用于检测11-脱氢-血栓烷B2的方法和试剂盒与流程

用于检测11-脱氢-血栓烷b2的方法和试剂盒
技术领域
[0001]
本申请一般涉及用于确定生物样品中某些组合物的水平的诊断装置领域。具体地，相关领域包括用于定量评估来自人类受试者的生物流体中代谢物水平的方法、组合物和试剂盒。


背景技术：

[0002]
阿司匹林(也称为乙酰水杨酸或asa)是一种研究广泛且众所周知用于治疗疼痛、发烧和炎性相关病症的药物。阿司匹林还用于预防性地预防心脏病、血液凝块和甚至某些类型的癌症。asa是一种非甾体类抗炎性药(nsaid)，尽管它的功能与其他nsaids类似，但已证明阿司匹林可抑制血小板的正常功能。阿司匹林还被证明在降低与缺血、心肌梗塞和血栓形成疾病有关的风险方面非常有效，这很可能是由于阿司匹林对血小板的已知作用。
[0003]
阿司匹林长达一个世纪的使用已经产生了令人难以置信的数据量，其显示阿司匹林是世界上对人类使用最安全的药物之一。asa的作用机理已经发现几十年，其显示阿司匹林抑制了前列腺素和血栓烷的产生(vane,jr,"inhibition of prostaglandin synthesis as a mechanism of action for aspirin-like drugs"nat.new biol.,231(25):232
–
5(1971))。阿司匹林抑制两种具有激素样作用的生理活性脂质化合物的方式是由于其不可逆地灭活前列腺素和血栓烷合成所需的环加氧酶(cox)(awtry et al.,“aspirin”circulation,101(10):1206
–
18(2000))。具体来说，asa用作乙酰化剂，其中乙酰基基团共价附接到cox酶活性位点的丝氨酸残基上，这就是阿司匹林与其他可逆抑制剂诸如布洛芬等nsaids的区别所在。该反应是形成诸如血栓烷a2(txa2)和相关代谢物(包括11-脱氢血栓烷b2(11dhtxb2))等各种前列腺素类的前体。由于阿司匹林抑制txa2合成，其是最有效的抗血栓药物治疗方案之一，并且已被显示将广泛的患者中相关心血管事件的风险降低25％以上(att collaboration,“collaborative meta-analysis of randomised trials of antiplatelet therapy for prevention of death,myocardial infarction,and stroke in high risk patients”bmj,324(7329):71
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86(2002))。
[0004]
阿司匹林起到至少两种不同类型的cox酶——称为cox-1和cox-2——的作用。尽管阿司匹林不可逆地抑制cox-1，但已经显示它可以修饰cox-2的酶促活性，这表明针对不同的cox酶的作用机制略有不同。此外，最近的研究显示，阿司匹林对某些人的血小板影响很小，这表明在某些个体中存在对阿司匹林的抗药性或不敏感性的类型(krasopouloset al.,"aspirin"resistance"and risk of cardiovascular morbidity:systematic review and meta-analysis"bmj,336(7637):195
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8(2008)；pignatelli et al.,"multiple anti-atherosclerotic treatments impair aspirin compliance:effects on aspirin resistance"j.thromb.haemost.,6(10):1832
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4(2008))。
[0005]
在某些情况下，包括创伤和/或血栓形成事件，个体对阿司匹林耐药的可能性至关重要。看护者及时了解个体的阿司匹林抗性或不敏感性的水平可能意味着生与死之间的差异，并且至少可以根据所鉴定的抗性的相关水平决定所使用的治疗类型。
[0006]
当前，存在基于血液的测定以便通过评估体外血小板聚集来提供可能的抗性的测量。但是，这些结果并非特定于阿司匹林敏感性，且不能在床旁及时提供结果。类似地，定量免疫分析可用于尿液中代谢物的检测，需要使用针对11dhtxb2的多克隆抗体。该测定在可以从受试者的尿液中确定阿司匹林的有效性是有帮助的，但是多克隆抗体不能提供高度可重复的或特异性的结果。而且，要花费数小时才能获得结果，因此在涉及创伤或血栓形成相关事件的许多治疗情况下几乎无用。
[0007]
geske等人在美国专利号8,105,790中详细说明了使用对某些txa2代谢物具有特异性的单克隆抗体检测那些代谢物的方法和试剂盒。该公开内容还提供了用于从杂交瘤细胞产生单克隆抗体并且在持续3-5小时的测定中使用此类抗体同时针对对照的标准小分子代谢物标准化的方法。然而，对照不是以与针对代谢物的抗体相同的测定形式运行的，并且没有公开关于如何测量标准代谢物的教导。此外，必须单独评估所使用的标准代谢物(肌酸酐)，从而依赖于标准化抗体结果的单独的测定。另外，在依赖于对个体中阿司匹林抗性问题的更快速回答的环境中，不能使用3-5小时的结果的时间。
[0008]
ens在美国专利号6,994,983也描述了用于确定某些代谢物的某些试剂盒，从而优化阿司匹林的剂量。然而，该公开内容主要集中在比色测定法上，以确定抗体-代谢物复合物的形成，并且没有提及如何使用标准代谢物进行测试，尤其在床旁。
[0009]
在本领域中仍然需要定量且可靠地且快速地评估特定患者对阿司匹林的抗性，以指导保健专业人员在床旁做出治疗决策。


技术实现要素：

[0010]
本发明提供了用于定量确定微升至毫升量的给定样品中11dhtxb2的指定量的方法、组合物和试剂盒。优选地，样品是生物流体。更优选地，生物流体是来自人类受试者的1ml或更少量的尿液。在一个优选的实施方式中，本文描述的方法可以以可以以高通量、自动化形式运行的合并测定的形式，诸如酶联免疫吸附测定(elisa)。在可选实施方式中，可以将elisa修改成化学发光测定，以增加敏感度和线性范围并减少反应时间。在可选实施方式中，本发明的方法描述了可以在床旁施用的测定，诸如定量侧向流测定。本发明的方法的每个可选实施方式提供了独立测试方法的手段，以确定人类受试者中阿斯匹林的有效性。
[0011]
在一方面，本发明描述了方法和试剂盒，其中以相同的测定形式对生物样品中11dhtxb2水平的确定与用于尿液量的内部对照分析物一起进行。
[0012]
在另一方面，本发明提供了包括测定形式的试剂盒，以使用来自相同样品的包括肌酸酐水平的测定内对照来测试来自人类受试者的微升至毫升尿液量，以便鉴定指定水平的11dhtxb2。
[0013]
可选地，本发明提供了通过选自酶联免疫吸附测定和侧向流测定的测定测试至少一种生物样品中txa2代谢物的存在和指定量的方法。优选地，测试方法的特异性导致某些txa2代谢物的特异性结合，而与其他txa2代谢物不反应。
[0014]
通过阅读以下对本发明的详细描述，这些特征以及各种可选实施方式将变得显而易见。
附图说明
[0015]
本发明的新颖性特征在本文中阐述，其以本发明权利要求的形式体现。通过参考以下对本发明的详细描述，阐述本发明的示例性实施方式和优选特征以及附图，可以最好地理解本发明的特征和优点，其中：
[0016]
图1显示了以elisa形式建立标准曲线以定量11dhtxb2。
[0017]
图2显示了检测一种特定代谢物(11dhtxb2)优于另一种化学相似代谢物(txb2)的特异性。
[0018]
图3显示了本发明的侧向流测定实施方式的一个实例，其中将临床样品与相关示踪物混合并装载在膜条的一端，其中样品以单向方式在涂布有捕获抗体的区域上移动。
[0019]
图4显示了测量11dhtxb2的本发明的化学发光免疫测定。该测定检测11dhtxb2示踪物活性，并被游离的11dhtxb2定量抑制。
[0020]
图5描绘了与本发明化学发光免疫测定有关的时间段的减少。可以在70分钟和20分钟内完成测量11dhtxb2的免疫测定，其中在两个时间段显示了得到的相当的数据。
[0021]
图6显示了测量肌酸酐的本发明的化学发光测定。它涵盖了0.1-100mm肌酸酐的线性范围，并且需要20分钟来完成。
[0022]
图7显示通过用化学发光测定监测尿液样品中的标准化11dhtxb2(pg/mg肌酸酐)所测量的阿司匹林有效性。第1天/第2天样品未经处理，而第3天/第4天样品通过阿司匹林处理。
具体实施方式
[0023]
本文描述了用于定量确定人类受试者提供的生物样品中某些txa2代谢物水平的方法、组合物和试剂盒。优选地，在生物样品中待测量的某些txa2代谢物是11dhtxb2。更优选地，生物样品是尿液。
[0024]
在一些实施方式中，本发明的方法还包括至少一种标准化元素，其以与某些txa2代谢物的定量测定相同的测试形式存在。优选地，本发明的测定方法和试剂盒通过将txa2代谢物浓度除以相同测定形式中的肌酸酐浓度来提供尿液稀释的标准化元素。
[0025]
本发明的方法和试剂盒包括elisa形式，用于在2小时或更短的时间内测试来自人类受试者的尿液样品中的特定txa2代谢物水平。可选地，elisa形式适应化学发光底物或示踪物，其增加了测定的敏感度和线性范围，并缩短了反应时间。任选地，本发明提供了一种可选的测试实施方式，其包括在床旁进行的侧向流测定，并且可以在15分钟或更短的时间内完成。
[0026]
优选地，本发明的elisa形式包括对11dhtxb2具有亲和力和高特异性结合特性的单克隆抗体。本文描述的单克隆抗体可以通过用抗原免疫选自人、小鼠、大鼠、马、兔、山羊、绵羊、鸡、骆驼或其他合适动物的动物来选择性生产，所使用抗原具有与txa2代谢物类似或共用的表位。优选地，txa2代谢物是11dhtxb2。
[0027]
下列实施例旨在说明本发明，而不以任何方式进行限制。
[0028]
实施例
[0029]
i.检测11dhtxb2的elisa竞争测定
[0030]
如图1中所示，本发明提供了使用elisa形式的特定代谢物水平的定量测量。由多
孔板或多管中涂覆的山羊抗小鼠抗体构建elisa平台。
[0031]
在开始测定后，涂覆的山羊抗小鼠抗体捕获小鼠抗-11dhtxb2抗体，和抗-11dhtxb2抗体捕获11dhtxb2示踪物(缀合有碱性磷酸酶的11dhtxb2)，从而产生读出(readout)活性。
[0032]
游离11dhtxb2的添加以剂量依赖性方式抑制了该活性(图1)。利用游离的11dhtxb2建立标准曲线，因此该测定可作为结合活性的定量指标实施。游离的11dhtxb2可以任选地是待通过测定以定量方式测量的临床样品。
[0033]
ii.基于elisa的测定对11dhtxb2的结合特异性
[0034]
当检测期望的目标靶分子(即11dhtxb2)时，本发明的基于elisa的测定提供了很好的特异性。
[0035]
为了测试该结合的特异性，检查血栓烷b2(txb2)以评估elisa形式中的结合活性(图2)。txb2是在化学上类似于11dhtxb2但与其不同的化合物。
[0036]
如图2中所示，txb2没有抑制11dhtxb2示踪物的活性，确认了本发明的基于elisa的实施方式的高度特异性测试形式。
[0037]
iii.检测肌酸酐的elisa竞争测定
[0038]
为了标准化以elisa形式确定的活性值，建立了对照以比较不同样品之间的值。因此，类似上述实施例所述，创建肌酸酐elisa形式。
[0039]
不仅同时而且在同一测定中对与11dhtxb2 elisa相同的样品进行肌酸酐elisa。以该方式，本发明限制了随时间可能使不同测定之间的结果产生偏差的任何变量。虽然肌酸酐elisa不必须与11dhtxb2 elisa在相同的孔内进行，但是对照将在相同的多孔板上进行，导致测试样品之间的提高的可靠性和减少时间，直到两个结果整合在一起。
[0040]
肌酸酐elisa利用涂布在多孔聚苯乙烯板上的山羊抗小鼠抗体。一旦测定已经开始，孔涂布的山羊抗小鼠抗体将捕获小鼠抗肌酸酐抗体，和抗肌酸酐抗体捕获肌酸酐示踪物。优选地，-肌酸酐示踪物包括缀合至碱性磷酸酶或类似酶的抗肌酸酐抗体，其能够实现读出活性并测量结合参数。预期添加游离肌酸酐以剂量依赖方式抑制该活性，因此提供高度可再现的标准曲线分析的结果。
[0041]
本发明进一步提供了涉及肌酸酐elisa形式的专门的试剂，其包括抗-肌酸酐抗体和至少一种肌酸酐示踪物的变体。这些试剂在elisa形式中使用并克服克服了现有技术中关于肌酸酐分子周围的抗体和示踪物发展的已知问题。
[0042]
可选地，代替使用抗-肌酸酐抗体，合成抗体被用于在检测免疫样测定形式中检测肌酸酐。合成抗体可以是重组抗体、抗体片段、适配体、和非免疫球蛋白支架。
[0043]
可选地，代替使用抗-肌酸酐抗体或合成抗体，对肌酸酐具有特异性的酶结合该代谢物，将肌酸酐转化为可以然后在免疫测定或酶测定中检测的一种或多种代谢物。示例性酶包括产生n-甲基乙内酰脲和氨的肌酸酐脱亚氨酶，和产生肌酸的肌酸酐酰胺水解酶。
[0044]
iv.检测11dhtxb2和肌酸酐的侧向流测定
[0045]
在可选实施方式中，本发明提供了一种定量侧向流测定，该测定专门设计用于基于微升量的生物流体在几分钟内在同一测定中检测11dhtxb2和肌酸酐。
[0046]
如图3中所示，开发定量侧向流测定，从而在同一测定形式中检测11dhtxb2和肌酸酐水平。该床旁测定形式可以在15分钟或更短时间内完成，其中实时结果能够传送至治疗
医师或临床医生。
[0047]
侧向流测定利用对应elisa形式开发的类似试剂，即，抗-11dhtxb2和抗-肌酸酐抗体。该测定装置包括两种不同的捕获抗体，这些抗体作为条涂布在期望孔径的硝化纤维素膜条上。两种不同的捕获抗体分别被捕获或嵌入在第一捕获条和第二捕获条中。第一捕获条包含抗-11dhtxb2抗体，和第二捕获条包含抗肌酸酐抗体。可选地，第一捕获条包含抗肌酸酐抗体，和第二捕获条包含抗-11dhtxb2抗体。可选地，测定装置包括涂布作为第三条的第三抗体以用作对照。
[0048]
制备包含预定量的两种不同的示踪物的样品，即11dhtxb2示踪物和肌酸酐示踪物，然后将其与来自人类受试者的临床样品混合在一起，来自人类受试者的临床样品包含微升量的生物流体。每个示踪物均包含磁性或有色编码的珠，用于本发明的侧向流测定。在一个实施方式中，制备样品中的示踪物以将11dhtxb2和肌酸酐分子共价连接至不同组的磁珠(如，按大小、重量、颜色(吸光度、反射率、荧光)、磁参数或这些的组合)。样品-示踪物混合物被加载到膜条上，并且一旦开始侧向流测定，样品和与珠结合的示踪物便在膜的单方向向下迁移(图3)。一旦样品和与珠结合的示踪物越过第一捕获条和第二捕获条，将仅示踪物被捕获，其中样品中的游离分子与示踪物竞争，并从而以剂量依赖方式降低被捕获的与珠结合的示踪物的信号。在将膜装载到盒中以插入能够测量必要参数的读取器中后通过性质读取仪器定量测定活性。
[0049]
v.检测11dhtxb2的化学发光测定
[0050]
开发了化学发光免疫测定(clia)以检测11dhtxb2(图4)。该clia具有与elisa相似的基于抗体的免疫测定原理，但其比elisa具有更高的敏感度和更长的检测范围。用涂布在发光板上的山羊抗小鼠抗体建立clia。启动测定后，涂布的山羊抗小鼠抗体捕获小鼠抗11dhtxb2抗体，而抗11dhtxb2抗体捕获11dhtxb2示踪物。游离11dhtxb2的添加以剂量依赖性方式抑制示踪物的活性(图4)。将捕获的示踪物与化学发光底物一起孵育，并在发光阅读器中进行测量。可以将游离11dhtxb2用作参考材料，从而建立标准曲线，从而使该测定能够作为定量测定进行。游离11dhtxb2也可以是针对以定量方式测定中的已知标准物待测量的临床样品。
[0051]
vi.通过clia以快速方式检测11dhtxb2
[0052]
目前为止，用于11dhtxb2的最佳elisa测定需要至少2.5小时孵育时间，而总测定可能平均需要3小时完成，从而提供可靠和有意义的结果。与本领域内已知的elisa方法比较，用于11dhtxb2的本发明的clia具有大大加快的时间范围。在70分钟内进行的clia显示了显著的游离11dhtxb2依赖竞争(图5)。长于70分钟的测定时间不显示进一步的游离11dhtxb2-依赖竞争。70分钟测定时间包括所有必须的孵育时间，其相当于本领域的已知elisa方法中需要的2.5小时孵育时间。
[0053]
clia研究还显示了，20-分钟clia展示了与70分钟类似程度的游离11dhtxb2依赖竞争(图5)。20分钟测定中绝对发光读数低于70分钟(未显示)，但是作为测定的主要参数的抑制程度基本上保持相同。当与2.5-小时elisa方法相比时，用于11dhtxb2的70-分钟和20-分钟测定都代表就测定效率和鉴定相关活性而言的显著提高。
[0054]
众所周知，床旁测定为临床专业人员提供快速和便捷。在临床实践中，床旁测定通常需要10-20分钟的完成时间。本发明的用于11dhtxb2测定的clia提供了一种在20分钟或
至少少于30分钟内检测11dhtxb2的存在的系统。因此，在时间消耗方面，它是床旁测定的良好候选系统。鉴于通过elisa技术的当前最新方法无法成功实现这种缩短的时间范围，因此这一方面确实是新颖的。
[0055]
vii.用于肌酸酐的化学发光测定
[0056]
本文描述的酶促测定能够精确且快速地测量临床样品中的肌酸酐水平。它们利用将肌酸酐转化为h2o2(最为示踪物，其与肌酸酐浓度呈比例)的一系列酶(包括肌酸酐酰胺水解酶、肌酸酰胺水解酶、肌氨酸氧化酶)并最终将通过化学发光底物测量h2o2水平。
[0057]
当今可用的肌酸酐测定主要采取比色法测量。由于与这种比色元素相关的固有限制，其检测范围为约15至20倍。对于通常的临床肌酸酐浓度(1-30mm)，当前的现有技术要求对高浓度肌酸酐样品的稀释步骤。对于低水平的肌酸酐浓度，虽然不需要稀释，但比色测定可能难以检测或检测出合理的变化。
[0058]
本发明的化学发光肌酸酐测定提供了宽的检测范围，其覆盖约0.1-100mm(图6)。这种1000倍的检测范围不仅包括1-30mm的尿液样品中的常规肌酸酐范围，而且还可以轻松覆盖超出该范围的大多数离群值。当患者在抽取样品之前消耗过多的流体时，可能出现诸如0.5-1mm的低水平肌酸酐等离群值。化学发光肌酸酐测定剂量无需对高水平肌酸酐的样品进行进一步稀释，并且同时能够检测低水平肌酸酐(低至0.1mm)。测定时间为20分钟，这使该测定具有在床旁装置中测量肌酸酐的理想系统的资格。
[0059]
viii.11dhtxb2作为阿司匹林作用的指示物的标准化水平
[0060]
化学发光是一种测定平台，在其上可以有效、同时且定量地测量11dhtxb2及其内部对照。本发明开始测试其检查临床样品和监测阿司匹林对11dhtxb2的作用的能力。在这项研究中，连续4天每天一次收集健康志愿者的尿液样品。在第2天收集样品后，每个提供者服用一剂阿司匹林(325mg)，因此第1天和第2天样品为未经处理的阿司匹林，而第3天和第4天样品为用阿司匹林处理后。收集所有样品后，在本发明的化学发光测定中测量11dhtxb2和肌酸酐。
[0061]
结果清楚地表明，阿司匹林可使尿液中标准化的11dhtxb2水平降低70％或更多(图7)。这与阿司匹林的既定作用一致。本发明的结果表明，化学发光测定为尿液样品中的11dhtxb2和肌酸酐提供高效、敏感且有效的测量方法。
[0062]
本说明书中公开的所有特征可以以任何组合进行组合。本说明书中公开的每个特征可以由具有相同、等同或相似目的的可选特征代替。因此，除非另有明确说明，否则所公开的每个特征仅是一系列等同或相似特征的示例。如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式包括复数形式。例如，术语“一种”、“一个”和“该”包括复数引用，除非内容另有明确规定。另外，一系列要素之前的术语“至少”应理解为是指该系列中的每个要素。可以在不存在本文未具体公开的任何一个或多个元素、限定的情况下适当地实践本文中示例性描述的发明。因此，例如，术语“包括”、包含”，“含有”等应被广泛地且不受限制地阅读。另外，本文所采用的术语和表达已被用作描述的术语而非限制，并且不打算使用这样的术语和表达来排除所示出和描述的未来的任何等同形式或其任何部分，应当认识到，在所要求保护的本发明的范围内可以进行各种修改。因此，应当理解，尽管已经通过优选的实施方式和可选特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以对本文公开的发明进行修改和变型，并且可以考虑这样的修改和变型。在本文公开的发明范围内。在此已经广泛地和一般性
地描述了本发明。落入一般公开范围内的每个较窄的种类和亚类分组也构成这些发明的一部分。这包括对每个发明的一般描述，但附带条件或否定限制，可以从属中删除任何主题，无论所切除的材料是否专门存在于其中。另外，在以马库什组来描述本发明的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，由此本发明也以马库什组的任何单个成员或成员的子组来描述。还应理解，以上描述旨在是说明性的而非限制性的。通过阅读以上描述，许多实施方式对于本领域技术人员将是显而易见的。因此，本发明的范围不应参考上述说明来确定，而应参考所附的权利要求书以及与这些权利要求书等同的全部范围来确定。仅通过常规实验，本领域技术人员将认识到或能够确定所描述的本发明的具体实施方式的许多等同形式。这些等同方案旨在由所附权利要求书涵盖。