一种快速检测的电化学生物传感器的制作方法

本实用新型涉及电化学领域，更具体的说，它涉及一种快速检测的电化学生物传感器。

背景技术：

下面的背景技术用于帮助读者理解本实用新型，而不能被认为是现有技术。

开发具有实际应用能力的生物传感器及其相应的制备技术，是生物传感器研究的主要目的。丝网印刷技术的应用，使批量制备一次性电化学生物传感器电极成为可能，该方法工艺简单，成本低廉，适合于电极的工业化生产。因此以电化学生物传感器为原理的丝网印刷电极在即时检测(poct)领域应用广泛。生理液体如血液、尿液、汗液、唾液中含有很多临床实验室感兴趣的检测参数，例如血液中的葡萄糖、胆固醇、糖化血红蛋白、血酮，尿液中的尿酸，汗液中的乳酸等。

目前，电极的检测原理大多是将底物所对应的酶修饰到工作电极上，通过酶促反应来测得电信号，因此葡萄糖传感器一般采用酶法，但是酶液在固定时所需条件比较苛刻，而且酶液在固定时要先在电极上滴加配置好浓度的修饰液，修饰液具有使酶液扩散的功能，待干燥后滴加酶液使酶液在电极表面迅速扩散开，此过程中修饰液的厚度不可阻挡电极表面检测酶液的反应；或者直接将扩散作用的修饰液与酶液配置到一起，滴加到电极上，此过程中容易造成酶被包裹起来，检测信号会比较弱。而且修饰液的选择与配置也是关键，选择不好极易影响酶液的反应与检测结果，极大地增加了电极试片的研发成本。

技术实现要素：

本实用新型的目的在于提供一种快速检测的电化学生物传感器，将酶液直接滴加或者吸附到渗透扩散层表面，将渗透扩散层裁切成合适大小固定到电极表面，无需配置修饰液，避免修饰液的厚度阻挡电极表面检测酶液的反应，以及酶被修饰液包裹起来的问题，而且渗透扩散层还可以起到过滤血细胞的问题，避免血细胞对于检测结果的影响。

本实用新型解决其技术问题所采用的技术方案是：一种快速检测的电化学生物传感器，包括电极层，电极层设有具有渗透和扩散性的渗透扩散层，其中，渗透扩散层覆有至少一种酶液。渗透扩散层吸附酶液，酶液在渗透扩散层上能迅速扩散，待测样本先与渗透扩散层上的酶液反应，反应后的样本渗透至电极表面再与电极作用，通过增设渗透扩散层以代替修饰液，起到使酶液扩散的作用，不存在修饰液的厚度阻挡电极表面检测酶液的反应，以及酶被修饰液包裹起来的问题。

需要说明的是，渗透扩散层具有允许待测样本通过的渗透性，且具有扩散作用。其中，电极层具有至少两个电极，分别为工作电极和对电极，还可以是三个电极，分别为工作电极、对电极和参比电极。待测样本可以是血液、尿液或者唾液，检测参数可以是血液中的血糖、尿液中的尿酸。样本检测的电化学原理：当施加一定电压于经反应剂反应后的待测样本，产生的电流会随着血液中血糖或尿液中尿酸浓度的增加而增加，通过精确测量出这些微弱电流，并根据电流值和血糖浓度或尿酸浓度的关系，反算出相应的浓度。电化学检测属于现有技术，其详细原理和检测过程在此不作赘述。

优选的，所述渗透扩散层为纤维材质。例如无纺布或尼龙。无纺布或尼龙具有良好的渗透、扩散作用，还能过滤血细胞，避免了血细胞对于检测结果的影响。优选的，渗透扩散层为滤纸。

优选的，渗透扩散层孔径为0.1-3um。

优选的，电极具有检测区，渗透扩散层覆于检测区表面。待测样本先与渗透扩散层上的酶液反应，反应后的样本渗透至电极表面再与电极作用，渗透扩散层覆于检测区表面，反应后的样本渗透后直接与电极接触，确保能得到检测结果。其中，检测区是指能与酶液作用的部分。

优选的，所述生物传感器包括第一双面胶层和第二双面胶层，第一双面胶层和第二双面胶层依次设于电极层上方，第一双面胶层和第二双面胶层均开有相互对应的窗口，渗透扩散层粘接于第一双面胶层和第二双面胶层之间，窗口与渗透扩散层对应。第一双面胶层和第二双面胶层使渗透扩散层固定于电极层。

优选的，所述生物传感器包括绝缘层，电极层位于绝缘层下方，渗透扩散层位于绝缘层上方，绝缘层开有窗口，检测区、窗口与渗透扩散层依次对应。绝缘层能覆盖住电极，避免其裸漏在外面影响检测。需要说明的是，绝缘层的窗口尺寸不限，需与检测区的区域大小一致或者大于检测区的区域均可；窗口的设置形状不限，例如方形、圆形或者不规则的形状，优选方形；窗口可为封闭状或者具有开口。

优选的，所述生物传感器包括基片层和亲水膜层，亲水膜层开有导流渠，导流渠与渗透扩散层对应，基片层、电极层、绝缘层、第一双面胶层、渗透扩散层、第二双面胶层和亲水膜层依次叠接。基片层设有导线层，导线层包括识别端子，导线层与电极层电性连接，绝缘层能覆盖住导线层，避免其裸漏在外面影响检测。从亲水膜层的导流渠上添加待测样本，待测样本依次经过第二双面胶层的窗口、渗透扩散层，与渗透扩散层上的酶液反应，反应后的样本再经过第一双面胶层的窗口、绝缘层的窗口，最后与电极层上的检测区作用。

优选的，渗透扩散层具有多层，每层渗透扩散层覆有一种酶液，多层渗透扩散层依次叠接。如果将多种酶液覆到一层渗透扩散层上，会造成底物反应不完全的情况，而且过厚会对酶活性有所影响，也可能会造成酶与底物反应后接触不到电极表面，影响电信号的检测。如果待测样本中的干扰物质种类过多，渗透扩散层上修饰多种酶会对酶活性和酶反应之间造成很大影响，如果酶活性变低则会造成干扰物质排除不完全。为多层时，每层覆有不同的酶液，待测样本依次与渗透扩散层的酶液反应，反应更充分。

优选的，电极层极修饰空白酶液，渗透扩散层覆有酶液。其中，渗透扩散层上覆有的酶液可以是一种，也可以是其中的几种，或者是为完成待测样本参数测定的全部酶液，为一种或其中几种时，剩余酶液可修饰至电极上。在这里，所述“空白酶液”是指在电极上不修饰酶液，渗透扩散层上覆有的酶液是指在电化学检测过程中需要的所有酶液，包括能与待测样本反应生成可检测的电化学活性产物的酶液，在本申请中命名为“待测样本对应酶液”；能与待测样本反应生成中间产物的酶液，在本申请中命名为“中间产物对应酶液”；能与待测样本中的干扰物反应去除干扰物的酶液，在本申请中命名为“干扰物对应酶液”等。例如，电极修饰空白酶液，渗透扩散层覆有待测样本对应酶时，此时检测参数只需要一种酶液即待测样本对应酶时即可完成检测。优选的，电极修饰空白酶液，渗透扩散层覆有待测样本对应酶液。优选的，电极修饰空白酶液，渗透扩散层覆有待测样本对应酶液时，所述待测样本对应酶液中包含葡萄糖氧化酶的含量为1%wt，酶保护剂海藻糖与牛血清白蛋白各为1%wt，导电介质铁氰化钾含量为20%wt，缓冲剂pbs含量为67%wt。电极修饰空白酶液，具有多层渗透扩散层，每个渗透扩散层覆有一种酶液时，分别覆有中间产物对应酶液、干扰物对应酶液、待测样本对应酶液，这样，加入待测样本逐一反应，最后反应后的电化学活性产物渗透至到电极上进行检测。

优选的，电极层修饰待测样本对应酶液，渗透扩散层覆有中间产物对应酶液。待测样本先与渗透扩散层上的中间产物对应酶液反应生成中间产物，反应后的样本渗透至到电极上，电极上的待测样本对应酶液与中间产物反应生成所述电极测试条可检测的电化学活性产物。如果把多种功能酶液全部固定在电极上直接反应的话，各步反应速度之间会干扰很大，而且生成中间产物时会生成不彻底，影响下一步的反应，采用渗透扩散层反应生成中间产物能使反应更彻底，每一步反应之间不会互相干扰。优选的，所述待测样本为血液，检测参数为血液中的胆固醇，电极修饰胆固醇氧化酶，胆固醇氧化酶为待测样本对应酶液，渗透扩散层覆有胆固醇酯酶，胆固醇酯酶为中间产物对应酶液。

优选的，电极层修饰待测样本对应酶液，渗透扩散层覆有干扰物对应酶液。待测样本先作用于渗透扩散层上，渗透扩散层上的干扰物对应酶液与待测样本的干扰物反应，反应后的样本渗透至电极上与待测样本对应酶液反应生成电极测试条可检测的电化学活性产物。一些待测样本中含有多种干扰物，这时，可设置多层依次叠接的渗透扩散层，每个渗透扩散层均对应一种干扰物对应酶液，将待测样本与多个渗透扩散层中的干扰物对应酶液逐一反应，以彻底去除干扰物。优选的，所述待测样本为血液，检测参数为血液中的尿酸，电极修饰尿酸酶，尿酸酶为待测样本对应酶液，渗透扩散层覆有抗坏血酸氧化酶，坏血酸氧化酶为干扰物对应酶液。

优选的，电极层修饰干扰物对应酶液，渗透扩散层覆有待测样本对应酶液。待测样本作用于渗透扩散层后，待测样本对应酶液与待测样本反应生成电极测试条可检测的电化学活性产物，反应后的样本渗透至到电极上与干扰物对应酶液反应去除样本中的干扰物质。

优选的，所述渗透扩散层处理过程为：在渗透扩散层上滴加酶液或者将渗透浸泡到酶液里，然后37℃下10min烘干。

本实用新型的有益效果：

1、通过增设覆有酶液的渗透扩散层以代替修饰液，起到酶液扩散的作用，无需考虑酶液在电极表面的扩散问题，避免了修饰液的厚度阻挡电极表面检测酶液的反应，以及酶被修饰液包裹起来的问题，检测灵敏度高，线性范围宽，提高了电极准确度，5s左右就可出结果，而且读数式操作简单，对电化学传感器的使用具有极大的意义。

2、无需考虑多种酶液修饰条件，降低了制作成本，同时简化了制作条件。

3、渗透扩散层采用纤维材质，起到过滤血细胞的作用，避免血细胞对于检测结果的影响。

4、选择性地在电极上或渗透扩散层上修饰酶液进行分步反应，可以使待测样本的酶促反应更加充分，生成最终底物更均匀，检测结果更加准确。

附图说明

图1为本实用新型结构示意图。

图2为实施例1中在设有渗透扩散层的电极上检测出的时间-电流曲线图。

图3为实施例1中在设有渗透扩散层的电极上检测出的时间-电流曲线图拟合线性。

图中标识：基片层1，电极层2，绝缘层3，第一双面胶层4，渗透扩散层5，第二双面胶层6，亲水膜层7，对电极31，工作电极32，参比电极33，绝缘层上的窗口31，第一双面胶层上的窗口41，第二双面胶层上的窗口61，导流渠71。

具体实施方式

下面对本实用新型涉及的结构或这些所使用的技术术语做进一步的说明。这些说明仅仅是采用举例的方式进行说明本实用新型的方式是如何实现的，并不能对本实用新型构成任何的限制。

下面结合附图和具体实施方式对本实用新型进一步说明。在本实用新型的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“前”、“后”、“左”和“右”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本实用新型和简化描述，而不是指示或暗示所指的位置或元件必须具有特定方位、以特定的方位构成和操作，因此不能理解为本实用新型的限制。此外，术语“第一”、“第二”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

如图1所示，一种快速检测的电化学生物传感器，包括电极层2，其特征在于，电极层2设有渗透扩散层5，其中，渗透扩散层5覆有至少一种酶液。渗透扩散层5吸附酶液，酶液在渗透扩散层5上能迅速扩散，待测样本先与渗透扩散层5上的酶液反应，反应后的样本渗透至电极层2表面再与电极作用，通过增设渗透扩散层5以代替修饰液，起到使酶液扩散的作用，避免了修饰液的厚度阻挡电极表面检测酶液的反应，以及酶被修饰液包裹起来的问题。

需要说明的是，渗透扩散层5具有允许待测样本和酶液通过的渗透性，且具有使酶液扩散的作用。其中，电极层2具有至少两个电极，分别为工作电极和对电极，还可以是三个电极，分别为工作电极22、对电极21和参比电极23，参见图1。待测样本可以是血液、尿液或者唾液，检测参数可以是血液中的血糖、尿液中的尿酸。样本检测的电化学原理：当施加一定电压于经反应剂反应后的待测样本，产生的电流会随着血液中血糖或尿液中尿酸浓度的增加而增加，通过精确测量出这些微弱电流，并根据电流值和血糖浓度或尿酸浓度的关系，反算出相应的浓度。电化学检测属于现有技术，其详细原理和检测过程在此不作赘述。

渗透扩散层5采用纤维材质。例如无纺布或尼龙。无纺布或尼龙具有良好的渗透、扩散作用，还能过滤血细胞，避免了血细胞对于检测结果的影响。

渗透扩散层5为滤纸。

渗透扩散层5孔径为0.1-3um。

电极层2具有检测区，渗透扩散层5覆于检测区表面。待测样本先与渗透扩散层5上的酶液反应，反应后的样本渗透至电极表面再与电极作用，渗透扩散层覆于检测区表面，反应后的样本渗透后直接与电极接触，确保能得到检测结果。其中，检测区是指电极能与酶液作用的部分。

所述生物传感器包括第一双面胶层4和第二双面胶层6，第一双面胶层4和第二双面胶层6依次设于电极层2上方，第一双面胶层4和第二双面胶层6均开有相互对应的窗口，渗透扩散层5粘接于第一双面胶层4和第二双面胶层6之间，窗口与渗透扩散层5对应。第一双面胶层4和第二双面胶层6使渗透扩散层固定于电极层2。

所述生物传感器包括绝缘层3，电极层2位于绝缘层3下方，渗透扩散层5位于绝缘层3上方，绝缘层3开有窗口31，检测区、窗口31与渗透扩散层5依次对应。绝缘层3能覆盖住电极，避免其裸漏在外面影响检测。需要说明的是，绝缘层3的窗口31尺寸不限，需与检测区的区域大小一致或者大于检测区的区域均可；窗口31的设置形状不限，例如方形、圆形或者不规则的形状，优选方形；窗口31可为封闭状或者具有开口。

所述生物传感器包括基片层1和亲水膜层7，亲水膜层7开有导流渠71，导流渠71与渗透扩散层5对应，基片层1、电极层2、绝缘层3、第一双面胶层4、渗透扩散层5、第二双面胶层6和亲水膜层7依次叠接。基片层1设有导线层11，导线层11包括识别端子，导线层11与电极层2电性连接，绝缘层3能覆盖住导线层11，避免其裸漏在外面影响检测。从亲水膜层7的导流渠71上添加待测样本，待测样本依次经过第二双面胶层6的窗口61、渗透扩散层5，与渗透扩散层5上的酶液反应，反应后的样本再经过第一双面胶层4的窗口41、绝缘层3的窗口31，最后与电极层2上的检测区作用。

渗透扩散层5具有多层，每层渗透扩散层5均覆有酶液，多层渗透扩散层依次叠接。如果将多种酶液覆到一层渗透扩散层5上，会造成底物反应不完全的情况，而且过厚会对酶活性有所影响，也可能会造成酶与底物反应后接触不到电极表面，影响电信号的检测。如果待测样本中的干扰物质种类过多，渗透扩散层上修饰多种酶会对酶活性和酶反应之间造成很大影响，如果酶活性变低则会造成干扰物质排除不完全。为多层时，每层覆有不同的酶液，待测样本依次与渗透扩散层的酶液反应，反应更充分。

作为一种实施方式，电极层2修饰空白酶液，渗透扩散层5覆有酶液。其中，渗透扩散层上覆有的酶液可以是一种，也可以是其中的几种，或者是为完成待测样本参数测定的全部酶液，为一种或其中几种时，剩余酶液可修饰至电极上。在这里，所述“空白酶液”是指在电极上不修饰酶液，渗透扩散层5上覆有的酶液是指在电化学检测过程中需要的所有酶液，包括能与待测样本反应生成可检测的电化学活性产物的酶液，在本申请中命名为“待测样本对应酶液”；能与待测样本反应生成中间产物的酶液，在本申请中命名为“中间产物对应酶液”；能与待测样本中的干扰物反应去除干扰物的酶液，在本申请中命名为“干扰物对应酶液”等。例如，一种情况是：电极修饰空白酶液，渗透扩散层覆有待测样本对应酶时，此时检测参数只需要一种酶液即待测样本对应酶时即可完成检测，具体的例子为：所述待测样本对应酶液中包含葡萄糖氧化酶的含量为1%wt，酶保护剂海藻糖与牛血清白蛋白各为1%wt，导电介质铁氰化钾含量为20%wt，缓冲剂pbs含量为67%wt，此时葡萄糖氧化酶为修饰在渗透扩散层上的待测样本对应酶。另一种情况是：电极修饰空白酶液，具有多层渗透扩散层，每个渗透扩散层覆有一种酶液，分别覆有中间产物对应酶液、干扰物对应酶液、待测样本对应酶液，这样，加入待测样本逐一反应，最后反应后的电化学活性产物渗透至到电极上进行检测，反应充分彻底，检测结果精确。

作为一种实施方式，电极层2修饰待测样本对应酶液，渗透扩散层5覆有中间产物对应酶液。待测样本先与渗透扩散层上的中间产物对应酶液反应生成中间产物，反应后的样本渗透至到电极上，电极上的待测样本对应酶液与中间产物反应生成所述电极测试条可检测的电化学活性产物。如果把多种功能酶液全部固定在电极上直接反应的话，各步反应速度之间会干扰很大，而且生成中间产物时会生成不彻底，影响下一步的反应，采用渗透扩散层反应生成中间产物能使反应更彻底，每一步反应之间不会互相干扰。

作为一种实施方式，所述待测样本为血液，检测参数为血液中的胆固醇，电极修饰胆固醇氧化酶，胆固醇氧化酶为待测样本对应酶液，渗透扩散层覆有胆固醇酯酶，胆固醇酯酶为中间产物对应酶液。

作为一种实施方式，电极层2修饰待测样本对应酶液，渗透扩散层5覆有干扰物对应酶液。待测样本先作用于渗透扩散层上，渗透扩散层上的干扰物对应酶液与待测样本的干扰物反应，反应后的样本渗透至电极上与待测样本对应酶液反应生成电极测试条可检测的电化学活性产物。一些待测样本中含有多种干扰物，这时，可设置多层依次叠接的渗透扩散层，每个渗透扩散层5均对应一种干扰物对应酶液，多个渗透扩散层5中的干扰物对应酶液将待测样本中的干扰物逐一反应，以彻底去除干扰物。优选的，所述待测样本为血液，检测参数为血液中的尿酸，电极修饰尿酸酶，尿酸酶为待测样本对应酶液，渗透扩散层覆有抗坏血酸氧化酶，坏血酸氧化酶为干扰物对应酶液。

作为一种实施方式，电极层2修饰干扰物对应酶液，渗透扩散层5覆有待测样本对应酶液。待测样本作用于渗透扩散层后，待测样本对应酶液与待测样本反应生成电极测试条可检测的电化学活性产物，反应后的样本渗透至到电极上与干扰物对应酶液反应去除样本中的干扰物质。

所述渗透扩散层5处理过程为：在渗透扩散层5上滴加酶液或者将渗透浸泡到酶液里，然后37℃下10min烘干。

实施例1

渗透扩散层5上覆有葡萄糖氧化酶液，待测样本是血液，检测血液中的血糖浓度。在室温下，快速检测全血血糖的葡萄糖生物传感器在电压为0.55v下对于0-20mmol/l不同血糖浓度的全血用时间电流法进行测试，从时间-电流曲线中选取检测时间分别为3s、4s和5s的多个检测点标于血糖浓度-电流图中，并分别对检测时间为3s、4s和5s的血糖浓度-电流检测点进行线性拟合，得到血糖浓度-电流线性拟合图。图中相关系数平方(r²)的大小表明电流与血糖浓度相关的密切程度，当r²越接近1时，表示线性拟合越准确，血糖传感器的检测准确性越高；相反，r²越接近0时，表示线性拟合越不准确，血糖传感器的检测准确性越低，根据全血血糖的葡萄糖生物传感器的线性图（图2和图3），可以看出具有良好的线性，检测全血血糖的葡萄糖生物传感器的测试值的相关系数平方大于0.99，具有良好的准确度。

在缺少本文中所具体公开的任何元件、限制的情况下，可以实现本文所示和所述的实用新型。所采用的术语和表达法被用作说明的术语而非限制，并且不希望在这些术语和表达法的使用中排除所示和所述的特征或其部分的任何等同物，而且应该认识到各种改型在本实用新型的范围内都是可行的。因此应该理解，尽管通过各种实施例和可选的特征具体公开了本实用新型，但是本文所述的概念的修改和变型可以被本领域普通技术人员所采用，并且认为这些修改和变型落入所附权利要求书限定的本实用新型的范围之内。

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