中药麦冬的指纹图谱检测方法与流程

本发明涉及一种中药的检测方法，具体涉及一种麦冬的指纹图谱检测方法。
背景技术：
：麦冬为百合科沿阶草属植物麦冬[ophiopogonjaponicus(thunb.)ker-gawl]的干燥块根，为常用滋阴中药，首载于《神农本草经》，具有养阴生津、润肺清心之功效，主治肺燥干咳、津伤口渴等症。其主要成分为甾体皂甙、多糖、高异黄酮、氨基酸及脂等，其中麦冬皂苷、黄酮和多糖为麦冬的主要药用活性成分，具有抗心肌缺血、抗缺氧、免疫活性、降低血糖、平喘和抗过敏等药理作用。目前国内流通的商品大多为栽培品种，主产于四川绵阳和浙江慈溪，分别称为川麦冬和杭麦冬，另外产于湖北襄阳的湖北麦冬产销量也很大，在福建也有少量短葶山麦冬分布。不同品质的麦冬品种在外观上差别细微，而其内在质量却往往差异比较明显，其活性成分随着产地、气候、栽培条件、采收时期不同往往会有较大的差异。目前，麦冬总皂苷、总黄酮、总多糖的测定往往采用紫外-可见分光光度计比色法测定，目前还没有可以检测麦冬多指标成分的指纹图谱研究的报道。因此，很有必要在现有技术的基础之上，设计研发一种能全面检测和评价麦冬质量的指纹图谱检测方法。技术实现要素：发明目的：本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种能全面检测和评价麦冬质量的指纹图谱检测方法。该方法对控制麦冬的质量和保证临床疗效具有重要意义。技术方案：为了实现以上技术目的，本发明采取的技术方案为：中药麦冬的指纹图谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)麦冬供试品溶液制备：(2)麦冬对照药材溶液的制备；(3)对照品的制备(4)高效液相色谱法测定麦冬的对照药材的指纹图谱：(5)高效液相色谱法测定供试品溶液指纹图谱：(6)对照品溶液的测定：(7)将步骤(5)得到的供试品溶液指纹图谱和步骤(4)得到的对照指纹图谱用相似度软件评价，并用步骤(6)的对照品溶液标定特征峰。作为优选方案，以上所述的中药麦冬的指纹图谱检测方法，包括以下步骤：(1)麦冬供试品溶液制备：取批量麦冬，分别加有机溶剂提取，合并滤液，蒸干，残渣加水溶解，通过柱层析去渣后取洗脱液，蒸干，用有机溶剂溶解定容，微孔滤膜滤过，即得；(2)麦冬对照药材溶液的制备；取批量的麦冬对照药材，分别加有机溶剂提取，合并滤液，蒸干，残渣加水溶解，通过柱层析去渣后取洗脱液，蒸干，用有机溶剂溶解定容，微孔滤膜滤过，即得；(3)对照品的制备精密取麦冬皂苷b、麦冬皂苷c和麦冬皂苷d加有机溶剂溶解成混合对照品溶液；(4)高效液相色谱法测定麦冬的对照药材的指纹图谱：取步骤(2)中的批量麦冬对照药材溶液，注入hplc进行分析，测得各批次麦冬对照药材的指纹图谱，以这些指纹图谱为基础，用相似度软件计算获得共有模式作为对照指纹图谱；(5)高效液相色谱法测定供试品溶液指纹图谱：取步骤(1)中的批量麦冬供试品溶液按步骤(4)相同的色谱条件注入hplc进行分析，测得供试品溶液的指纹图谱；(6)对照品溶液的测定：取步骤(3)的对照品溶液，按步骤(4)相同的色谱条件注入hplc进行分析；(7)将步骤(5)得到的供试品溶液指纹图谱和步骤(4)得到的对照指纹图谱用相似度软件评价，并用步骤(6)的对照品溶液标定特征峰。作为更加优选方案，以上中药麦冬的指纹图谱检测方法，包括以下步骤：(1)麦冬供试品溶液制备：取批量麦冬，粉碎，过筛，分别精密取麦冬，加有机溶剂超声处理，滤过，滤渣再加有机溶剂，超声处理，滤过，合并滤液，蒸干，残渣加水微热使溶解，加于c18小柱上，以水洗脱，水液弃去，继用低浓度的有机溶剂洗脱，洗脱液弃去，最后用高浓度的有机溶剂洗脱，收集洗脱液，蒸干，用有机溶剂溶解定容，微孔滤膜滤过，即得；(2)麦冬对照药材溶液的制备；取批量的麦冬对照药材，粉碎，过筛，分别精密取麦冬，加有机溶剂，浸渍，超声处理，滤过，滤渣再加有机溶剂，超声处理，滤过，合并滤液，蒸干，残渣加水微热使溶解，加于c18小柱上，以水洗脱，水液弃去，继用低浓度的有机溶剂洗脱，洗脱液弃去，最后用高浓度的有机溶剂洗脱，收集洗脱液，蒸干，用有机溶剂溶解定容，微孔滤膜滤过，即得；(3)对照品的制备精密取麦冬皂苷b、麦冬皂苷c和麦冬皂苷d加有机溶剂溶解成混合对照品溶液；(4)高效液相色谱法测定麦冬的对照药材的指纹图谱：取步骤(2)中的批量麦冬对照药材溶液，注入hplc进行分析，测得各批次麦冬对照药材的指纹图谱，以这些指纹图谱为基础，用相似度软件计算获得共有模式作为对照指纹图谱；(5)高效液相色谱法测定供试品溶液指纹图谱：取步骤(1)中的批量麦冬供试品溶液按步骤(4)相同的色谱条件注入hplc进行分析，测得供试品溶液的指纹图谱；(6)对照品溶液的测定：取步骤(3)的对照品溶液，按步骤(4)相同的色谱条件注入hplc进行分析；(7)将步骤(5)得到的供试品溶液指纹图谱和步骤(4)得到的对照指纹图谱用相似度软件评价，并用步骤(6)的对照品溶液标定特征峰。作为进一步优选方案，中药麦冬的指纹图谱检测方法，包括以下步骤：(1)麦冬供试品溶液制备：取批量麦冬，分别粉碎，过筛，分别精密取麦冬，加甲醇，浸渍过夜，超声处理，滤过，滤渣再加甲醇，超声处理，滤过，合并滤液，蒸干，残渣加水微热使溶解，加于已活化好的安捷伦c18小柱上，以水洗脱，水液弃去，继用甲醇洗脱，洗脱液弃去，最后用甲醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇溶解定容，用0.22μm微孔滤膜滤过，即得；(2)麦冬对照药材溶液的制备；取批量的麦冬对照药材，分别粉碎，过筛，分别精密取麦冬，加甲醇，浸渍过夜，超声处理，滤过，滤渣再加甲醇，超声处理，滤过，合并滤液，蒸干，残渣加水微热使溶解，加于已活化好的安捷伦c18小柱上，以水洗脱，水液弃去，继用甲醇洗脱，洗脱液弃去，最后用甲醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇溶解定容，用0.22μm微孔滤膜滤过，即得；(3)对照品的制备精密取麦冬皂苷b、麦冬皂苷c和麦冬皂苷d加甲醇溶解成混合对照品溶液；(4)高效液相色谱法测定麦冬的对照药材的指纹图谱：取步骤(2)中的批量麦冬对照药材溶液，注入hplc进行分析，测得各批次麦冬对照药材的指纹图谱，以这些指纹图谱为基础，用相似度软件计算获得共有模式作为对照指纹图谱；(5)高效液相色谱法测定供试品溶液指纹图谱：取步骤(1)中的批量麦冬供试品溶液按步骤(4)相同的色谱条件注入hplc进行分析，测得供试品溶液的指纹图谱；(6)对照品溶液的测定：取步骤(3)的对照品溶液，按步骤(4)相同的色谱条件注入hplc进行分析；(7)将步骤(5)得到的供试品溶液指纹图谱和步骤(4)得到的对照指纹图谱用相似度软件评价，并用步骤(6)的对照品溶液标定特征峰。作为另一优选方案，以上所述的中药麦冬的指纹图谱检测方法，包括以下步骤：(1)麦冬供试品溶液制备：取批量麦冬，分别粉碎，依次过3号筛，分别精密取1～5g，加甲醇20～100ml，浸渍过夜，超声处理20～30min，滤过，滤渣再加甲醇20～100ml，超声处理20～30min，滤过，合并2次滤液，蒸干，残渣加水2～10ml微热使溶解，加于已活化好的安捷伦c18小柱上，以水8ml洗脱，水液弃去，继用20％甲醇8ml～40ml洗脱，洗脱液弃去，最后用甲醇3～15ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇溶解定容至1～5ml，用0.22μm微孔滤膜滤过，即得；(2)麦冬对照药材溶液的制备；取批量的麦冬对照药材，分别粉碎，依次过3号筛，分别精密取1～5g，加甲醇20～100ml，浸渍过夜，超声处理20～30min，滤过，滤渣再加甲醇20～100ml，超声处理20～30min，滤过，合并2次滤液，蒸干，残渣加水2～10ml微热使溶解，加于已活化好的安捷伦c18小柱上，以水8ml洗脱，水液弃去，继用20％甲醇8ml～40ml洗脱，洗脱液弃去，最后用甲醇3～15ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇溶解定容至1～5ml，用0.22μm微孔滤膜滤过，即得；(3)对照品的制备精密取麦冬皂苷b、麦冬皂苷c和麦冬皂苷d加甲醇溶解成浓度分别为1.5～4.5mg/ml、1.25～2.5mg/ml和2～4mg/ml的混合对照品溶液；(4)高效液相色谱法测定麦冬的对照药材的指纹图谱：取步骤(2)中的批量麦冬对照药材溶液，注入hplc进行分析，测得各批次麦冬对照药材的指纹图谱，以这些指纹图谱为基础，用相似度软件计算获得共有模式作为对照指纹图谱；(5)高效液相色谱法测定供试品溶液指纹图谱：取步骤(1)中的批量麦冬供试品溶液按步骤(4)相同的色谱条件注入hplc进行分析，测得供试品溶液的指纹图谱；(6)对照品溶液的测定：取步骤(3)的对照品溶液，按步骤(4)相同的色谱条件注入hplc进行分析；(7)将步骤(5)得到的供试品溶液指纹图谱和步骤(4)得到的对照指纹图谱用相似度软件评价，并用步骤(6)的对照品溶液标定特征峰。作为更加进一步方案，中药麦冬的指纹图谱检测方法，包括以下步骤：(1)麦冬供试品溶液制备：取批量麦冬，分别粉碎，依次过3号筛，分别精密取1g，加甲醇20ml，浸渍过夜，超声处理20min，滤过，滤渣再加甲醇20ml，超声处理20min，滤过，合并2次滤液，蒸干，残渣加水2ml微热使溶解，加于已活化好的安捷伦c18小柱上，以水8ml洗脱，水液弃去，继用20％甲醇8ml洗脱，洗脱液弃去，最后用甲醇3ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇溶解定容至1ml，用0.22μm微孔滤膜滤过，即得；(2)麦冬对照药材溶液的制备；取批量的麦冬对照药材，分别粉碎，依次过3号筛，分别精密取1g，加甲醇20ml，浸渍过夜，超声处理20min，滤过，滤渣再加甲醇20ml，超声处理20min，滤过，合并2次滤液，蒸干，残渣加水2ml微热使溶解，加于已活化好的安捷伦c18小柱上，以水8ml洗脱，水液弃去，继用20％甲醇8ml洗脱，洗脱液弃去，最后用甲醇3ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇溶解定容至1ml，用0.22μm微孔滤膜滤过，即得；(3)对照品的制备精密取麦冬皂苷b、麦冬皂苷c和麦冬皂苷d加甲醇溶解成浓度分别为1.5mg/ml、1.25mg/ml和2mg/ml的混合对照品溶液；(4)高效液相色谱法测定麦冬的对照药材的指纹图谱：取步骤(2)中的批量的麦冬对照药材溶液，注入hplc进行分析，测得各批次麦冬对照药材的指纹图谱，以这些指纹图谱为基础，用相似度软件计算获得共有模式作为对照指纹图谱；(5)高效液相色谱法测定供试品溶液指纹图谱：取步骤(1)中的批量的麦冬供试品溶液，按步骤(4)相同的色谱条件注入hplc进行分析，测得供试品溶液的指纹图谱；(6)对照品溶液的测定：取步骤(3)的对照品溶液，按步骤(4)相同的色谱条件注入hplc进行分析；(7)将步骤(5)得到的供试品溶液指纹图谱和步骤(4)得到的对照指纹图谱用相似度软件评价，并用步骤(6)的对照品溶液标定特征峰。作为优选方案，以上所述的中药麦冬的指纹图谱检测方法，步骤(4)中色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：乙腈为a相，冰醋酸水为b相，梯度洗脱，检测波长：205～220nm；柱温：25～35℃；流速：0.5～1.5ml/min；进样量：5～10μl。作为优选方案，以上所述的中药麦冬的指纹图谱检测方法，步骤(4)中色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相：乙腈为a相，含有体积浓度的0.01～0.05％的冰醋酸水为b相，梯度洗脱，检测波长：205～210nm；柱温：30～35℃；流速：0.8～1.0ml/min；进样量：10μl。作为优选方案，以上所述的中药麦冬的指纹图谱检测方法，色谱柱为安捷伦sbc18，型号为：250mm×4.6mm，5μm；流动相：乙腈为a相，含有体积浓度的0.01％的冰醋酸水为b相，梯度洗脱，检测波长：205nm；柱温：30℃；流速：1.0ml/min；进样量：10μl。作为优选方案，以上所述的中药麦冬的指纹图谱检测方法，梯度洗脱条件为：0～59min，a相35％～62％；59～60min，a相62％；60～61min，a相62～35％；61～70min，a相35％。作为优选方案，以上所述的中药麦冬的指纹图谱检测方法，其特征在于，一共测定得到15个特征峰，其中9号峰为麦冬皂苷c，10号峰为麦冬皂苷d，11号峰为麦冬皂苷b。本发明将供试品指纹图谱与对照指纹图谱经计算机相似度评价软件(选用中国药典委推荐的“中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件2004a版”)计算，获得指纹图谱相似度数值，依据相似度数值，应用于麦冬药材的质量控制。指纹图谱相似度应大于0.90为检验质控标准。本发明提供的麦冬的指纹图谱检测方法用于生产检验质量控制，所得产品具有较高的质量稳定性，可确保产品安全有效。有益效果：本发明提供的中药麦冬指纹图谱检测方法具有以下优点：1、本发明根据中药麦冬中所含的活性成分，包括皂苷类、黄酮类和糖类化合物的结构性质特点，通过大量实验筛选出最佳的流动相组成，梯度洗脱程序、流速，检测波长、色谱柱，柱温等分析条件，经多次实验验证表明，本发明提供的中药麦冬指纹图谱检测方法可以全面、客观、准确的检测和评价麦冬的质量为保证临床疗效具有重要意义。2、本发明提供的麦冬的指纹图谱检测方法，可操作性强，具有灵敏度和精密度高，重复性和稳定性好，能够准确测定和评价麦冬的质量，为麦冬从源头上保证原料药材的安全，有效，把好质量关具有重要的意义。附图说明图1为不同流动相的色谱图。图2为等度洗脱时色谱图。图3为梯度洗脱图4为不同色谱柱的色谱图。图5为麦冬药材的指纹图谱。具体实施方式下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。实施例1色谱条件的筛选1、流动相种类的筛选由于麦冬活性成分复杂，本发明通过大量实验筛选了甲醇－水，乙腈－水，乙腈－0.01％的冰醋酸水、乙腈-甲醇体系等流动相，并且由于麦冬中存在皂苷类和黄酮类等成分，因此不同的流动相分离效率不同，且黄酮的酚羟基酸性结构，在流动相加入冰醋酸等有利于峰形改善，故在流动相体系中加入一定量的并醋酸，最后通过比较不同流动相的显示峰的数目，分离度和峰形等，如图1，不同流动相洗出的色谱图具有较大的差异。最后优选的流动相为：乙腈为a相，含有体积浓度的0.01％的冰醋酸水为b相。2、梯度洗脱筛选由于麦冬中含有皂苷，黄酮和多糖类等多种活性化合物，峰形多而复杂，本发明通过大量实验筛选了多种不同梯度洗脱程序，当采用等度洗脱时，峰形差，分离度差，如图2所示。本发明优选得到的最佳的梯度洗脱条件为：0～59min，a相35％～62％；59～60min，a相62％；60～61min，a相62～35％；61～70min，a相35％，分离色谱如图3所示，具有良好的峰形和分离度。3、柱温的选择本发明分别在20℃、25℃、30℃、35℃和40℃柱温下分析麦冬，实验结果表明，在30℃柱温条件下，色谱峰分离情况最好，柱压也较低，因此，将30℃为最佳柱温条件。4、色谱柱的选择为了获得更加优越的分离效果，更加全面的反映麦冬的质量，本发明通过大量实验筛选了不同的色谱柱，分别筛选了江苏汉邦lichrospherc18柱(5μm，4.6×250mm)、watersnova-pakc18柱(5μm，4.6×150mm)、waterssymmetryshieldrp18柱(5μm，4.6×250mm)以及安捷伦sbc18(5μm，4.6×250mm)，如图4所示，实验结果表明，当选用安捷伦sbc18(5μm，4.6×250mm)色谱柱分离效果做好。通过以上筛选得到的最佳色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，安捷伦sbc18，型号为：250mm×4.6mm，5μm；流动相：流动相：乙腈为a相，含有体积浓度的0.01％的冰醋酸水为b相，梯度洗脱，检测波长：205nm；柱温：30℃；流速：1.0ml/min；进样量：10μl。梯度洗脱条件为：0～59min，a相35％～62％；59～60min，a相62％；60～61min，a相62～35％；61～70min，a相35％。实施例21、中药麦冬的指纹图谱检测方法，其包括以下步骤：(1)麦冬供试品溶液制备：取8批麦冬，分别粉碎，依次过3号筛，分别精密取1g，加甲醇20ml，浸渍过夜，超声处理20min，滤过，滤渣再加甲醇20ml，超声处理20min，滤过，合并2次滤液，蒸干，残渣加水2ml微热使溶解，加于已活化好的安捷伦c18小柱上，以水8ml洗脱，水液弃去，继用20％甲醇8ml洗脱，洗脱液弃去，最后用甲醇3ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇溶解定容至1ml，用0.22μm微孔滤膜滤过，即得；(2)麦冬对照药材溶液的制备；取5批的麦冬对照药材，分别粉碎，依次过3号筛，分别精密取1g，加甲醇20ml，浸渍过夜，超声处理20min，滤过，滤渣再加甲醇20ml，超声处理20min，滤过，合并2次滤液，蒸干，残渣加水2ml微热使溶解，加于已活化好的安捷伦c18小柱上，以水8ml洗脱，水液弃去，继用20％甲醇8ml洗脱，洗脱液弃去，最后用甲醇3ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇溶解定容至1ml，用0.22μm微孔滤膜滤过，即得；(3)对照品的制备精密取麦冬皂苷b、麦冬皂苷c和麦冬皂苷d加甲醇溶解成浓度分别为1.5mg/ml、1.25mg/ml和2mg/ml的混合对照品溶液；(4)高效液相色谱法测定麦冬的对照药材的指纹图谱：取步骤(2)中的5批量麦冬对照药材溶液，在适当的色谱条件下注入hplc进行分析，测得各批次麦冬对照药材的指纹图谱，以这些指纹图谱为基础，用相似度软件计算获得共有模式作为对照指纹图谱；如图1；(5)高效液相色谱法测定供试品溶液指纹图谱：取步骤(1)中的8批量的麦冬供试品溶液按步骤(4)相同的色谱条件注入hplc进行分析，测得供试品溶液的指纹图谱，如图5；(6)对照品溶液的测定：取步骤(3)的对照品溶液，按步骤(4)相同的色谱条件注入hplc进行分析；(7)将步骤(5)得到的供试品溶液指纹图谱和步骤(4)得到的对照指纹图谱用相似度软件评价相似度，具体实验结果如表1所示：并用步骤(6)的对照品溶液标定特征峰，本发明一共测定得到15个特征峰，其中9号峰为麦冬皂苷c，10号峰为麦冬皂苷d，11号峰为麦冬皂苷b。步骤(4)中色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，安捷伦sbc18，型号为：250mm×4.6mm，5μm；流动相：乙腈为a相，含有体积浓度的0.01％的冰醋酸水为b相，梯度洗脱(0～59min，a相35％～62％；59～60min，a相62％；60～61min，a相62～35％；61～70min，a相35％)，检测波长：205nm；柱温：30℃；流速：1.0ml/min；进样量：10μl。表1麦冬样品及相似度评价结果序号批号相似度118101210.982218122110.980319022210.980419032210.978519042210.979619052210.985719062220.989819072210.987由以上表1的计算结果表明，各批次麦冬指纹图谱相似度较高，均大于0.97，采用本发明提供的指纹图谱检测方法可以全面客观的反映麦冬的质量，为保证临床安全疗效具有重要的意义。2、指纹图谱精密度与稳定性取同一麦冬，按上述色谱条件在24小时内进样6次，以第一次分析所得指纹图谱为对照，其余5次分析所得指纹图谱的相似度计算结果为：0.990,0.989,0.989,0.991,0.988，说明一致性很好。3、重现性取同一批麦冬按照按上述色谱条件进行分析，以其中一次分析所得指纹图谱为对照，则其它5次分析所得指纹图谱与其相似度分别为：0.983，0.979，0.982，0.982，0.990。表明该方法具有良好的重现性。通过以上实验结果表明，本发明提供的麦冬的指纹图谱检测方法，可以客观，全面，准确的评价麦冬的质量，对保证临床疗效具有重要意义，且分析方法精密度、稳定性和重现性好。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12