用于血清学的包含一组不同地标记的细胞的单管制品
1.描述
2.本发明涉及用于血液血清学的包含一组不同地标记的血清学相关血细胞的单管制品(即单个容器)，以及制备本发明单管制品的方法。此外，本发明涉及本发明的单管制品用于血液血清学的用途，并且特别地用于对需要输血的个体、献血者进行血清学表征的方法，或者用于对个体诸如孕妇进行预防性血清学表征的方法。本发明特别适用于自动化和/或高通量血液血清学。
3.在临床环境中，血型血清学，并且特别地血型测定和抗体检测的主要目的是从献血者获得相容的红细胞或凝血细胞制品，用于受血者的输血。为此，常规进行测定，诸如血型分型、抗体筛选和鉴定，以及通过交叉匹配进行(血液)相容性测定。
4.通常，这些测定中的大多数基于凝集原理，例如红细胞凝集物的形成，携带针对存在于红细胞上的血型抗原的抗体。
5.在哺乳动物中，并且特别地人类哺乳动物中，红细胞细胞膜上的特定抗原决定簇表征所述哺乳动物的所谓血型。表达血型抗原的信息通常在基因组水平上遗传地决定。
6.熟知并且普遍使用的血型系统是由karl landsteiner于1900年发现的所谓的a、b、ab和o系统(abo-系统)。这个系统中不同的血型被指定为a、b、ab和o。
7.除了abo系统，多于400种红血细胞血型是已知的，这些中的大多数以不同临床意义被聚簇在血型系统中。针对这些其他血型系统的特异性抗体可以在用对应的血型抗原免疫之后形成，例如在输血或怀孕期间形成，并且可能在输血期间或之后的怀孕期间引起问题。
8.目前，对于输血实践，abo系统是最重要的血型系统。这是因为每一个以特定血型为特征的个体，其血清中都具有针对不存在的一种或更多种血型的抗体。例如，被表征为a血型的个体，其血清中会具有抗b抗体，并且反之亦然。
9.这些抗体是所谓的“天然存在的”抗体，并且通常是强igm型抗体。igm抗体能够引起例如暴露抗体所针对的血型抗原的红细胞的直接(即没有桥接试剂诸如抗igm抗体)复合物形成或凝集。
10.由针对外来红细胞或红血细胞的同种抗体引起的个体(受血者)中的输血反应称为溶血性输血反应。这是因为它们通常伴随着红细胞的强烈加速且通常致命的分解。因此，在进行输血之前通过仔细的血清学检查来预防溶血性输血反应是非常重要的。为此，通常进行几种类型的测试。
11.通常，将献血者和受血者二者针对abo血型系统和红细胞膜d抗原(rhesus d antigen)进行分型。对于献血者和受血者二者，它们必须相同或相容。例如，存在于红细胞上的abo血型可以通过对存在于血清中的抗体进行所谓的反向abo分型测试来确认。
12.接下来，对受血者的血清进行筛选，以确认针对abo系统以外的所有其他血型的红血细胞抗体的存在。如果发现抗体，必须对其进行鉴定，以便选择对对应的血型抗原为阴性的献血者血液。
13.最后，可以进行献血者红血细胞与受血者血清之间的交叉匹配，以查明献血者与
受血者是否确实相容。
14.通常，血型抗体是igg或igm类型的免疫球蛋白。除其他外，抗原抗体反应或关联依赖于离子结合、氢桥和疏水效应(水的置换)。抗体的结合口袋与表位之间的结合强度称为“亲和力”。
15.能够在所有条件下凝集红血细胞的抗体称为凝集蛋白或完全抗体(通常为igm抗体)。结合(敏化)红细胞但不引起直接凝集的抗体称为不完全抗体(通常为igg抗体)。
16.红血细胞抗原及其对应的抗体通常通过凝集反应来检测，这可以在生理盐溶液中进行。在实践中，凝集测试可以通过使用例如具有低离子强度的介质、蛋白水解酶(例如菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶或无花果蛋白酶)、聚阳离子(例如聚凝胺)、大分子(例如白蛋白)或聚合物(例如聚乙二醇(peg)或右旋糖酐)而变得更加灵敏。已知大量的血清学测试。
17.通常，常用的血清学测试是管法(tube method)、微柱测试(micro column tests)和微板测试(tests in micro plates)。这些技术可以进一步分为基于凝集即复合物形成的技术和基于固相(亲和力)原理的技术。
18.此外，基于dna技术的血液分型测试是可用的，例如血型基因分型，它们在血清学领域的应用变得越来越重要。此外，基于荧光标记物或磁珠的技术也是可用的。
19.当考虑到目前在血清学领域的主要临床应用时，管法、微柱测试和微板测试这些测试被广泛使用，并且将在下文进一步详细描述。
20.管法是广泛使用的测试，允许与抗体延长时间孵育。红细胞在与抗体反应之后，可以沉淀或离心，以加速凝集反应。
21.管法测试的重要且广泛应用的变化形式是由moreschi于1908年描述并且由moreschi等人于1945年重新引入的抗球蛋白测试或库姆斯测试(coombs test)。库姆斯测试基于这样的原理，即装载有例如igg型不完全抗体的红细胞可以通过添加抗球蛋白血清而凝集。在测试中，可以区分三个阶段。
22.第一阶段是敏化阶段。在这一阶段期间，抗体与红血细胞上对应的抗原结构结合或关联(红血细胞敏化)。当发生结合，从而形成结合运载体(红细胞)的分析物(抗体)时，开始第二阶段，也称为洗涤阶段。在这个洗涤阶段，大体上所有未结合或未关联的抗体都从孵育混合物中去除。
23.第三阶段称为抗球蛋白阶段，其中将抗球蛋白血清添加至洗涤的敏化的即装载抗体的细胞中。这引起敏化细胞彼此结合，导致形成由聚簇的，即约50至数千个红细胞构成的复合物或凝集物。
24.当进行库姆斯测试时，在添加抗球蛋白血清之前，有必要非常彻底和频繁地清洗，并且因此这一步骤非常耗时。未充分去除未结合的抗体可能导致抗球蛋白血清失活。该测试的其他缺点是需要由受过训练的专业人员迅速读取结果，使得测试结果不能保存，由于手动读取测试结果，测试的可重复性较差，并且难以使测试自动化。
25.如上所述，库姆斯测试中的洗涤步骤非常耗时。由lapierre等人和欧洲专利0 194 212和0 305 337实现了改进，使用惰性和固体颗粒的微柱在离心时保留凝集物，而血清保留在微柱的顶部，并且未凝集的细胞可以容易地通过微柱。
26.在该测试系统中，利用填充有凝胶的小柱。可以利用包含抗体(例如用于血型分型)或不包含抗体(例如用于反向abo分型)的柱。
95/31731和wo 98/16831以及美国专利5,665,558和5,905,028)和van der donk等人(sanquin，欧洲专利1 064 556)。
38.以上描述的亲和力凝胶测试系统的一个主要缺点是需要相对大量的昂贵的配体分子，而存在于凝胶颗粒外表面上的仅一部分配体分子被有效地用于与红细胞的相互作用或关联。
39.另一个缺点是在(非敏化)红血细胞与凝胶基质和/或固定的配体之间可能发生a-特异性相互作用，导致红血细胞与凝胶基质的表观结合，并且从而增加假阳性反应的数量。
40.许多关于红细胞的血清学测试使用这些红细胞的红色用于使反应结果可视化。然而，这对于关于凝血细胞的血清学测试是不可能的。这里一种可能的方法(也适用于红细胞)是使用荧光标记物。将携带(或不携带)针对特定抗原的分型抗体的细胞与携带荧光染料并且能够与结合至细胞的分型抗体特异性反应的第二种化合物一起孵育。接下来，携带分型抗体的抗原阳性细胞可以使用流式细胞术分析来鉴定。例如，该技术可以应用于由von dem borne等人1978年描述的血小板免疫荧光测试(pift)中的凝血细胞。
41.以类似的方式，直接或间接免疫荧光染色之后流式细胞术分析可以应用于红细胞用于血型分型，使用单管或微板孔用于每个单独的分型反应。
42.以上描述的所有管、微柱和微板测试的主要缺点是，每次分析运行要测试的样品量受到管、微柱或微板和/或用于旋转管、微柱或微板的离心机和/或用于可视化反应结果的读取器或流式细胞仪的容量的限制。这些测试中的每个样品都要求单独的管、微柱或微板孔。
43.这些测试的另一个缺点是进行测试要求相对大量的样品材料，从而限制了在特定临床和/或新生儿样品的情况下要进行的测试量。
44.允许通过在芯片格式上点样反应组分来同时分析大量样品的阵列方法已被描述用于dna基因分型，并且例如被beckmann coulter(genomelab snpstream)和bioarray solutions(beadchip)使用。dna基因分型限于血型分型，然而，不能进行抗体的筛选和鉴定。
45.已经描述了用于使用luminex平台上的微珠测定例如paktm-lx(gti和gen-probe)检测凝血细胞抗体的阵列方法。
46.已经描述了另一种用于使用点样在(声称的)mosaiq系统(quotient biosciences)中的红血细胞的(片段)检测红细胞抗体以及血型分型的阵列方法。
47.这些阵列方法的主要缺点是要求专用设备和一次性用品来进行多重测定。
48.考虑到以上情况，除其他外，本发明的一个目的是消除与已知(血清学)测试系统关联的以上缺点的至少部分。
49.发明概述
50.根据本发明，如所附权利要求中概述的，该目的得以实现。
51.特别地，本发明通过提供单管(即单容器)水性制品，诸如缓冲液、等渗溶液或生理盐溶液来实现该目的，所述制品包含用于血液血清学的一组不同地标记的血清学相关血细胞类型，其中差异标记包括选自至少两种不同标记物的标记物，并且所选择的标记物以不同量与血清学相关血细胞类型关联。
52.通过不同地配制，本发明提供了形成基于待确定或测试的血型血清学的综合组的
血细胞的单一水性组合物，诸如缓冲液或等渗盐溶液。通常，每种血细胞类型的100个至500,000个，诸如至少500个，例如1,000个或1,500至250,000个血细胞足以用于血液血清学。
53.本发明人惊奇地发现，使用有限的一组标记物(诸如2种、3种或4种)与将不同量的标记物与血细胞关联组合允许在单次测定或测试中区分6种至216种血细胞类型，诸如8种、10种、12种、14种、16种、18种、20种、30种、40种、50种、60种、80种、100种或更多种血细胞类型。
54.优选地，使用本发明的该组不同地标记的血清学相关血细胞类型的血清学与流式细胞术组合使用。
55.根据本发明，形成本发明的该组血清学相关血细胞类型的血细胞优选地是红细胞、凝血细胞和/或白血细胞，更优选地红细胞或凝血细胞，最优选地红细胞。
56.本发明的标记物优选地是荧光标记物，但是在本发明的上下文中也设想了颜色、酶促或放射性标记物。
57.本发明的单管制品可以使用包括以下步骤的方法容易地制备：
[0058]-将血清学相关血细胞类型与选自至少两种标记物的标记物以所选择的标记物的不同浓度在允许所述标记物与所述血清学相关血细胞类型关联的条件下单独孵育；
[0059]-去除非关联标记物；
[0060]-将单独孵育的血清学相关血细胞类型组合在单管制品中。
[0061]
优选地，在以上孵育中，标记物的浓度在0mg/ml至100mg/ml的范围内。在这个范围内，不同的浓度导致可辨别量的标记物与血细胞类型关联。例如，在本发明单管制品中，将血细胞类型与0mg/ml、20mg/ml、40mg/ml和60mg/ml浓度的单种标记物单独孵育产生4种可辨别的血细胞类型。
[0062]
在本领域中，已知许多方法将标记物与细胞关联、附接或结合，诸如使用异硫氰酸荧光素的直接标记或使用生物素/链霉抗生物素蛋白的间接标记。
[0063]
本发明的该组不同地标记的血清学相关血细胞类型允许血清学或血液分型方法，所述血清学或血液分型方法包括以下步骤：
[0064]-提供本发明的单管制品；
[0065]-将需要血液血清学的个体的血清学相关抗体样品、全血、血浆、血清或血清衍生样品与所述单管制品在允许所述血清学相关抗体样品、所述血清或血清衍生样品与所述不同地标记的血清学相关血细胞类型关联的条件下一起孵育；
[0066]-去除非关联血清学相关抗体样品、血清或血清衍生样品；
[0067]-分析该组不同地标记的血清学相关血细胞类型与所述血清学相关抗体样品、所述血清或血清衍生样品的关联。
[0068]
用于测试人类血细胞抗原和/或补体组分的存在或不存在的血清学相关抗体样品的实例是包含来源于人类或动物源的具有对应的特异性的单克隆和/或多克隆抗体或其片段的样品。通常，血清或血清衍生样品允许测试人类血细胞抗体(包括存在的抗体的同种型)的存在或不存在。
[0069]
本发明分析优选地包括允许自动化高通量数据收集和随后的计算机化数据分析和呈现的流式细胞术。
[0070]
根据另一种优选的实施方案，分析与样品反应的该组差异标记的细胞包括使用微流体系统中的传感器进行检测，允许用较低量的试剂进行分析、自动化数据收集以及随后的计算机化数据分析和呈现。
[0071]
根据另一种优选的实施方案，分析与样品反应的该组差异标记的细胞包括将样品血清学相关细胞固定在固体支持物上，拍摄图像和随后的计算机化数据分析和呈现。
[0072]
另外的自动化和高通量优选地通过在多孔或微量滴定板中进行本方法来提供。
[0073]
在本发明方法中，在去除之后但在分析之前，添加另外的标记物，优选地能够检测人类抗体和/或补体组分的标记的抗体。在本发明方法的这个优选的步骤中，适合的抗体的实例是抗人类免疫球蛋白抗体或抗人类补体抗体或其片段。
[0074]
本发明血清学方法优选地用于对需要输血的个体进行血清学表征、对献血者进行血清学表征或对个体进行预防性血清学表征。例如，筛选和鉴定献血者和患者血清中存在的红细胞和/或血小板抗体，通过可能的献血者与受血者之间的交叉匹配选择适合的献血者进行输血，筛选和鉴定妊娠期间形成的抗体。
[0075]
发明详述
[0076]
在血型血清学中，必须对输血的受血者的血清进行筛选，以确认红细胞抗体的存在。如果检测到抗体，必须对其进行鉴定，以便能够选择对对应的血型为阴性的献血者血液。
[0077]
为了筛选血清中红细胞抗体的存在，要求一组由2种或3种不同的红细胞悬液组成的组的抗体，作为整体携带所有临床相关血型，并且优选地纯合表达。如果血清中不存在红细胞抗体，与2种或3种不同的筛选组红细胞悬液的反应将为阴性，并且不需要另外的措施来选择相容的献血者血液。
[0078]
然而，如果血清中存在红细胞抗体，则观察到与一个或更多个筛选组红细胞悬液的阳性反应，并且必须确定抗原特异性。对于筛选期间发现的红细胞抗体的随后鉴定，要求至少8种至多达约15-20种不同红细胞悬液的鉴定组，携带各种组合的所有临床相关血型，并且包括对特定血型阴性的红细胞。基于受血者血清与所有单独红细胞悬液的反应模式，然后可以确定一种或更多种红细胞抗体的身份。
[0079]
尽管筛选组的2种或3种不同的红细胞悬液在视觉上是不可区分的，但理论上它们可以混合在一起，以便节省一些样品材料(受血者血清)、试剂红细胞、一次性用品和分析时间，因为人们仅对与2种或3种不同的红细胞悬液中的任一种可能的阳性反应感兴趣。然而，通过混合这2种或3种不同的红细胞悬液，存在的血型抗原被稀释，因为不是每种血型都存在于所有2种或3种细胞上，这可能导致假阴性反应。由于鉴定组的8种至15-20种不同的红细胞在视觉上也是不可区分的，这些不能混合在一起，因为人们必须知道受血者血清与每一个单独组的红细胞悬液的反应结果，以便能够确定一种或更多种红细胞抗体的身份，从而要求相对多的样品材料、试剂红细胞、一次性用品和分析时间。
[0080]
本发明人惊奇地发现了一种方法，该方法单独地且独特地标记鉴定组的至少6种不同的红细胞，诸如8种至15-20种不同的红细胞，允许在单个容器中将它们全部混合在一起，并且仍然以高灵敏度区分它们与受血者血清的反应性，从而节省(患者)样品材料、试剂红细胞、一次性用品和分析时间。
[0081]
为了能够区分多达15-20种不同的红细胞，人们将必须用15-20种不同的标志物来
标记这些细胞，所述标志物如着色剂、放射性示踪剂、酶或荧光染料。选择这些大量的例如不同的荧光染料在同时测量它们方面是不太实际的，因为将要求高成本的专用设备/试剂。本发明人惊奇地发现，通过每种荧光染料使用5种至6种不同的浓度，仅使用2种不同的荧光染料来(双重)可区分地标记多达25-36种不同的红细胞同时允许同时鉴定是可能的。以这种方式，产生了用于红细胞抗体鉴定的单管矩阵(matrix)/阵列。
[0082]
在反应容器中，不同的、可区分的运载体(诸如荧光(单、双或非)标记的红细胞)和分析物(诸如抗体)的混合物的孵育导致混合物中存在的一种或更多种不同运载体形成结合运载体的分析物，诸如抗体敏化的红细胞。
[0083]
接下来，允许用分析物(优选地补体因子和/或igg抗体和/或igm抗体和/或iga抗体)敏化的运载体(优选地红血细胞)与装载有(可区分的)荧光染料的第二分析物(优选地抗补体抗体和/或抗igg抗体和/或抗igm抗体和/或抗iga抗体)反应，以便形成结合运载体的第二分析物。
[0084]
重要的是要注意，在与分析物一起孵育时，反应容器中大体上不发生复合物形成，即结合运载体的分析物的凝集。然而，这固有地意味着，在igm抗体的情况下，必须大体上防止反应容器中复合物或凝集物的自发形成。本领域技术人员通过遵循heidelberger曲线，能够以例如通过由稀释降低红细胞抗体的浓度大体上防止复合物形成或凝集的方式容易地选择运载体和分析物的浓度。
[0085]
还必须例如通过由稀释降低第二分析物的浓度或通过使用第二分析物的片段大体上防止反应容器中第二分析物形成复合物或凝集物。
[0086]
在反应容器中孵育阶段之后，将未结合的(第二)分析物例如通过离心和抽吸或过滤从孵育混合物中去除。
[0087]
接下来，不同运载体与结合的(第二)分析物(或不结合)的混合物通过流式细胞术分析进行分析，允许在单次运行中确定存在的不同运载体中哪些具有结合的(第二)分析物，以及哪些没有。通过在混合物中包含至少8种至多达15种不同的运载体，可以在单次测定运行中确定一种或更多种分析物的抗原特异性，从而节省样品材料、试剂红细胞、一次性用品和分析时间。
[0088]
使用根据本发明的方法，发现同时展示igg型抗体和/或igm型抗体的存在并以高灵敏度鉴定它们的抗原特异性是可能的。
[0089]
除了将多于一种不同的运载体与已知的抗原模式混合并将该混合物与未知的分析物孵育之外，该方法还可以反过来应用，即将多于一种不同的运载体与未知的抗原模式混合并将该混合物与已知的分析物孵育。
[0090]
以这种方式，发现同时展示每种单独运载体上不同抗原的存在或不存在是可能的，例如在同时检测多于一个献血者中某些血型抗原的存在或不存在的情况下。
[0091]
此外，与目前基于凝集的血清学测试程序相比，抗体鉴定或血型分型所需的红细胞数量显著减少(50-100倍)。
[0092]
如以上定义的本发明方法提供了优于现有技术的血清学测试系统的许多优点，特别地关于增加灵敏度、降低对样品材料、试剂、一次性用品和分析时间的要求以及测试的高度自动化潜力方面。
[0093]
考虑到该方法的以上有利特性，描述了一种用于同时检测结合运载体的分析物的
方法，所述方法包括：
[0094]
a)用不同浓度的不同荧光染料标记多于一种运载体；
[0095]
b)将标记的运载体混合；
[0096]
c)将混合的运载体和分析物装载到容器中；
[0097]
d)将所述混合的运载体和所述分析物在所述容器中孵育，用于形成(混合的)结合运载体的分析物；
[0098]
e)通过离心和抽吸或过滤去除未结合的分析物；
[0099]
f)在所述容器中装载携带(可区分的)荧光染料的第二分析物；
[0100]
g)将所述(混合的)结合运载体的分析物和所述第二分析物孵育，用于形成(混合的)结合运载体的第二分析物；
[0101]
h)通过离心和抽吸或过滤去除未结合的第二分析物；
[0102]
i)通过流式细胞术分析检测标记的运载体混合物中结合运载体的第二分析物的存在
[0103]
j)通过(软件)解释鉴定结合的分析物。
[0104]
在反应方法中，孵育可以使用诸如celltrace cfse、celltrace紫、荧光加标签的n-羟基琥珀酰亚胺酯(例如fitc、pacific蓝)的标记物，使用从1mg/ml至60mg/ml变化的浓度在微板中进行，微板可以在底部处封闭，或者具有基于过滤器的底板。第二分析物可以装载有pe或apc作为荧光标记物，并且混合的运载体和分析物的孵育可以在2℃至37℃在5分钟至30分钟期间进行。
[0105]
根据本发明方法，(混合的)结合运载体的分析物和第二分析物的孵育优选地包括在2℃至37℃持续5分钟至30分钟。
[0106]
在另一种优选的实施方案中，允许用分析物敏化的运载体与附接至固体支持物的第二分析物反应(或不反应)，以便捕获用分析物敏化的运载体，分析物优选地为补体因子和/或igg抗体和/或igm抗体和/或iga抗体，运载体优选地为红细胞，固体支持物优选地为包被的表面、包被的表面阵列或磁珠，第二分析物优选地为抗补体抗体和/或抗igg抗体和/或抗igm抗体和/或抗iga抗体。
[0107]
在一种优选的实施方案中，传感器，优选地显微成像，随后是数字图像分析，确定用分析物敏化的运载体的存在(或不存在)，允许在单次运行中确定存在的不同运载体中哪些已经结合(第二)分析物以及哪些没有。通过在混合物中包含至少8种至多达15种不同的运载体，可以在单次测定运行中确定一种或更多种分析物的抗原特异性，从而节省样品材料、试剂红细胞、一次性用品和分析时间。
[0108]
本发明将在包括和描述本发明优选的实施方案的以下实施例中进一步详述。在实施例中，参考附图，其中：
[0109]
图1：示出了用于同时检测结合运载体的分析物(在这种情况下是红细胞与结合的抗体)的方法的时间表。来自不同已知献血者的红血细胞被(双重)标记(或不标记)并且混合在一起。接下来，将混合的荧光标记的红细胞与包含分析物(例如igg型或igm型抗体)的样品一起孵育，并且与荧光标记的第二抗体(例如抗igg抗体或抗igm抗体或其片段)连续孵育。之后，通过流式细胞术分析具有结合的(第二)抗体的红细胞。
[0110]
图2：示出了如何使用荧光染料对红细胞进行差异标记，以产生4x4矩阵，该矩阵不
会干扰抗原检测，并且在储存9周后是稳定的。将来自16个已知献血者的红血细胞使用不同浓度的异硫氰酸荧光素异构体i(fitc)和pacific蓝琥珀酰亚胺酯标记，以产生如通过流式细胞术评价的矩阵。这16种差异标记的献血者红细胞可以容易地区分。
[0111]
图3：示出了来自12个已知献血者的使用不同浓度的fitc和生物素/链霉抗生物素蛋白-apc单荧光标记、双荧光标记或未荧光标记的混合的红细胞的流式细胞术分析的2d图。这12种差异标记的献血者红细胞可以在4
×
3矩阵中容易地区分。
[0112]
图4：示出了在两个已知患者血清样品中抗红细胞膜c抗体的检测。直方图显示这些血清样品中针对rhc的igg和/或igm抗体的检测。颜色表示三种不同的试剂红细胞(1002、967、1008)或如入口中所示的对照。血清1包含针对rhc的igg型和igm型抗体，而血清2仅包含针对rhc的igg型抗体。rhc抗原杂合表达的试剂红细胞比纯合表达的试剂红细胞显示更低的信号。
[0113]
图5：示出了用于鉴定红细胞抗体的流式细胞术分析的结果。将包含抗rh-c抗体的已知患者血清样品与来自8个已知献血者的使用不同浓度的fitc和生物素/链霉抗生物素蛋白-pacific蓝单荧光标记、双荧光标记或未荧光标记的混合的红血细胞一起孵育。使用用生物素/链霉抗生物素蛋白-apc标记的第二抗体检测混合物中与红血细胞关联的抗rhc抗体。rh c抗原阳性的红细胞可以在3
×
3矩阵中容易地区分：1002、1000、957和903号红细胞具有rh c抗原的纯合表达，并且显示最高的信号；967和837号红细胞具有rh c抗原的杂合表达，并且显示较低的信号；1008和955号红细胞对rh c抗原为阴性的。
[0114]
图6：示出了根据本发明方法，11种不同试剂红细胞的鉴定组的抗原模式，表明临床相关血型抗原的(纯合或杂合)存在或不存在，以及与包含抗rhc抗体的已知患者血清样品反应的测试结果。从倒数第二列中显示的反应模式可以确认抗rhc抗体的存在。
[0115]
图7：示出了用于鉴定抗k(ell)红细胞抗体的流式细胞术分析的结果。将包含抗k抗体的已知患者血清样品与来自8个已知献血者的使用不同浓度的alexa fluor 405和alexa fluor 488单荧光标记、双荧光标记或未荧光标记的混合的红血细胞一起孵育。使用用生物素/链霉抗生物素蛋白-apc标记的第二抗体检测混合物中与红血细胞关联的抗k抗体。3号和7号红细胞对k抗原为阳性的，并且在矩阵中可以与其他对k抗原为阴性的细胞容易地区分开。
[0116]
图8：示出了通过本发明方法对6个献血者的混合的红细胞群体的fya和fyb抗原血型分型的流式细胞术分析结果。来自6个献血者的不同地标记的红细胞可以容易地区分，并且可以清楚地展示每个个体献血者的fya和fyb抗原的存在或不存在：献血者1、2和3对fya抗原为阳性的，而对fyb抗原为阴性的；献血者4、5和6对fya抗原为阴性的，而对fyb抗原为阳性的。
实施例
[0117]
实施例1
[0118]
将来自16个不同已知献血者的红血细胞洗涤并且悬浮于具有2％牛血清白蛋白(bsa,sigma-aldrich)的磷酸盐缓冲盐水(pbs)中。对于红血细胞的荧光标记，制备生物素和fitc的1mg/ml的储备溶液。将这16种不同的红血细胞群体(每个献血者约50000个细胞)与不同浓度(0mg/ml、6mg/ml、20mg/ml和60mg/ml)的生物素和fitc在37℃孵育30分钟，同时
以350rpm的速度振荡。在孵育之后，将红细胞用pbs/2％bsa洗涤。
[0119]
接下来，将红血细胞与链霉抗生物素蛋白-pacific蓝(与生物素结合)在黑暗中在4℃孵育30分钟。在洗涤之后，将红血细胞在具有高通量采样器的5或3激光流式细胞仪(5l fortessa+hts、3l canto ii+hts和5l lsr ii+hts)上通过流式细胞术进行分析。将获得的数据使用flowjo软件分析。根据图2，以这种方式，可以产生16种单标记、双标记或未标记的红血细胞的矩阵，其中可以容易地区分差异标记的红细胞。
[0120]
实施例2
[0121]
如实施例1中描述的，现在将来自12个不同已知献血者的红血细胞使用0mg/ml、20mg/ml和60mg/ml fitc和0mg/ml、6mg/ml、20mg/ml和60mg/ml生物素和链霉抗生物素蛋白-apc代替链霉抗生物素蛋白-pacific蓝进行标记。在洗涤之后，如实施例1中描述的，将12种不同的红血细胞群体混合并且通过流式细胞术进行分析。根据图3，以这种方式，可以产生12种单标记、双标记或未标记的红血细胞的矩阵，其中可以容易地区分差异标记的红细胞。
[0122]
实施例3
[0123]
将来自3个不同已知献血者的红血细胞(分别为rhc抗原纯合的、杂合的和阴性)洗涤并且悬浮于pbs/2％bsa中。将这3种不同的红血细胞群体与2种包含抗红细胞膜c抗体的已知患者血清在37℃孵育15分钟。在孵育之后，将红细胞用pbs/2％bsa洗涤三次。接下来，将红血细胞与荧光第二抗体(apc标记的抗人类igg和pe标记的抗人类igm)在黑暗中在4℃孵育30分钟。
[0124]
在用pbs洗涤三次之后，如实施例1中描述的，将红血细胞通过流式细胞术分析。根据图4，直方图显示这两个患者血清样品中针对rhc的igg和/或igm抗体的检测。颜色表示三种不同的献血者红细胞(1002、967、1008)或如入口中所示的对照。血清1包含针对rhc的igg型和igm型抗体，而血清2仅包含针对rhc的igg型抗体。如预期的，杂合表达rhc抗原的献血者红细胞比纯合表达的献血者红细胞显示更低的荧光信号。
[0125]
实施例4
[0126]
如实施例1中描述的，将来自8个不同已知献血者的红血细胞(分别为rhc抗原纯合的、杂合的和阴性)使用不同浓度的fitc和生物素/链霉抗生物素蛋白-pacific蓝进行标记。在洗涤之后，将8种不同地标记的红血细胞群体和一个未标记的对照混合并且悬浮于pbs/2％bsa中。接下来，将这些混合的红细胞与包含抗rhc抗体的患者血清在37℃孵育15分钟。在孵育之后，将混合的红血细胞用pbs/2％bsa洗涤三次。
[0127]
接下来，将混合的红血细胞与荧光第二抗体(apc标记的抗人类igg)在黑暗中在4℃孵育30分钟。在用pbs洗涤三次之后，如实施例1中描述的，将混合的红血细胞通过流式细胞术分析。根据图5，由于apc标记物的荧光，携带rhc抗原并因此与抗rhc抗体反应的6种红血细胞群体可以在3
×
3矩阵中容易地检测到，2种抗原阴性红血细胞群体和对照没有显示apc标记物的荧光。杂合表达rhc抗原的红血细胞比纯合表达的红血细胞显示更低的荧光信号。
[0128]
实施例5
[0129]
如实施例2中描述的，将11种不同的试剂红血细胞进行标记。来自一个患者的已知血清中具有igg抗rhc抗体的红细胞没有被标记并且用作自动对照(autocontrol)。在洗涤
之后，将11种不同地标记的试剂红血细胞和患者红血细胞混合并且悬浮于pbs/2％bsa中。接下来，将这些混合的红血细胞与包含抗rhc抗体的患者血清在37℃孵育15分钟。在孵育之后，将混合的红血细胞用pbs/2％bsa洗涤三次。
[0130]
接下来，将混合的红血细胞与荧光第二抗体(apc标记的抗人类igg)在黑暗中在4℃孵育30分钟。在用pbs洗涤三次之后，如实施例1中描述的，将混合的红血细胞通过流式细胞术分析。由于apc标记物的荧光，携带rhc抗原并因此与抗rhc抗体反应的9种红血细胞可以在4
×
3矩阵中容易地检测到，2种rhc抗原阴性试剂红血细胞和自动对照没有显示apc标记物的荧光。根据图6，测试结果与11种试剂红血细胞的抗原谱的比较确认了抗rhc抗体的存在。
[0131]
实施例6
[0132]
如实施例1中描述的，现在，将来自8个不同已知献血者的红血细胞(分别为k(ell)抗原纯合的、杂合的和阴性)使用不同浓度的alexa fluor 405和alexa fluor 488进行标记。在洗涤之后，将8种不同地标记的红血细胞群体混合并且悬浮于pbs/2％bsa中。接下来，将这些混合的红血细胞与包含抗k抗体的患者血清在37℃孵育15分钟。在孵育之后，将混合的红血细胞用pbs/2％bsa洗涤三次。
[0133]
接下来，将混合的红血细胞与荧光第二抗体(apc标记的抗人类igg)在黑暗中在4℃孵育30分钟。在用pbs洗涤三次之后，如实施例1中描述的，将混合的红血细胞通过流式细胞术分析。根据图7，由于apc标记物的荧光，携带k抗原并因此与抗k抗体反应的2种红血细胞群体可以在矩阵中容易地检测到，6种k抗原阴性红血细胞群体没有显示apc标记物的荧光。
[0134]
实施例7
[0135]
如实施例5中描述的，分析了另外7个具有(以前)已知(弱)红细胞抗体的患者血清样品，现在使用apc标记的抗人类igg和pe标记的抗人类igm作为荧光第二抗体，在黑暗中在4℃孵育5min，并且使用(7孔)微板制备所有7个患者样品。根据表1，所有红细胞抗体仍然可以在这7个患者血清样品中被鉴定出，而参考测试(间接抗球蛋白测试(管法))仅能够检测到3个患者血清样品中的抗体。此外，用本发明方法，可以在相同测定运行中直接确定igg型和/或igm型红细胞抗体的存在。
[0136]
表1
[0137][0138]
实施例8
[0139]
如实施例2中描述的，现在将来自6个不同献血者的红血细胞使用0mg/ml、6mg/ml和20mg/ml fitc和0mg/ml、6mg/ml和20mg/ml生物素和链霉抗生物素蛋白-apc以不同组合进行标记。在洗涤之后，将6种不同的红血细胞群体混合并且悬浮于pbs/2％bsa中。接下来，将这些混合的红血细胞与igg抗fya分型抗体和igm抗fyb分型抗体在37℃孵育15分钟。在孵育之后，将混合的红血细胞用pbs/2％bsa洗涤三次。接下来，将混合的红血细胞与荧光第二抗体(apc标记的抗人类igg和pe标记的抗人类igm)在黑暗中在4℃孵育30分钟。在用pbs洗涤三次之后，如实施例1中描述的，将混合的红血细胞通过流式细胞术分析。
[0140]
根据图8，直方图显示混合物中存在的所有6个个体献血者的红血细胞上fya和fyb抗原的存在或不存在：献血者1、2和3对fya抗原为阳性的，并且对fyb抗原为阴性的；献血者4、5和6对fya抗原为阴性的，并且对fyb抗原为阳性的。这些分型结果通过管法中的参考测试得到确认。在用fitc和生物素/链霉抗生物素蛋白-apc对红血细胞进行荧光标记之后，仍然能够以类似的方式展示例如血型抗原a、b、d、c、c、e、e、cw、k、k、jka、jkb、m、n、s、s、lua、lub、kpa和kpb的存在。
[0141]
结论
[0142]
从图2和图3中明显的是，根据本发明，可以产生被可区分地荧光标记的多于一种红血细胞群体的矩阵。为此，可以使用以不同浓度的几种荧光标记物，这不干扰血型抗原检测，并且随着时间的推移是稳定的。
[0143]
从图4-图7和实施例3-实施例7中明显的是，根据本发明，患者血清样品中存在的针对血型抗原的红细胞抗体可以在单管测试中鉴定，并且比间接凝集测试(管法)具有更高的灵敏度。此外，从图4和表1中明显的是，根据本发明，在同一单管测试中，也可以确定抗体同种型(例如igg或igm)。
[0144]
从图1和实施例7中明显的是，根据本发明，通过对每个患者样品使用单微板孔，可以以高通量的方式鉴定多于一个患者血清中红细胞抗体的存在。此外，从实施例1和实施例7中明显的是，与基于凝集的测定相比，可以使用显著降低数量的已知献血者红细胞和低得多的量的患者血清来进行红细胞抗体的鉴定，这在仅存在有限量的测试样品可用的情况下非常有利。
[0145]
从图8和实施例8中明显的是，根据本发明，在单管测试中，在来自多于一个献血者的红血细胞混合物中，可以鉴定每个个体献血者的不同血型抗原的存在。