液清洗vva-磁粒复合体，反复颠倒使其重新悬浮，充分悬浮后置于磁性分离架上分离，除去偶联缓冲液，重复清洗3次，以便充分除去未结合的凝集素vva，获得凝集素vva磁性微粒复合体。

1.3、凝集素vva识别的糖蛋白的分离

首先，使用结合缓冲液清洗凝集素磁性微粒复合物3次，每次3min。将唾液蛋白用结合缓冲液补足体积至500μl，混匀后加入到凝集素磁性微粒复合物中，颠倒混匀，放入摇床中25℃震荡孵育3h。孵育完成后，磁场分离，弃上清，使用清洗缓冲液清洗磁性微粒5次，每次3min。清洗完成后，磁场分离，弃上清，向磁性微粒中加入400μl清洗缓冲液，颠倒混匀后放入摇床，25℃震荡洗脱1h。磁场分离，收集上清，重复上步一次，将两次收集的上清混合，bca测定洗脱的蛋白浓度。

1.4、n-糖链的分离

(1)取经vva-磁力复合体分离的糖蛋白400μg，加入8倍体积的9murea/1mnh4hco3溶液，混匀后37℃震荡反应1h，变性糖蛋白；

(2)向蛋白溶液中加入5％体积的100mmdtt溶液母液，使dtt终浓度为5mm，混匀后室温静置1h，还原蛋白中的二硫键；

(3)将蛋白溶液先冷却至室温，向蛋白溶液中加入5％体积的200mmiam溶液母液，使iam终浓度为10mm，室温、避光摇动中反应30min；

(4)将蛋白溶液转入10k超滤离心管中，10000g室温离心15min，弃滤出液，向管中加入400μl40mmnh4hco3溶液，吹打混匀，重复上步5次。补足体积至500μl，加入3μlpngasef糖苷酶，混匀后放入37℃摇床中震荡孵育过夜，酶切糖蛋白上的n-聚糖；

(5)10000g离心10min，收集滤出液。再向管中加200μl超纯水，混匀后再次离心收集滤出液，将两次滤出液混合，并用冷冻干燥仪干燥。

1.5、糖链的脱盐纯化

(1)预清洗：将hypercarbspe柱(50mg)取出，向柱中依次加入3ml1mnaoh溶液，3ml超纯水，3ml30％乙酸，3ml超纯水；

(2)平衡：向柱中依次加入3ml50％acn/0.1％tfa，3ml5％acn/0.1％tfa溶液；

(3)上样：向冻干的n-聚糖中加入500μl0.1％tfa，涡旋振荡。将溶解后的n-聚糖加入到柱中，收集滤出液，再次上样，重复上样3次；

(4)清洗：向柱中依次加入3ml超纯水，3ml5％acn/0.1％tfa；

(5)洗脱：向柱中加入400μl50％acn/0.1％tfa，收集滤出液，重复一次，将两次收集的滤出液合并，使用冷冻干燥仪冻干。

1.6、n-聚糖质谱解析

(1)向冻干的n-聚糖加入20μl糖链溶液，吹打至糖链完全溶解，涡旋后离心；

(2)取2μl溶解后的糖链，使用移液器点样于mtpanchorchip384点的靶板上，真空抽干，再次取2μl点在靶板的原位置，真空抽干；

(3)取1μl20mg/ml的dhb基质溶液点在结晶的糖链样品上，待真空抽干；

(5)将靶板上机，以反射阳性离子模式鉴定多糖。

1.7、质谱数据分析

使用flexanalysis软件打开质谱原始数据，以信噪比(snr)大于6，选取m/z1000-4000范围的质谱峰，将选取的质谱数据转入glycoworkbeach软件，分析标准为：选择前体离子分子量，电荷状态，前体离子容忍度为1，碎片离子容忍度为0.5，无化学衍生化，无还原端修饰。绘制二级碎片和一级质谱结果。

单个糖链的相对丰度计算方法：将所有糖链的信号值相加作为分母(n)，用单个糖链的信号值(n)除以n，即n/n为单个糖链相对丰度。

二、研究结果：

通过maldi-tof-ms共鉴定到69种信号峰(snr大于6)，总共解析到46种不同的糖链结构，其中有34种为vva识别的n-糖链峰，如图2表2所示。在gc和hv&ag组中分别鉴定到了19和17种n糖链，其相对丰度分别为62.97％和22.71％。

表2.两组样本中分离出的n-糖链

*附注：蓝色(深色)正方形：n-乙酰葡糖胺；红色三角形：岩藻糖；绿色(深色)圆形：甘露糖；黄色(浅色)圆形：半乳糖；黄色(浅色)正方形：n-乙酰半乳糖胺；紫色菱形：唾液酸；/:代表在样本中没有检测到对应的糖链。

其中16种n-糖链仅存在于gc组的唾液样本中。具体如下(括号中为相对丰度)：

(1)m/z.1559.503(2.57％)；

(2)m/z.1565.491(1.78％)；

(3)m/z.1625.605(1.11％)；

(4)m/z.1721.556&1743.538(15.95％)；

(5)m/z.1787.657(1.00％)；

(6)m/z.1812.689&1834.671(3.43％)；

(7)m/z.1828.684&1850.666(3.35％)；

(8)m/z.1930.623(1.06％)；

(9)m/z.1938.682(1.13％)；

(10)m/z.1949.667&1971.649(5.31％)；

(11)m/z.2110.767(0.68％)；

(12)m/z.2332.891(0.45％)；

(13)m/z.2383.771(0.45％)；

(14)m/z.2921.044&2943.026(2.35％)；

(15)m/z.2965.107(0.35％)；

(16)m/z.2979.086&3001.068(0.4％)。

所以，最后可以得出：针对唾液样本进行检测，只需测定其是否含有这的16种n-糖链之任一或任意组合，即可作出胃癌的筛查、早期诊断、风险评估、药物筛选和/或疗效评估的结果。