微液滴的体积测量的制作方法

本申请涉及微液滴领域。具体地，本申请涉及用于使用质谱法测量所分配的微液滴的体积的系统和方法。

背景技术：

微流体分配涉及流体的控制和操纵，以从整体(bulk)流体样品中提取小体积的流体进行检查。微流体分配出现于1980年代初，并且已经被用于尤其诸如喷墨打印、dna微阵列、芯片实验室技术、3-d打印头、药物库的重新格式化和微量滴定板复制、个体细胞和细胞裂解物的分配之类的各种各样的领域。

微流体分配不断成长和发展，并且现在能够分配越来越小体积的流体，通常是经由通过非接触方法传递高度精确的体积的方法。微流体分配在其中试剂价格高或可用数量有限的领域以及期望高速和高通量的应用中是特别有用的。举例来说，出于这些原因，包括高通量筛选(hts)和药理学相关的给药/分布/代谢/排泄(adme)性质的表征的药品开发及发现和与下一代基因排序相关的领域一样已经包含了微流体分配。最近，发明人已经结合了微流体分配技术，以将样品引入诸如质谱仪之类的分析测量工具。

微流体分配的基本操作涉及从相对较大的“整体”样品中分离小体积的样品材料。样品材料可以以不同形式被分配，例如，作为单个分立液滴、液滴的组、雾或样品材料的其它物理布置。取决于用于分离样品材料的具体机制，不同的分配形式在每次分配或多或少地可以是可再现的。

例如，通过液滴进行的分配已经被用于分配小至微微升范围的分立液滴。用于从样品传递小体积液滴的最常见类型的系统中的一些被广泛地表征为喷射或动态设备，示例包括例如：声学技术；压电技术；压力驱动技术；气动泵/阀技术；电场驱动技术等。这些分配设备全都转移被引导进入整体样品中的所测量的量的能量，以便从整体样品流体中分离出以一个或多个液滴的形式的所期望的样品体积。

从整体样品流体分配液滴所需的能量的量与整体流体的流体性质相关，其中粘度和表面张力是主要考虑。控制由分配设备生成并转移到整体样品流体中的能量的分配参数需要专门针对整体样品流体的流体性质具体定制，以便传递具有足够从整体样品流体脱离的能量的目标液滴体积。

由于问题的复杂性，与针对给定整体样品流体的所期望的液滴体积对应的具体分配参数的选择是通过一个或多个分配参数的经验调节过程来实现的，分配一个或多个液滴、测量这一个或多个液滴的分配体积、调整分配参数以及迭代地重复该序列直到识别出一致地传递针对整体样品流体的所期望的液滴体积的分配参数为止。不管所使用的分配技术如何，分配参数常常是相互依赖的，从而由于对一个分配参数的调整可能影响对其它分配参数的调节，因此使该调节过程是高度参数化的。

声学液滴分配在商业上用于将液体样品从一个微量滴定板转移到另一个微量滴定板上，这就是所谓的板复制和重新格式化。还开发出用于将样品从各种配置的试管转移到微量滴定板中的分配器。发明人使用声学液滴分配来将受控制体积的样品引导到捕获探针中进行收集和转移，以用于通过质谱仪进行质量分析。

作为液体分配的示例，声学液滴分配(add)是用于将液滴从微量滴定板中的样品孔(samplewell)非接触地、体积准确且精确地转移到第二微量滴定板中的对应样品孔的技术。声波形式的能量的使用允许以分立液滴形式的流体的转移在条件高度受控制时是非接触的、体积准确且精确的。微量滴定板中的典型孔密度为每个微量滴定板96、384和1536个孔，并且用于分配的典型液滴体积在1-20nl的范围内。

可以分配大于20nl的体积，期望的是这些液滴在解吸后由于流体不稳定性而会出现碎裂。可以将多个液滴顺序分配到目标孔中，以累积达到所期望的分配体积。药物研究与开发组织广泛使用这种方法来从其庞大的药品库中分配通常溶于二甲基亚砜中的小体积化合物，从而在针对生物活性的hts分析筛选以及确定药物性质的adme分析中进一步进行测试。

例如，声学分配器通过用rf功率供给能量的压电振动器产生声波，并且通过金属透镜经由耦合流体转移到样品孔的底部。使用耦合流体将金属透镜连接到样品孔的底部，因为由于声波通过气态介质迅速减速，因此必须避免气隙。声波传播通过可以由各种兼容的塑料或其它材料构成还具有各种厚度和形状的样品孔的底部，然后行进通过样品的流体到达表面处的弯液面。此时，当声波在液-气界面处减速时出现压力扰动，这在适当条件下会将已知体积的液滴以精确且可再现方式准确发射至表面上方几厘米处。

诸如基于气动或压力的液滴分配器之类的其它液滴分配器的操作可以基于正被分配的液体样品的物理参数在液滴分配方面类似地变化。

可以通过调整与该分配器类型密切相关的多个物理参数来控制分配器的操作。例如，声学分配器可以变化频率、功率、方向、持续时间或猝发率、聚焦位置等，以便从液体样品生成液滴。确定在设置分配设备的操作参数时将什么值用于这些物理参数以从具有不同流体性质和深度的液体重复传递所期望的液滴体积是被称为校准的过程。样品、板和环境性质的变化需要调整物理参数进行补偿。确定将什么值用于物理参数以传递所期望的液滴体积是被称为“校准”的过程。

例如，在声学分配器的情况下，需要校准声学参数，以便可再现地分配准确且精确的液滴体积。液滴体积测量对于校准过程是主要的。具有不同流体性质的样品需要特有的校准文件，并且在样品的不同深度处需要特有的校准文件。然而，仪器中的声波频率、功率、能量持续时间(重复或猝发率)、焦点以及压电换能器和透镜元件的各个特性全都影响所分配的液滴的体积。用于传递指定液滴体积的这些参数的值强烈取决于整体溶液的粘度和表面张力性质。出于该原因，需要针对具有不同粘度的不同液体的校准文件。也可以需要针对样品孔中不同深度的特定流体的校准文件，因为当能量通过流体行进到达沉积能量以发射液滴的表面时，能量消散。由于压电换能器和相关联的透镜组件的制造的变化，因此校准文件特定于每个个体仪器。

校准是多步骤的迭代过程，其涉及调整物理参数(例如，声学功率、频率、重复或“猝发”率，以及用透镜将波聚焦到靠近样品液体表面的点)。其值受到样品流体的粘度的影响，该样品流体的粘度将改变样品液体的表面张力，从而改变发射液滴所需的功率。样品、板和环境性质的变化需要调整物理参数进行补偿。

在每次体积测量之后，迭代地调整声学功率、频率和重复或“猝发”率的物理参数并且重复体积测量。越接近正确的体积，需要的调整越少。最终，只有一个参数需要精细调节，而所有其它剩余参数都保持固定值，从而减弱该过程的参数化本质。一些方法提供了保持频率和功率固定并且仅调整猝发率和聚焦距离，但是可以调整所有这些参数以实现目标液滴体积。

另外，波必须行进到达表面的距离将影响波的焦点的位置，该位置是通过定位聚焦透镜来控制的。该距离随孔中的样品的体积的变化而变化，当样品由于分析的本质而被分配、蒸发或逐个样品地变化时，该样品体积随时间而改变。必须针对每个孔准确确定并且按透镜位置来调整该距离。这是通过测量声波反射返回到压电发射器(也用作检测器)所花费的时间来进行的。如果声音在样品流体中的速度是已知的，则可计算到表面的距离。对于许多类型的流体混合物，声音的速度是未知的，因此必须由仪器进行测量。确定声音在任何样品流体中的速度是校准过程的第一步。一旦针对已知的整体样品成分确定了声音的速度，就存储数据并将该数据用于确定待分析的所有孔中的流体深度。一旦确定了特定流体中的声音的速度，就不必再重复。

通常，常规的校准操作是在维修工程师采用一系列迭代方案、uv吸收化合物或发光荧光团的标准化参考溶液和分光光度计在工厂或现场进行的，分光光度计测量光的透射、吸收或发射以确定所分配的液滴的浓度，该浓度可以被转换成液滴体积。从包括光发射或吸收参考溶液的样品发射预定数量的液滴，通常为10-200个液滴，然后将样品稀释至比液滴的总体积大得多的已知体积，并且用分光光度计来确定浓度。当使用声学分配进行板复制或重新格式化应用时，校准通常不成为问题，因为样品流体成分是明确且均匀的，通常为100％的dmso且几乎没有其它任何东西。药物库化合物在该溶剂中的浓度没有高到足以实质性影响流体粘度。

在流体成分不明确且在样品之间可能变化的情况下，每当遇到具有充分不同流体性质的样品时，会需要根据经验确定用于创建新校准文件的参数。小变化可能具有大影响，例如，由于由生物溶质在水溶剂中引入的流体性质，来自不同患者的血浆或来自在孵育的不同时间获取的发酵培养基的样品。具有不同溶剂比例的样品需要不同的校准文件，例如，醇与水的不同组合。几个百分点的变化可以需要不同的校准文件。商购的声学分配板复制器仪器提供了已经针对有限数量的液体在制造现场创建的校准文件。

当使用具有不同材料成分和维度的不同类型的样品板时，也需要新的校准文件，其中声波穿越的孔的底部的厚度和成分特别重要。另外，在孔内的流体的不同深度处需要单独的校准文件。通常，对于一些分配器，将记录在384板孔中的流体的不同深度处的100个单独的校准文件。

校准文件在仪器上被存储、重新使用并且不一定被替换，只要样品成分和板类型保持恒定即可。由于压电生成器和金属(通常是铝)传输/聚焦透镜的细微差别，导致每台仪器将具有特有的设置。

在样品成分可以广泛变化且不可预测的情形下，校准问题是严重的障碍。

技术实现要素：

本申请的实施例涉及液滴生成和分析的领域，其中可以以小样品液滴的形式从整体液体分配所测量的液体样品，并且需要准确地确定个体液体样品液滴中的每一个的体积。在一些实施例中，可以使用体积确定来校准液滴生成器，该液滴生成器从整体流体分配样品液滴。在一些实施例中，可以校准液滴生成器，以提供一致、可重复的液滴分配。针对被指定用于附加样品操纵的液滴、针对表面上的沉积以及针对关于液滴的成分的分析测量，需要准确且精确的体积测量。

在一些实施例中，提供了用于校准声学液滴分配器以进行准确且精确的液滴体积传递的方法和装置。

为此原因，非常期望的是可以出于快速校准沉积参数的目的以实时方式准确测量液滴体积的系统。这对于其中流体性质可以逐个样品地以不可预测的方式改变的生物样品是特别重要的。对于其中正在来自样品的液滴中测量溶质的比重测定质量的应用，需要用于同时确定该液滴的体积的手段，以便得知道其浓度。

在一些实施例中，提供了用于校准液滴分配器的方法，该液滴分配器从液体样品分配样品液滴，该方法包括：提供液体样品，该液体样品包括已知校准物浓度的校准物；从液体样品分配假定液滴尺寸的液滴；将假定液滴尺寸的液滴离子化；使用质谱仪测量离子化的液滴中的校准物的校准物质量；以及通过将基于假定液滴尺寸的预计校准物质量与所测量的校准物质量进行比较来确定实际液滴尺寸。

在一些方面中，方法可以包括：确定实际液滴尺寸与假定液滴尺寸的差异大于阈值尺寸；以及基于液滴尺寸差异的大小和符号中的至少一个来调整液滴分配器的至少一个液滴分配器参数。在一些方面中，方法可以包括使用先前调整的该至少一个液滴分配器参数重复地从液体样品分配后续假定液滴尺寸的后续液滴，将后续液滴离子化，测量离子化的后续液滴中的校准物的后续校准物质量，通过将基于假定后续液滴尺寸的预计后续校准物质量与所测量的后续校准物质量进行比较来确定实际后续液滴尺寸，并且调整液滴分配器的该至少一个液滴分配器参数，直到实际后续液滴尺寸与假定液滴尺寸的差异小于阈值尺寸。

在一些实施例中，提供了用于测量由流体分配器分配的流体的体积的系统，该系统包括：捕获探针，用于从流体分配器接收和捕获所分配的一定体积的流体，所分配的一定体积的流体包括校准标准物；离子化源，用于将所捕获的一定体积的流体离子化；以及质谱仪，用于测量离子化的一定体积的流体中包含的校准物的质量。

在一些方面中，系统还包括被引入到捕获流体的输送流体中的已知浓度的参考化合物。

在一些方面中，系统进一步操作以基于校准物的质量来确定所测量的流体的体积。

在一些方面中，系统进一步操作以基于所测量的校准物的质量与所测量的参考化合物的量之比来确定所测量的流体的体积。

附图说明

本领域的技术人员将理解，以下描述的附图仅仅是出于说明目的，并不旨在以任何方式限制本教导的范围。

图1a和图1b是本教导的实施例的示意图。

图2图示了本教导的系统的实施例。

图3a、图3b和图3c图示了本教导的实施例的各种取向和配置。

图4a、图4b、图4c和图4d图示了本教导的捕获探针的各种实施例。

图5和图6图示了本教导的替代实施例。

图7描绘了耦合到样品孔的声学分配器的截面图。

图8图示了将微液滴分配到捕获探针中的液滴分配器的另一实施例。

图9图示了所测量的包括校准物的样品的信号。

图10图示了校准曲线。

图11图示了质谱仪中的参考化合物的信号。

图12图示了另一校准曲线。

图13图示了另一校准曲线。

图14图示了原位动力学测量的实施例。

图15图示了来自示例原位动力学测量的数据。

图16图示了来自从样品孔高频分配以进行质量分析的示例的测量数据。

图17图示了说明对于被注入到捕获探针中的血浆没有离子抑制的测量数据。

图18图示了说明对于被注入到捕获探针中的表面活性剂(tween20)没有离子抑制的测量数据。

图19是图示分配到捕获探针的样品处理区域中的液滴的简化示意图。

图20图示了校准曲线的实施例。

具体实施方式

在一些实施例中，提出了用于从整体样品流体分配样品液滴和对所分配的液滴进行体积测量的系统和方法。在许多领域中，针对被指定用于附加样品操纵的液滴、针对表面上的沉积以及针对关于液滴的成分的分析测量，需要准确且精确的体积测量。

出于说明上述问题的目的，本申请详细描述了利用基于声学的非接触式分配器的实现方式。尽管本申请和示例主要针对采用声学微流体分配设备的实现方式，但是本申请料想到各种分配技术，包括而不限于声学技术；压电技术；压力驱动技术；气动泵/阀技术；以及电场驱动技术。

在一些实施例中，提出了用于准确且精确地测量微微升至微升范围内的个体液滴的体积的系统和方法。在一些实施例中，系统和方法可以包括捕获液体的流动流中的微分配的液滴，并且将它们输送到质谱仪的大气压离子源以进行测量。通过确定液滴和输送流体中校准和参考化合物的比重测定质量，可以确定每个液滴的体积。测量快到足以在以高达10hz的速率分配液滴时进行实时体积测量。系统和方法可以独立于溶剂和样品成分进行操作，并且适用于来自各种源的生物流体。

本文描述的方法发明涉及使用质谱仪测量以已知浓度添加到样品中的参考标准物的比重测定质量来确定和校准所分配的液滴的体积。每当发射液滴时，可以调整校准参数，并且通过质谱仪测量其体积，然后进行参数调整以使参数达到目标值。由于质谱仪也是分析测量工具，因此如果在如关于发酵示例指出那样的其中样品粘度高度不可预测的情形下需要校准，则可以在分析测量之前对每个样品进行校准，这以其它方式被称为“即时校准(calibrationonthefly)”。如果校准参数仅略有偏离从而导致与目标分配体积的偏差小，则重新校准每个样品的替代方法是在分析测量期间用质谱仪测量体积，记录轻微的体积差异，并且在后续浓度计算中考虑该体积差异。

本文描述的实施例可以使用捕获探针作为与质谱仪的接口来实现，以便捕获所分配的液滴以进行体积测量。合适的捕获探针的示例包括“开放端口探针”(opp)，opp是多项sciex得到许可的专利的主题，并已成功用于捕获所分配的液滴以进行分析测量。参见例如通过引用全部并入的us9,632,066bs-开放端口采样接口、us2016/0299041a1-捕获探针以及us9,153,425b2-用于样品的高空间分辨率化学分析的设备和用于高空间分辨率化学分析的方法。本发明描述了包括opp的捕获探针的新用途。

在一些实施例中，捕获探针可以被修改以将内部标准物引入输送流体。可以使用样品中的参考标准物与输送流体中的内部标准物之间的响应比来计算每个液滴中的参考标准物的质量，进而计算其体积。由于质谱仪性能随时间而变化，因此响应比将保持恒定而没有经历漂移。这样就无需构造用于连续地计算液滴体积的参考标准物浓度与ms响应(峰面积)的校准曲线。这种在输送流体中使用内部标准物的方法也提高了测量准确性。

快速确定被单独分配的液滴的体积的能力提供了当通过质谱仪确定样品中溶质的比重测定重量时准确且精确地确定那些溶质的浓度的手段。它还提供了校准液滴分配器的手段，并且该系统适用于各种液滴生成器。当待分配的样品的流体性质不可预测并且需要实时地重新校准分配器的参数时，这一点特别重要。当将对液滴内的成分进行测量并且需要确定液滴中那些成分的浓度时，这也是重要的。

与板复制不同，作为将样品引入质谱仪以进行分析测量的手段的声学分配可能遇到成分进而粘度不同且通常未知的样品。由于与板复制工具形成对照的是，质谱法是用于各种应用和样品类型的分析测量工具，因此具有快速且自动地逐个样品地按需要调整物理参数的手段将是有利的。将这种逐个样品地校准的能力称为“即时校准”。

特别地，发明人提出了针对从样品到样品在成分方面可能广泛变化的生物和发酵产物使用声学分配。其中样品成分将变化的情形的示例是普遍的。待分配的样品可以来自涉及液-液或固相提取技术的制备方案，其涉及具有不同浓度的醇、乙腈或者诸如氯仿或己烷之类的与水互不相溶的溶剂的提取流体。血浆样品中的蛋白质沉淀是常见的，并且涉及向水介质添加大量有机溶剂，以造成蛋白质离开溶液。在如同这些的情形下，对所得溶剂成分的一些理解在一定程度上被理解并且是可预测的，但是针对这些各种介质的校准过程必须是用户可用的。

其中样品成分进而粘度可以以不可预测的方式发生彻底改变的情形是常见的。监测来自哺乳动物、酵母和细菌细胞培养物的生化反应产物是个示例。在细胞的生命周期改变期间，培养基的整体化学成分有实质性变化。据报道，在发酵或孵育时间的开始和结束时存在的培养基可以以声学方式被分配，但是在中间时间段期间分配失败。看来在这些失败时段期间产生大量复杂的碳水化合物，从而导致足够高的粘度变化以致使原始校准参数不足。处理这种类型情形的唯一方法是“即时校准”。

通常，使用分光光度计测量来自已知浓度的所分配的校准化合物的光的透射、吸收或发射。它利用具有溶解在待校准的样品溶剂或基质中的已知浓度的uv吸收或发光荧光团校准化合物的标准化参考溶液。

由于分光光度计是浓度敏感的检测器，因此它们使用例如比尔·兰伯特定律(beerlambertlaw)表示的关系来测量所分配的样品的浓度。该过程涉及在孔中分配预定数量(通常，100-200个)的液滴，后续用已知体积的稀释剂稀释孔中液滴的总集合。稀释剂远远超过了所累积的液滴，以使得可能用基于分光光度计的板读取器进行测量。在一些情况下，可能在此时将移液误差引入测量。

从该描述中可以清楚的是，常规的分光光度校准方案从液滴的集合测量平均体积，并且因此不测量个体液滴体积。

为了能够计算出所累积的液滴的体积，需要对液滴加上稀释剂的总体积进行准确的计量。使用这种方法引入另外的误差，因为它假定总体积等于所添加稀的释剂的体积。这是因为，由液滴贡献的体积是未知的，因为系统尚未被校准。如果稀释剂的体积比所分配的液滴的体积大得多，则该误差被最小化，但是仍然有误差。如果使整体溶液的体积(即，所分配的液滴加上稀释剂的总体积)达到已知体积，而非通过添加已知体积的稀释剂，则从理论上可以消除这种误差来源，但是这带来了麻烦，需要将液滴捕获在带有准确体积测量标记的瓶管中，标记位置的变化以及液体弯液面的瞄准是大的误差来源。随着校准的进行，重复每个步骤，并且目标液滴的体积被逐渐收敛，从而减少了这种误差来源，因为总体积可以被更准确地确定为稀释剂的体积加上所分配的液滴的体积。

用于避免这些误差来源以及通过执行迭代重复校准来校正它们所花费的时间的手段是直接测量每个液滴中的校准化合物的质量，以从已知校准物浓度计算液滴体积。用分光光度方法，这是不可能的。所提出的基于质谱法的校准系统直接测量每个液滴中的校准化合物的质量。

分光光度确定稀释至较大体积的所累积液滴的浓度需要构造由已知浓度的染料制备的标准曲线。尽管所分配的样品被充分稀释，但是最佳实践是在与正被测量的未知物相同的溶剂中制备不同校准物浓度。这是因为，可出现样品中的成分对光的发射或吸收的衰减或放大。淬灭现象将使信号衰减，发光现象将放大信号，这二者将改变标准曲线的线方程。

出于该原因，待校准的每种新的每种液体类型和样品基质需要新的标准曲线。这使所涉及的时间和劳力增加，并且妨碍了针对逐个样品进行的快速校准自动化的过程。所提出的基于质谱法的校准系统引入了主标准曲线(masterstandardcurve)的概念，该主标准曲线方便地提供了可以用于计算液滴体积而不管待分配的样品类型或体积如何的单个标准曲线。

对总稀释样品中染料的浓度的分光光度确定允许计算被分配以实现该浓度值的校准物的质量。知道了所分配液滴中校准物的原始浓度，可以计算所分配液滴的累积体积。计算出的累积体积除以所分配的液滴的数量提供了平均液滴体积。该值没有提供在所分配液滴的那个群体内的体积变化的指示。如果重复的测量提供了相同的平均值，则仍然没有批内误差的指示。液滴既可以是在均值左右大的也可以是在均值左右小的。

本基于质谱法的校准系统在分配后立即测量每个个体液滴的体积，从而提供对每个液滴变异性的准确评估以及用于校正它的手段。

如下所述，可以快速地确定孔中流体的深度。该方法是基于声纳的原理。

当对于单种样品类型，要理解孔内不同液位需要不同的校准文件时，校准任务所需的时间和劳力以指数方式增加。声波的能量在其行进通过流体时消散，因此随着深度的增加，需要增加声波的功率和/或持续时间。通过变化施加到换能器的电压或者替代地变化将能量沉积到表面的时间的长度(有时被称为猝发率)来调节功率。由于表面立刻存储所沉积的能量，因此更长的时间将沉积更多的能量。在实践中，对电压和猝发率二者进行精细调节，以提供用于实现目标体积的功率。

通常，对于384孔板中那样多的深度位置，需要多达100个单独的校准文件。由于在每个液位都引起以上概述的校准过程，即，在声学参数的每次迭代之间，100-200个液滴被分配收集、稀释以及通过荧光测量其浓度，因此存在固有的量子力学问题，即，测量使得正在被测量的东西失真。正在尝试建立不同深度处的校准，而同时深度正在改变从而更改了校准参数。液滴体积测量将液位降低超过100-200个所分配液滴的足够量，以在分配系列开始时与在结束时需要不同的功率设置。为了对此进行校正，每个液位处的校准过程被重复几次，以平均掉误差。

本基于质谱法的校准系统避免了量子力学问题，因为是对个体纳升尺寸的液滴执行了体积测量和参数调整。因为单滴带来的液位改变可忽略不计。

声学液滴分配要求可以出于校准目的以及为了样品的常规分配二者而快速且动态地测量待分配液体的深度。测量深度不需要分配液滴，因此不涉及测量所发射的液滴的体积。因此，不管测量和校准液滴体积所采取的方法如何，用于测量深度的过程是相同的。校准或常规分配的这一方面与所描述的用于液滴体积测量的分光光度法或质谱法相同。然而，当考虑样品孔中的液体深度与液体体积的关系时，质谱法有优势，因此下面包括了对深度测量的详细描述。

由于分配、蒸发或采样方法的损耗，每个样品孔中的液位可以变化，因此，在正常的实验室操作中，每个孔中样品的体积可以显著变化。需要了解到弯液面的距离来将声波的焦点设置在表面处或附近几百微米内，以将能量集中在针对每个样品的液滴的发射点处。声学功率要求也随着深度的增加而增加。因此，需要在分配事件之前并且针对待调用的正确声学校准文件对每个样品孔进行深度测量，以允许声学换能器组件上的透镜被机械定位到适当焦距。该方法需要确定或得知通过样品液体和包含液体的板的底部的声音的速度。可以通过计算声波从表面反射回到还用作声波检测器的压电发射器所花费的时间来直接测量声音的速度。

出于两个原因，必须确定样品孔中的流体的深度。

第一，根据典型的深度变化，对于不同的液体深度，通常需要不同的校准文件。例如，通常完成了从384孔密度板每分配200nl的流体之后的校准文件。这将相当于每个孔有大约100-200个校准文件，以覆盖样品孔中可能的流体深度的全部范围。由于声波的功率在它们穿越流体时逐渐消散，将相同的功率传递到不同流体深度处的表面对于更大的深度需要更高的能量。通过变化施加到换能器的电压或者替代地变化将能量沉积到表面的时间的长度(有时被称为猝发率)来调节功率。由于表面立刻存储所沉积的能量，因此更长的时间将沉积更多的能量。在实践中，对电压和猝发率二者进行精细调节，以提供用于实现目标体积的功率，但是当正确值收敛时，一个参数可以保持固定，而剩余一个参数被用于精细调节设置。

第二，对于常规采样，需要针对不同的液体深度进行透镜聚焦。为了有效地喷射样品液滴，需要用透镜将校准后的声波聚焦到样品液体的表面处或附近的点，通常在表面的几百微米内。常见的做法是将声波聚焦到表面上方200μm的点。通过聚焦透镜的物理位置来控制焦点。该距离是孔中样品的体积和孔几何形状的函数。当样品由于实验室操作的本质而被分配、蒸发或逐个样品地变化时，样品的流体水平可以随时间而改变。必须针对每个孔准确确定并且针对透镜位置来调整该距离。这可以在分配每个样品之前立即确定，或者可以通过在从所选择的一个或多个孔分配之前顺序地处理板中的所有样品孔而作为批处理模式(batchmode)被执行。

深度测量是通过测量通过样品孔的底部向上传递的声波反射返回用作声波的发射器和检测器二者的压电换能器所花费的时间来执行的。所发射的声波的部分的反射发生在传输介质改变状态(从固体到液体到气体)的每个点处。从孔板的底部、从固体孔板底部到样品液体的过渡以及从观察到最强反射的液体样品的表面处的弯液面发生反射。这可以在测试已知的板底部厚度和已知的液体深度时确定通过板底部和液体样品二者的声音的速度。

一旦通过一定材料和厚度的板确定了声音的速度，那些值就针对这种类型的所有板保持不变，并且存储信息。一旦确定了通过液体介质的声音的速度，就针对该整体成分的所有样品都保持不变，并且存储信息。包括透镜的机械重新聚焦的整个过程花费大约数十毫秒，以允许在分配之前对每个样品孔进行该测量。

板复制器应用通常遇到有限数量的不同溶剂类型，100％的二甲基亚砜是用于存储药物库的最常用溶剂，并且因此，穿过样品的声音的速度通常是一致的。带有孔特征的板也是标准。因此，在该应用领域中，在许多不同系统中创建大量校准文件和测量声音的速度的要求并不强烈。

所提出的应用截然不同，其涉及使用质谱仪分析生物流体并测量溶解在其中的化合物的量并且基于其分子量和化学键碎裂模式来识别化合物。在生物和工业过程中遇到几乎无限数量的具有不同流体性质的样品，所有这些都需要特有的校准文件。

举例来说，发明人已经对在发酵过程期间随时间收集的发酵产物执行了add-opp，并且观察到测量是不一致的，因为在发酵期间流体性质充分变化而偏离了校准的所假定的流体性质。在测量诸如血清之类的生物产物时出现了类似的问题，其中声学液滴喷射可能对于一些样品有用，而对于其它样品表现出足以产生错误测量结果的偏离。

为了全面，下面是用于确定系统中的声音的速度和孔中的流体的深度的方案的示例。为了执行该方案，不分配液滴，仅测量来自相变的声波反射的时间。

(a)针对已知样品体积(已知距离或路径长度)、其中声音的速度已知的样品成分以及已经针对其建立该测量的板测量反射时间。这建立并检查了基线参数。

(b)针对已知体积(例如，针对给定样品孔几何形状的已知深度和已知路径长度)、已知样品成分和未知板测量反射时间。通过比较来自(a)与(b)的结果，这建立了声波穿过该板的底部的声音的速度和飞行时间。这对于这种类型(即，相同的制造商、相同的样式(板厚度)、相同的材料(塑料类型))的所有其余板将保持恒定。该板现在是永久记录在数据库中的已知板。

(c)针对已知体积(例如，针对给定样品孔几何形状的已知深度和已知路径长度)、未知样品成分和已知板测量反射时间。通过比较来自(b)与(c)的结果，这提供了声波穿过新流体的该深度的飞行时间，进而提供了该介质中的声音的速度。从此，使用该整体流体成分将保持恒定。现在，可以对每个孔进行该深度测量，随后加载正确校准文件，根据需要适当调整透镜位置，并且在每孔数十毫秒的时间帧内解吸液滴。

(d)建立样品储存器的流体体积与流体深度关系。孔板的不同型号和样式具有不同的样品储存器几何形状，不同的样品储存器几何形状转化为液体的不同体积，该液体的不同体积占用液体的不同深度水平。体积与深度之间的这种关系对于得知何时样品孔正接近空状态是特别重要的。从深度测量得知剩余的体积使人能够得知在孔非常接近空以致于认为进一步分配是不可靠的之前可以再分配多少液滴。在一些实施例中，所提出的系统可以操作以维持对每个孔中的样品体积的估计，并且提供针对特定孔估计的样品体积/流体高度是否太小(即，低于针对该样品孔几何形状的阈值)以致于不能够从该孔进行预期的液滴喷射的指示。

在已建立校准参数以传递可靠的液滴体积后，可以针对不同的孔板设计准备这种关系的表格。分配所定义数量的已知体积的液滴，并且重新测量深度。继续进行该过程，直到样品达到用于分配的最小可行体积为止。通常，每次深度测量分配大约100个液滴，总计每个水平在100–500nl之间。

由于本基于质谱法的校准系统准确地测量了每个液滴的体积，因此建立流体体积与流体深度关系并不需要系统对每个液滴准确地分配已知体积。替代地，本基于质谱法的校准系统仅需要对由捕获探针捕获的所分配液滴的数量进行计数并且测量/确认每个液滴的体积。因此，本基于质谱法的校准系统不需要经完全校准的分配系统就位以便执行流体深度测量。

以声学方式将样品分配到质谱仪系统中的目的将是实现以下性能指标。

1.高速。实现了快至当前hplc方法的10-100倍的样品引入速率。需要每个样品大约数百毫秒的速度。

2.避免由于样品的交叉污染而导致的误差。样品不直接接触表面。“非接触”，例如，通过避免额外的移液。

3.针对单次分析测量消耗少量样品(优选低纳升体积)。

4.对于样品引入的速率进行灵活控制。根据质谱测量的需要，每个样品的数据获取时间可以从数百毫秒延长至数十秒。

5.鲁棒且可靠。将能够无失败地长时间保持高速的样品引入速率。每天能够连续操作至少100000个样品。

6.无需样品预先提纯。可以直接分析血液、血浆、发酵培养基等，尽管这会引入新的灵敏度限制。

7.定量精确且准确。所分配体积的变化系数和质谱信号的变异性总计<10％。

8.检测和定量的下限。低nm。低十亿分之几。

9.适用于广泛范围的化学种类。分子量的范围从<50amu至超过100000amu的分子。

10.接受在分析时间之前其性质不可预测也不一定已知的各种各样的样品流体。包含高浓度的可以更改流体性质的溶质(诸如蛋白质、多糖、醇等之类)的水性和非水性物。为此，需要逐个样品地调节或校准声学分配器。为了这么做，需要在每次分配期间或至少在采样时段内测量每个液滴样品体积的手段。

性能指标1-3。声学驱动的板复制器仪器已展现在与样品没有任何直接物理接触的情况下以几hz分配低纳升液滴体积的能力。为了实现其余的六个属性，用于将声学生成的液滴耦合到质谱仪离子源的方法将开始起作用。

性能指标4-9。已经开发出将声学生成的液滴转移到电喷雾质谱仪离子源的方法，该电喷雾质谱仪离子源通过液体流输送液滴，被称为开放端口探针(opp)。在通过引用并入本文的wo2019/104235(pct/us2018/062337)中更详细地描述了该接口。如下面更详细描述的，具有以下描述的一些附加修改的该接口实现了以上的性能指标4-9。

性能指标4。通过捕获和合并流动的溶剂流中的各个所分配液滴，opp可以将来自声学分配器的离散数字信号变换成连续的离子束。这是在针对典型的捕获探针溶剂流速/体积将液滴以10hz或更高的速率分配到opp中时发生的。这样做，可以将样品引入时间调整到质谱仪获取方法。例如，较长时间段内的信号求平均可以被用作降低检测限制的手段。在样品引入时间内进行动态控制的情况下，使用诸如swath之类的扫描模式进行的与复杂生物样品中的所有成分的ms/ms耦合的离子迁移率分离变得切实可行。使用声学液滴分配甚至在相对较长的时间段内消耗少量样品。此外，可以适应一系列的孔尺寸，其中较大的孔体积支持延长的从孔采样的时段。

性能指标5。opp输送流体是使用气体压力降泵来传递的，该气体压力降泵因其没有任何机械移动零件所以高度可靠。另外，流体输送管的孔口大，并且固有地抗堵塞。

性能指标6。opp将声学分配的液滴稀释>100倍(或更多倍)，这允许避免样品提纯步骤。当样品被稀释到这种程度并且在采样之后且在离子化之前稀释是瞬间的时，不发生对电喷雾离子化过程的抑制。可以直接注入血液样品，并且可以在不干扰反应混合物的成分的情况下在进行过程同时监视生化反应。

性能指标7。opp将样品传递到标准电喷雾离子源，该标准电喷雾离子源在历史上已表现出具有高精度和准确性，从而提供小于10％的cv。声学分配的准确性和精度在这里也起作用。

性能指标8。opp将样品传递到标准电喷雾离子源中，该标准电喷雾离子源在历史上已表现出具有高灵敏度，将分子高效转化为离子并将离子输送到真空系统中。流速支持高灵敏度和鲁棒操作二者，并且在微流范围内，每分钟数十至低数百微升。

性能指标9。opp将样品传递到标准电喷雾离子源，该标准电喷雾离子源在历史上已表现出具有用于质谱法的任何离子源的最高化合物覆盖范围。

然而，用于校准声学分配器的当前方法无法应对性能指标10。通常分析正由质谱仪测量的生物系统，其中流体具有大范围的流体性质和粘度并且可以在反应或孵育期间以不可预测的方式随时间改变。与板复制工具形成对照的是，质谱法是用于各种应用和样品类型的分析测量工具，并且因此将需要可用的用于快速且自动地逐个样品地根据需要调整物理参数的手段。为了使add-ms成为可行的技术，当遇到不同粘度的样品时，用于校准声学参数以将准确且精确的体积自动传递的手段。将这种逐个样品地校准的能力称为“即时校准”。

其中样品成分会变化的情形的示例普遍需要即时校准。血液样品可以具有取决于血细胞比容而大不相同的粘度。在向血液或血浆添加了防腐剂或进行了一定程度的提纯以保存样品的情况下，诸如醇、酸、盐或其它稀释剂之类的更改粘度的添加剂将影响它们的流体性质。尿样品的粘度受个人的健康状态的广泛影响。来自不同物种的生物流体的性质的差异大。

其中样品成分进而粘度可以以不可预测的方式随时间而彻底改变的情形是常见的。在孵育时间段内监视发酵和细胞培养基是好的示例。在细胞的生命周期的改变期间，培养基的整体化学成分有实质性变化。据报道，在发酵或孵育时间的开始和结束时存在的培养基可以以声学方式被分配，但是在中间时间段期间分配失败。看来在这些失败时段期间产生大量复杂的碳水化合物，从而导致足够高的粘度变化以致使原始校准参数不足。处理这种类型的情形的唯一方法是即时校准。

本发明提出了用于测量用微分配技术分配的个体液滴的体积的方法和装置。其使得能够进行即时校准，这利用质谱仪直接测量个体液滴中的校准物的质量，并且利用修改的opp捕获液滴，将它们输送到大气压离子化质谱仪中，并且传递参考化合物，以提高所得到的液滴体积测量值的准确性和精度。

质量敏感与浓度敏感方法。质谱仪是质量敏感检测器，也是基于分子的质荷比来测量分子的分子量的设备。由质谱仪确定样品中的化合物的量或质量是通过以下进行的：在已经通过诱导电子的欠缺或过剩而向样品中的该化合物的分子赋予净电荷(被称为离子化的过程)之后，对分子的数量进行计数。类似地，放射性同位素检测器通过对每单位时间的核衰变粒子的数量进行计数来直接测量样品中的化合物的质量。在大多数情况下，光谱法例如利用比尔·兰伯特定律中表达的关系来直接从光的吸收、透射或发射确定溶液中的分子的浓度。

液滴中已知浓度的校准化合物的质量的直接测量直接提供了该液滴的体积。测量液滴中已知浓度的校准化合物的浓度并没有直接提供关于其体积的信息。其体积可以通过以下来间接估计：将液滴稀释至大得多的其中液滴的体积贡献微不足道的已知体积，并且从浓度与分光光度信号的校准曲线中读取被稀释样品的浓度。这将提供原始液滴中的校准化合物的质量。该方法是间接的，并且需要额外的液滴操纵，因此不可修正为实时体积测量。在实践中，对数个液滴进行计数和收集，并且进行总体的质量的计算，从而提供平均液滴体积，而非每个液滴的确切体积。

捕获、输送和离子化每个液滴中的校准物。本系统和方法提供了使用大气压离子化和质谱仪对从校准产生的离子进行计数来直接确定个体液滴体积。这是通过测量未知体积的液滴中已知浓度的校准物化合物的质量(量)由此直接确定该液滴的体积来进行的。液滴被以液相引入大气压离子源中，以用于使校准物分子离子化，随后用质谱仪进行计数。离子化的优选方法是电喷雾和大气压化学离子化，但是不限于此。图1a呈现了根据本教导的各种实施例的示例性质量分析仪器100。质量分析仪器100是用于从给定样品中分离和检测所关注离子的机电仪器。质量分析仪器100包括计算资源130，以既执行对系统部件的控制又接收和管理由质量分析仪器100生成的数据。在图1a的实施例中，计算资源130被图示为具有单独的模块：用于指导和控制系统部件的控制器135以及用于接收和汇编检测到的所关注离子的数据报告的数据处置器140。根据需求，计算资源130可以包括比所描绘的模块更多或更少的模块，可以被集中化，或者可以根据需要而跨系统部件分布。通常，基于各种系统部件的控制信息还有其它处理信息，由离子检测器125生成的所检测到的离子信号被格式化为一个或多个质谱的形式。随后，可以对数据报告(例如，对质谱)执行使用数据分析器(在图1a中未图示)进行的后续数据分析，以便解释由质量分析仪器100执行的质量分析的结果。

在一些实施例中，质量分析仪器100可以包括如图1a中图示的部件中的一些或全部。出于本申请的目的，尽管计算资源130可以不直接控制样品分离/传递部件105或者不向样品分离/传递部件105提供数据处置，但可以认为质量分析仪器100包括所有图示的部件。

在本申请的上下文中，分离/传递系统105包括传递系统，该传递系统能够将可测量的量的样品(通常是分析物与伴随的溶剂采样流体的组合)传递到设置在分离系统105下游的离子源115，以使所传递的样品离子化。质量分析器120从离子源115接收所生成的离子以进行质量分析。质量分析器120操作以选择性地从接收自离子源115的所生成的离子中分离所关注离子，并且将所关注离子传递到离子检测器125，离子检测器125向数据处置器140生成指示检测到的离子的质谱仪信号。

还将理解，离子源115可以具有本领域中已知的各种配置。本申请主要是涉及通过使液滴形式的样品离子化(诸如电喷雾过程)进行操作的离子化源。

出于本申请的目的，质量分析仪器100的部件可以被认为是作为单个系统操作。常规地，质量分析器120与离子检测器125连同控制器135和数据处置器140的相关部件的组合通常被称为质谱仪，并且样品分离/传递设备可以被认为是单独的部件。然而，将理解的是，尽管部件中的一些(诸如，分离系统105)可以被认为是“单独的”，但质量分析仪器100的所有部件都协同操作以便分析给定的样品。

图1b是图示可以在其上实现本教导的实施例的示例性计算资源130的框图。计算资源130可以包括单个计算设备，或者可以包括与质量分析仪器100的部件操作地通信的多个分布式计算设备。在该示例中，计算资源130包括用于传送信息的总线152或其它通信机构以及与总线152耦合用于处理信息的至少一个处理元件150。如将理解的，至少一个处理元件150可以包括多个处理元件或核，其可以被封装为单个处理器或以分布式布置封装。此外，在一些实施例中，可以提供多个虚拟处理元件150，以提供用于质量分析仪器100的控制或管理操作。

计算资源130还包括耦合到总线152以供至少一个处理元件150使用的易失性存储器150，其可以是如图示的随机存储存储器(ram)或其它动态存储器部件。计算资源130还可以包括耦合到总线152用于存储供至少一个处理元件150使用的信息和指令的静态非易失性存储器160，诸如所图示的只读存储器(rom)或其它静态存储器部件。诸如存储盘或存储存储器之类的存储部件165被提供，并且被图示为耦合到总线152，用于存储供至少一个处理元件150使用的信息和指令。如将理解的，在一些实施例中，存储部件165可以包括诸如联网盘或计算资源130可用的其它存储资源之类的分布式存储部件。

可选地，计算资源130可以经由总线152耦合到用于向计算机用户显示信息的显示器170。诸如键盘之类的可选的用户输入设备175可以耦合到总线152，以用于将信息和命令选择传送给至少一个处理元件150。诸如鼠标、轨迹球或光标方向键之类的可选的图形输入设备180用于将图形用户界面信息和命令选择传送给至少一个处理元件150。如所图示的，计算资源130还可以包括输入/输出(i/o)部件185，诸如串联连接、数字连接、网络连接或使得能够与其它计算部件和质量分析仪器100的各种部件相互通信的其它输入/输出部件。

在各种实施例中，计算资源130可以跨网络连接到一个或多个其它计算机系统，以形成联网系统。该网络可以包括专用网络或诸如互联网之类的公共网络。在联网系统中，一个或多个计算机系统可以存储数据并且将数据供应给其它计算机系统。在云计算场景中，存储和供应数据的一个或多个计算机系统可以被称为服务器或云。例如，一个或多个计算机系统可以包括一个或多个网络服务器。例如，向服务器或云发送数据和从服务器或云接收数据的其它计算机系统可以被称为客户端或云设备。可以通过分布式计算系统的操作来支持质量分析仪器100的各种操作。

计算资源130可以操作以通过控制器135控制质量分析仪器100的部件的操作，并且通过数据处置器140处置由质量分析仪器100的部件生成的数据。在一些实施例中，由计算资源130响应于至少一个处理元件150执行存储器160或165中包含的指令并且对从质量分析仪器100接收的数据执行操作来提供分析结果。至少一个处理元件150执行存储器155、160、165中包含的指令致使质量分析仪器100操作以执行本文描述的方法。替代地，可使用硬连线电路系统取代软件指令或者结合软件指令来实现本教导。因此，本教导的实现方式不限于硬件电路系统与软件的任何特定组合。

根据各种实施例，被配置为由处理元件150执行以执行方法或者致使质量分析仪器100操作以执行方法的指令被存储在处理元件150可访问的非暂态计算机可读介质上。

基于不同的原理，已经开发出将声学分配的液滴接口到质谱仪以用于分析测量目的的设备和方法。例如，us9,664,647b2通过大气压气体将声学生成的液滴输送到质谱仪的入口，并且在运送过程中将其蒸发。美国专利申请us2017/0243729a1是向整体液体样品整体加电压的关于该主题的另一变型。这些方法均未证实具有能够测量所分配液滴的体积的精度或准确性。这些公开均没有提供从用于将样品传递到质谱仪以用于分析测量目的的高速、非接触式方法所期望的在先前部分中描述的所有性能指标。

将液滴输送到质谱仪离子源中的一种优选方法是通过在穿过导管或管的输送流体的流动流中捕获每个液滴。由于捕获和输送设备的层流特性，该层流特性使液滴的扩散散布和合并最小化，每个液滴与其余的保持分离。

图2描绘了图示了五个主要部件的本发明的实施例，每个主要部件具有不同的功能。第一部件是借此可以控制所传递的样品的量的样品分配设备。在该实施例中，通过一阵声波将能量赋予到流体样品的表面由此喷射已知且可控制体积的液滴来实现样品传递。可以通过改变声波脉冲的功率、频率或持续时间来变化进入处理区域的样品的量。通过变化注入量来改变处理区域中样品的稀释。如上所述，料想到其它样品传递设备。

第二部件是其中样品被接收并且样品的浓度被调整为对于电喷雾离子化最佳的捕获探针的样品处理区域。在该实施例中，样品处理部件包括opp，该opp包括用于提供流体以进行样品处理和输送的流体传递泵。可以利用泵变化输送流体到该区域中的流动，由此更改样品的稀释程度和输送的速率。样品处理区域的体积也可以通过更改其几何形状而改变，这将影响样品将遭受的稀释量。这是增加或减小稀释比的有效方式，但是会需要替换物理零件或附加的机械联接，这可能不能容易地适用于实时地快速在线修改稀释比。

第三部件包括离子化部件，该离子化部件提供了用于从经处理的样品产生带电液滴的设施，其包括气体膨胀区域以形成压降从而将样品从处理区域吸引到其中被施加有高电场的带电液滴生成区域。向带电液滴施加高电场将放电的样品液滴转换成样品离子。控制该气流将使得能够变化从处理区域离开的液体流动，由此提供用于更改处理区域中的稀释程度的附加手段。

第四部件是大气压离子化质谱仪，其用于接收样品离子、通过m/z过滤样品离子并测量所产生的离子的量。

该系统由配备有用于解释所生成的信号的数据和算法的计算元件以及与样品分配设备、流体传递泵和加压气体源的控制通信链接支持。在测量信号并且基于所生成的分析结果确定所分配的液滴体积之后，该系统可以操作以调整样品分配设备的一个或多个参数，从而分配已知体积的后续液滴用于由第四部件质谱仪进行分析。

在一些方面中，实施例还可以包括运动部件，该运动部件用于移动包括多个样品孔的样品孔板，以将预期的样品孔定位成与样品处理区域对准。在一些实施例中，将样品孔定位并声学发射到处理室中所需的时间是大约每个样品数十毫秒。各个样品可以被堆叠在处理室和离子产生点之间的转移线中，其中它们在时间上的间隔仅由在管道中溶液中分子的扩散限制，通常在本发明的原型中为大约几百毫秒。这使得几乎能够实时地发射样品、检测其信号、与参考物进行比较以估计抑制以及重新发射一定量来在处理室中提供适当的稀释以针对线性分析物响应在离子发射液滴中提供正确的条件并避免抑制效应。

图3a、图3b和图3c描绘了部件之间的不同几何关系。图3a示出了垂直向上取向的样品处理部件和竖直向下取向的带电液滴产生部件。这使样品能够在重力或其它力的作用下沉积在处理部件中。图3b示出了在相反的垂直方向上取向的相同两个隔室。图3c示出了水平配置的两个隔室。如果样品可以被引入处理区域中并且带电液滴生成部件被取向为使得离子可以通过某种手段到达质谱仪的入口孔口处，则可以使用垂直与水平之间的任何角度。

如果微分配技术自然地通过在与重力相反的向上方向上发射液滴进行操作，则样品处理区域可以被定位成流体向下。利用这种类型的分配器的优选操作模式是使流量平衡，即，捕获储存器的入口流量等于出口流量，因此它不会从储存器中溢出到样品上。它也可以在入口流量略小于出口流量的情况下进行操作。

对于在大致重力方向上向下或以一定角度分配液滴的微液滴分配器，样品处理区域可以面向上。在这种情形下，操作模式可以是流量平衡的，即流入量小于流出量的，或者流入量大于流出量的，从而将溢出物捕获在壕沟(moat)或引流管(drain)中。

可以通过在观察储存器的状况的同时可视地设置流量来手动控制操作模式。还可以通过用诸如机器视觉、光偏转、电导率等之类的多种方法中的任一种监视储存器的状态并且将信息馈送回输送流体传递泵来自动地控制模式。

图4a、图4b、图4c和图4d示出了呈现类似样品处理区域、具有未同轴布置的流体入口和出口管的捕获探针的附加实施例。图4a和图4b示出了具有开口以允许样品进入处理区域中的线性布置或弯曲的单个管或对接的2个管。在一些方面中，处理室可以包括带有孔口的单个管，该孔口暴露流过管的处理流体。图4c示出了彼此平行布置的入口和出口管。图4d示出了共线布置且其间有间隙以限定从而产生样品处理区域的两个管。在一些方面中，可以提供平面的带凹槽的表面，以通过用疏水材料涂覆表面来限制流体。在一些方面中，处理区域可以不由壁界定，并且仅受表面上淤积的液体在2个管之间输送时的表面张力限制。还料想到呈现处理区域的捕获探针的其它实施例，诸如被包围在处理室中的彼此接近度近或远的2个管的使用。以开放的槽的形式的处理室具有供应处理流体的供应管以及从槽排出处理流体的排放管。

液滴捕获/输送设备的优选实施例在这里被称为开放端口探针(opp)，opp涉及两个同心同轴管的布置，内部管是将液滴输送到离子化区域的导管，外部管在样品处理区域处引导并限制从泵传递到内部导管管的入口的输送流体(通常是溶剂)以便捕获样品，并且将所捕获的样品通过内部导管管输送到离子源。内部导管的入口处的样品处理区域被填充有用于捕获沉积在该区域中的液滴的流体。该液滴捕获储存器的直径优选地在0.5至5mm范围内，但是可以更大或更小。该储存器的体积优选地在0.2至2.0ul范围内，但是可以更大或更小。由泵通过外部供应导管向样品处理区域供应输送流体，并且以大致相同的速率通过内部输送导管排空样品处理区域。这种稳态条件导致位于液滴捕获储存器中的永久涡旋，该永久涡旋迅速混合和扫开进入的液滴。对于待净化捕获区域的整个体积，该液滴捕获储存器在样品处理区域中的冲洗速率优选地为<1秒。取决于输送流体通过样品处理区域的体积流速，在低纳升范围内分配到该储存器中的液滴将被以100-1000倍的因数瞬时稀释。该大稀释和高效快速混合对于归一化针对各种样品溶剂和基质的质谱仪信号以及对于归一化针对一系列液滴体积的质谱仪信号是重要因数，这两个归一化是使得能够产生以下将描述的标准曲线的重要要求。

在内部输送导管的远端处是离子源内部的离子化区域。雾化器管在该区域中围绕液滴转移导管，高压气体(雾化气体)通过该雾化器管被传递到围绕输送导管的出口的喷嘴孔口限制件。当高压气体(通常是空气或氮气)离开喷嘴时，它加速以接近mach1的速度。气体的剪切力使液体破碎成液滴的羽流。出口处的膨胀气体还在转移导管的端部产生局部压降，从而将流体从样品处理区域拉动通过输送导管。流体的速度可以在1–1000ul/分钟之间，但优选地在50-500ul/分钟之间。该流量优选地被设置到由气体的压力、转移导管的内径和流体的粘度确定的恒定速率。为了平衡来自样品处理区域的入口和出口流体流量，传递输送流体的泵被调整以匹配在输送导管的远端处的出口处因流体的抽吸而产生的流量。

图5和图6图示了将样品液滴传递到质谱仪以进行分析的替代实施例。图5图示了将液滴分配到传送器上的微液滴分配器，该传送器将所分配的液滴输送到离子化源以进行离子化。图6图示了具有针孔孔口样品处理区域(“线性opp”)的线性捕获探针，其在孔口样品处理区域处接收所分配的微液滴，以便捕获并输送到离子化源。

图7是耦合到样品孔的声学分配器的简化截面图，该声学分配器正将微液滴分配到同轴捕获探针(opp)的样品处理区域中。图8是采用所测量的力来迫使液体样品通过小针孔孔口的液滴分配器的替代实施例。

使用校准化合物信号基于质量进行体积测量。用捕获、输送和离子化液滴中的溶质的可靠手段，可以基于由质谱仪在每个液滴中测量的校准物的质量(量)来确定液滴体积。这是通过准备使液滴中校准物的质量(量)与来自质谱仪的信号相关的校准曲线来进行的。图9图示了针对多个所捕获和分析的包括校准物的样品测量的质量信号(强度)。每次测量的峰面积相对于每个样品中包含的校准物的量而变化。例如，通过将信号峰面积对照样品的已知校准物浓度作图，可以将来自图9的质量测量数据转换成校准曲线(图10)。

用于产生标准曲线的液滴的体积必须是已知的，并且在待测量液滴的尺寸的大致范围内。例如，如果待测量液滴体积在1-100nl范围内，则校准曲线液滴的体积有5nl就足够了。质谱仪测量液滴中校准物的质量，而不管其体积和整体溶剂成分如何。opp捕获储存器中的大稀释因数大大有助于该测量，从而确保由于液滴体积和成分导致的信号的略微变化被归一化。在opp液滴捕获储存器中，消除了由于整体样品成分导致的诸如离子化效率的抑制或增强之类的现象。

可以以多种方式传递和确定用于构造校准曲线的液滴的体积。例如，可以在分析天平上对低nl体积范围(1-10ug)内的声学分配的液滴进行称重，以确定其体积。这也可以使用常规光谱法来进行。其它类型的预校准的微分配器也可以被用于该目的，诸如压电或压力驱动设备。一旦构造了单个校准曲线，就可以使用该单个曲线来校准用于具有不同粘度的各种样品成分以及用于一系列不同液滴分配体积的声学分配参数。被分配用于分析测量的每个样品的液滴体积也可以被检查，只要样品包含校准化合物即可。

校准曲线将是特定于特定质谱仪的，因为质谱仪可以对于单个浓度的校准化合物具有不同的信号水平。由于离子光学器件累积了来自样品的污染，因此在质谱仪中检测到的信号也可以随时间而变化。取决于样品负载，在一天的时段内可以发生信号的漂移。这将不会影响校准后的声学参数使用针对特定样品成分开发的参数传递准确且精确的体积的能力，但是由于校准曲线将改变，因此将对实时测量所分配的每个样品的体积有影响。实时体积测量的目的是，如果样品粘度从样品到样品以不可预测的方式改变，则所分配的体积将在单组声学分配参数下变化。在最坏的情况下，一些样品在那些声学参数的情况下甚至将不会分配。因为无信号状况，这将被检测并注意到，但是此时并不能做什么来校正它。

使用校准化合物与参考化合物之比-主标准曲线基于质量进行体积测量。主标准曲线的构造是优选实施例，因为它是针对质谱仪的信号漂移为了使用不同质谱仪进行的校正，并且使得能够进行实时体积测量(此后被称为即时体积测量)。实时测量体积不仅校正每次分配液滴时的轻微误差，而且还使得能够进行即时校准。如果样品因为其流体性质超出校准参数范围而无法分配，则可以快速进行重新校准，以建立正确条件来发射具有正确体积的液滴。

使用校准化合物与参考化合物之比准备的标准曲线被称为主标准曲线。它是以与使用待分配样品中已知浓度的校准化合物的曲线类似的方式准备的。如上所述，校准化合物的准确体积必须大致在将调整分配参数以实现的最终目标体积的大范围内被分配。不同之处在于将已知浓度的参考化合物添加到捕获探针的输送流体中。参考化合物可以被添加到供应捕获探针的储存器中的输送流体，或者被作为供应到样品处理区域的输送流体的供应的补充而注入。待建立的关系是校准化合物信号除以参考化合物信号之比[c/r]与所分配的校准化合物的质量(参见图11)。理想的情形是校准化合物和参考化合物是彼此的稳定同位素变体。这校正了由于其化学性质差异而可能引入的所有变异性(参见图12)。

主标准曲线被如此表示，因为它只需要被准备一次。当用校准化合物和参考化合物的稳定同位素变体进行构造时，它适用于在质谱仪的整个操作寿命期间的性能降低的不同阶段处的质谱仪以及适用于不同类型的所有质谱仪。该单个主标准曲线适用于所有溶剂组合和不同样品成分以及在进行分析测量时液滴体积的变化。这样做的一个原因是，对于采用捕获探针的实施例，由于之前提到的捕获探针(例如，opp)的大稀释体积而导致的离子化过程的归一化效果。另一个原因是来自校准物和参考物的信号之比被用来测量体积、同位素变体或其它。

由于不必逐个样品地重新构造主标准曲线，因此它适用于允许在计算样品浓度时考虑样品分配体积的偏离的即时体积测量。可以使用校准化合物和参考化合物之比来非常快地(通常为数十毫秒)从主标准曲线确定体积。它还使得能够进行即时校准。当遇到未知成分的样品时，可以快速测量使用现有的、次最佳的校准文件分配的体积，而无需诉诸于新校准文件的产生。如果所分配的体积在声学参数的目标范围之外，则通常调整功率和持续时间并且重新测量体积。对个体液滴进行重复的体积测量和参数调整，直到实现目标体积。如果因为声学参数对于该样品是不正确的而根本没有分配液滴，则将检测到缺少信号并且此时有可能进行快速的重新校准。该过程可以非常快，每秒进行多次迭代测量和调整并且是自动的。这花费的时间将取决于需要多少次参数调整迭代才实现目标体积。在大多数情况下，这将花费不到1秒。所需样品非常少。容易实现与以非常紧间隔的非常特定深度相关联的校准文件。

当需要对样品进行分析测量时，其中样品的流体性质可以逐情况而改变的情形是常见的。例如，来自经历不同生理状态的患者的血液将具有不同的血细胞比容以及大不相同的样品粘度。来自不同疾病状态的人尿表现出相似的变异性，并且来自不同物种的尿将代表粘度尺度上的极值。用于生产有价值的制药和工业化学品的发酵培养基和生物反应器将在培养基生命周期的不同时段具有对流体性质有深远影响的不同浓度的溶质(诸如多糖)。

出于已经描述的原因，可以从单种溶剂准备主标准曲线。理想的微分配溶剂可以被用作标准物，以提高这种方法的实用性和实践性。一种理想的溶剂是二甲基亚砜(dmso)，它具有足够高的粘度和表面张力，以产生在微微升至纳升范围内的高度稳定的液滴。它具有高蒸气压，从而使由于蒸发导致的误差最小化。稳定且可重现的测试解决方案和方案对于仪器和方法的验证和确认是必不可少的。

该单个主标准曲线对于样品类型、样品分配体积、质谱仪和质谱仪状况不可知的原因是双重的。第一个原因是因为由于这些情形下的变化而导致的离子化效率和质谱仪响应的变化是通过使用校准化合物和参考化合物的响应比来考虑的。当状况改变时，这二者等同地受到影响。当校准化合物和参考化合物是彼此的稳定同位素变体时，所有化学效应都被消除，因为它们仅在其核性质上不同，而在电子/化学性质上没有不同。在实践中，因为消耗量较大，所以最丰富的同位素将被用作输送流体中的参考化合物。最不丰富的同位素将是样品中的校准物，因为将使用非常少量的这种较昂贵的试剂。

第二个原因是因为捕获探针和质谱仪接口的性质。例如，声学分配的样品在低纳升范围内。诸如opp之类的捕获探针在捕获输送流体中的100至500倍时瞬时地混合它们。出于所有实际目的，无论样品的成分或典型范围内的液滴体积如何，正被传递到电喷雾离子化区域的是输送流体。

图13图示了通过引入具有相同浓度(例如，5um)的样品并变化总分配体积(1-100nl)而推导出的替代标准曲线实施例。可以例如通过如上所述的高频多次分配来实现较高的分配体积。

本申请的实施例可以有用地用于诸如发酵分析和动力学分析之类的ade-opp的新型应用中。下面，描述了对动力学分析的说明。

本文描述的装置和方法发明是针对包括数个部件的系统，这些部件被设计为执行原位动力学测量，包括当样品溶液达到静态平衡而不再随时间而改变时进行的测量。

理解溶液的化学性质以及它们如何随时间改变是化学、生物化学和临床化学的领域的基本对象。已经开发出用于当溶液的化学成分以受控制方式随时间改变时以及当溶液的化学成分保持静态并处于最终平衡时监视溶液的化学成分的方法和装置。参考由本发明实现的方法“原位动力学”。

在一个实施例中，可以通过例如以规则采样间隔从至少一个反应孔分配分立的纳升体积液滴来在时间间隔内监视化学或生化反应。在该实施例中，在反应孔内发生反应，并且随着反应的继续，对孔内的产物采样。这与准备各自代表不同测量时间点的数个反应孔并且在适当的时间淬灭每个孔中的反应之后分析这一系列孔的常规方法形成对照。这种方法使待准备的样品孔数量成倍增加，由此增加了昂贵试剂和消耗品成本，限制了时间点测量的频率和持续时间，并且由于淬灭过程而增加了实验的人为因素。在图14中图示了这一不同之处。在图15中示出了来自原位动力学研究的数据，图15图示了来自人肝微粒体分析的动力学数据，图示了由于代谢消耗而导致的两种药物的消失。在有和没有nadph的情况下进行反应，nadph是细胞色素p-450酶的必要辅助因子。

为了充分实现这种新的原位动力学方法，必须满足几个条件。我们已经开发出的装置和方法满足所有这些标准。它涉及使用质谱仪作为检测器，该质谱仪具有之前在本文档的校准部分中描述的被称为开放端口探针(opp)的质谱仪的样品入口接口。使用之前也在本文档的校准部分中描述的声学声波将样品分配到开放端口探针中。开放端口探针捕获从孔或试管分配的液滴，并且可以将内部标准物添加到opp的输送流体中，以对信号进行归一化，这也在本文档的校准部分中被描述。

必须满足的条件及其实现方式如下。

1.相对于整体反应，所分配体积必须小，以免由于体积/扩散速率更改现象而耗尽反应或更改动力学。用这种方法，所分配的体积在低nl范围内，通常为1-20nl，而反应体积在μl范围内，通常在数十至数百μl。

如本文档的校准部分中描述的，建立物理参数来用声波在该体积范围内进行分配。

2.对于每个连续时间测量，分配应该是非接触式的，以免由于样品的交叉污染而受先前测量的影响。该装置及其使得能够实现的方法以非接触的方式进行分配，从而导致零样品残留情形。

用声学能量发射液滴避免了使用诸如针或移液管之类的物理表面来收回样品。表面始终是有问题的残留来源。液滴在开放端口探针的入口处的流体涡旋中被捕获，并且立即被扫开。在图5中示出了该冲洗涡旋。所选择的流体是在其中样品高度易溶混并且不会从溶液中沉淀出来的流体。样品从不接触固体表面。

3.样品分配必须快速并且能够在接近反应开始的任何时间或此后的任何时间间隔被分配。该装置及其使得能够实现的方法可以以大于1hz的速率分配分立的样品，通常在0.1-10hz的范围内，并且能够使用0.01至100hz的宽范围。图16是来自正以约0.6hz运行的样品的数据。

声学声波可以以高达1khz的频率分配液滴，但是将这些液滴作为分立的实体转移到质谱仪是有问题的。当它们被发射到开放端口探针中时，它们被堆叠在将它们在输送流体中输送到质谱仪的转移线中。扩散现象限制了这些液滴可以在空间和时间上可以被堆叠得有多紧密。在它们开始合并之前，流限制为每秒大致3。

4.其中在反应的持续时间内的测量不间断的连续采样是所需的选项。在信息可能丢失的情形下，即使在以高频率采样时，样品的连续不间断流也必须是可能的。本发明在短时间段内或者只要孔中留有样品就将分配样品的连续流。

为了实现不间断的连续信号，液滴以它们在涡旋中合并的速率被发射到开放端口探针中。这是在大致5hz或更高的频率处发生的。稳态信号是如连续监测反应动力学所需的那样短或长的时间段的结果。参见图16，图16图示了连续质谱仪信号，该信号是由于以30hz分配液滴从而造成液滴在捕获探针的输送导管中合并而产生的。这种技术对于诸如质谱仪透镜的调节、质量分析器或采用受益于具有较长时段的数据获取方法之类的许多其它目的也是有用的。这样的示例是为了增加信噪比进行的信号求平均以及受益于用较长积分时间实现的更好离子统计的准确质量测量。

当可以将样品引入的时间增加至任何期望值时，将使得能够获取具有针对样品中的每种化合物的差分离子迁移率补偿电压值的数据。诸如swath之类的数据获取方法获得样品中存在的每种前驱物离子的产物离子谱。通过本发明，得到关于样品的精确化学成分的巨量信息，而对样品的所有成分能够实现将样品引入时间调整成足够长以实现良好的信噪比。将差分离子迁移率扫描与swath结合将通过结合正交分离技术提供对样品的深度化学覆盖。但是，只有在能够自动调整和控制采样时间时，才可以实现这些强大的技术。用这种声学注入方法，可以通过在信号求平均逐渐改善s/n时即时测量s/n、在实现目标值时停止声学分配来针对每个个体样品自动地调整采样时间。

5.该反应应该以其原始形式被分配，而测量工具没有要求以任何方式提纯或修改成分。例如，在不进行预提纯的情况下对生物流体、酶、辅助因子、缓冲物和表面活性剂进行直接分析对于保持该培养基中的原始反应的完整性是必要的。同样，要避免修改生理缓冲物状况以使它们与测量工具兼容的要求，因为可能结果不再代表生命系统。

由于离子化抑制，当前没有如下这样做：在样品被引入质谱仪中之前，在没有某种程度的样品提纯的情况下对复杂生物样品进行直接分析。离子化抑制是离子化事件中涉及的物理-化学过程的结果。当存在极高浓度的内源材料时，因为包含分析物的带电液滴的表面被不可渗透的层屏蔽从而阻止了分析物从液滴的的场发射，所以通过电喷雾进行的离子化被抑制。类似地，当存在极高浓度的内源材料时，被称为试剂离子耗尽的现象抑制了通过大气压化学离子化进行的离子化。具有高气相酸性和碱性的内源材料将消耗试剂离子群体中存在的所有电荷，而不会给与整体溶液成分相比以痕量存在的分析物留下任何电荷。

图17中的数据是证实了当血浆被直接注入捕获探针时没有出现信号抑制的示例。如所图示的，尽管通常血浆基质将造成离子抑制和后续的信号损失，但分析物信号是相似的。图18中的数据是证实了当将包含tween20表面活性剂的高通量筛选分析直接注入质谱仪中时没有出现信号抑制的示例。如所图示的，对于每个组，没有清洁剂的左侧柱与具有清洁剂(tween20)的右侧柱具有相近的峰面积。

该装置及其使得能够实现的方法不再需要在通过以下手段注入质谱仪中之前提纯样品。图19示出了分配到开放端口探针的涡旋入口中的2.5nl液滴。涡旋体积是大约1ul，这导致瞬间400倍的稀释，然后被立即转移到离子化区域。内源材料的稀释反击了它们的离子化抑制效应。

6.必须避免出于使得能够实现或改善测量的目的添加与反应的要求无关的化合物，以免影响结果。一个示例是向反应添加内部参考标准物以提高测量准确性和精度。这冒着干扰所关注的酶或催化剂的活性的风险。

第二个示例是使用与反应成分有联系的光吸收或发射标记来提供监视反应进程的次级间接手段。这也冒着干扰结果的风险，因为它们是间接测量，并且经常发现标记更改了诸如酶、转运体或受体之类的生物系统的关键成分的活性。

本发明在不使用标记的情况下通过质谱仪直接测量所关注成分的量。图20中的数据和对应的校准曲线证实了这种方法的固有定量本质。注入捕获探针样品处理区域中的样品的不同量成比例地造成不同信号，从信号可以构造校准曲线。

该选项可用于在不向样品添加内部标准物(其中内部标准物可能干扰结果)的情况下使用内部标准物将来自样品的信号归一化。内部标准物被添加到opp接口的输送流体中。初始地，测量并记录内部标准物与目标分析物之间的响应比。然后，使用这种关系来确定其中分析物的浓度未知的样品中的分析物的量。通过预先建立质谱信号与分析物浓度的校准曲线并且然后从该曲线图中读取未知样品的浓度，可以在输送流体中没有内部标准物的情况下确定分析物的量。

该装置及其使得能够实现的方法使得能够不需要修改生物学或化学中通常遇到的酶促或催化反应。例如，针对已知的生物靶标、酶、受体、基于活细胞或其它的高通量筛选分析是对血浆或其它生物流体的直接分析的示例。测量不需要向反应添加内部标准物，并且测量是直接对反应物和/或产物进行的，而没有依赖于诸如使用例如荧光团时遇到的次级间接检测。

7.反应条件必须保持一致，这意味着维持对温度的关键参数的控制。通常使用的是温度控制，特别是在仅进行仔细的动力学测量时。每个样品孔必须被维持在与下一个样品孔精确相同的温度处，以生成有意义的数据。

已经采用了将热均匀地传递到所有孔(例如，微量滴定板)的方法，该方法对板的整个底部或顶部进行加热，以均匀地传递热。在孔声学分配到opp的情况下，板的顶部和底部区域二者被底部的声学换能器和顶部的opp占据。这使得解决该问题的经典方法并不合适。

为了有效地将来自压电换能器的声波耦合到孔板的底部，使用比如水的液体介质来避免气隙。声学分配器的当前实施例都用少量的耦合液体淹没换能器的透镜与每个个体孔的底部之间的区域。用于解决该问题的该装置的要素是用耦合流体淹没孔板的整个底部并且控制流体的温度。以这种方式，可以甚至一致地维持均匀的温度控制，包括加热和冷却二者。在图11中示出了本发明的该要素。

用声学分配精确且准确地控制样品温度的能力具有超越动力学测量的益处。如在本临时专利申请的校准部分中描述的，声学分配参数特定于具有特定粘度值的溶液。当粘度改变时，分配参数也改变。保持温度恒定从而稳定温度使粘度稳定，并且因此有助于防止分配参数漂移到校准之外。

另外，加热样品使它们的粘度降低。可以被声学分配的最大粘度溶液大致为100cp。有效升高温度的能力将通过降低其粘度在受热时最大的溶液的粘度来增加可以分配的溶液类型的范围。

8.对每个孔进行的测量的类型必须保持灵活，不受约束，并且能够从样品到样品快速切换。这是因为原位动力学使得能够在需要监视不同的反应物、产物和辅助因子的同时分析大量不同的反应。在每个孔的分配期间对多种不同化合物进行分析的能力必须是可用的。例如，因为在相邻孔中进行不同的分析，所以改变针对96、384、1536或3456孔微量滴定板的每个孔监视的化合物。

这种方法通过将由质谱仪正在监视的质量与孔位置同步来满足该要求。如果明智地将样品孔排序以在相邻的孔中监视不同的质量通道，则该能力还通过允许在样品孔之间的某种相邻峰重叠来增加分析速度。图12是正出现峰重叠但因为正在监视不同质量所以没有来自相邻样品的信号干扰的示例。该思路与针对色谱分离设计的“计划mrm”技术相似。在本发明中，ms数据获取方法不与色谱保留时间同步，而是与瓶管位置同步。使用这种方法，可以在单个数据文件中获取来自多个样品的数据，通常是微量滴定板中的所有样品。另外，需要更快的切换速度方法(亚秒级分辨率)。