一种p53自身抗体检测试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种p53自身抗体检测试剂盒及其应用。

背景技术：

我国癌症负担目前仍然逐年快速上升，给国家、社会、家庭及个人都造成很大的影响，除了治疗手段及投入外，早期肿瘤的筛查与发现能力至关重要。血清中的肿瘤抗原等标志物能诱导机体产生自身抗体，在肿瘤发生还未能被临床检查手段检测到的早期，机体免疫系统就可监测到低水平表达的肿瘤抗原的存在，并引发免疫反应，产生大量的抗体，起到有效的生物信号放大作用。其中，p53基因是一种抑癌基因，是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因，p53基因的突变、缺失是人类肿瘤的常见事件，与肿瘤的发生、发展关系密切，在结肠癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、脑癌和食道癌中均有发现。目前研究认为引起肿瘤形成或细胞转化的p53蛋白是p53基因突变的产物，是一种肿瘤促进因子，其触发机体免疫应答反应，可产生血清p53自身抗体。

人血中肿瘤抗原相关的自身抗体浓度通常比相对应的抗原浓度高，而且不易被降解或消除，也不像其他多肽一样易受蛋白酶水解作用，半衰期长，理化性质稳定，因此可以在肿瘤病灶没有出现前存在于循环血液中，并相当长一段时间内在血清中稳定、持续存在。多项研究表明在影像学检查确诊实体癌数月至数年前即可检测到自身抗体的存在，甚至在肿瘤确诊前2-10年就可检测到血清中有针对肿瘤抗原的抗体，对比临床常用的肿瘤标记物蛋白，自身抗体的检测在肿瘤诊断中占极大的优势。

最常用的自身抗体检测是间接elisa方法，该法先将抗原在以聚苯乙烯为基质的微孔板或乳胶上包被，血样中的自身抗体与该固定化的抗原反应而结合，结合态的抗体再被标记的抗人免疫球蛋白二级抗体结合而检测。如此，微孔板固相表面的空间位阻限制了抗原和抗体之间的结合效率；而且，疏水聚苯乙烯基质对血样中同样带有疏水区域(fc段)标记二级抗体具有吸附作用，进而造成非特异本底。因此，间接elisa方法的灵敏度较低，不能满足肿瘤早期诊断所需的检测微量自身抗体的要求。

自身抗体检测另外一个方法是双抗原夹心法，即把上述elisa方法所使用的标记二级抗体改为标记的抗原，可以降低或避免上述间接elisa方法非特异吸附引起的本底问题。但这个方法需要包被抗原、自身抗体和标记抗原三者之间浓度和亲和力处于合适比例区间，这时才能产生有效的定量曲线。如果先让自身抗体与包被抗原结合，抗体基本上被固相上的抗原屏蔽而没有机会再与标记抗原结合。所以，一般先让标记抗原与血样中的自身抗体结合，这个混合物再与包被抗原结合。但当自身抗体浓度过低时，抗原结合位点大部分被标记抗原结合而没有机会再和包被抗原结合，产生假阴性；当自身抗体浓度过高时，很多没有结合标记抗原的游离自身抗体与包被抗原结合，但并不产生信号，同样产生假阴性。

此外。也有人尝试乳胶聚集方法来消除本底引发的自身抗体检测低灵敏度问题，但这个方法涉及微柱离心，操作繁琐。还有人用同位素标记的抗原与血清中的自身抗体结合，再用蛋白a琼脂糖俘获这个免疫复合体，但同位素标记显然也不适合于需要对大量人群样本进行筛查的肿瘤早期诊断的需求。而且上述方法均需要先表达p53纯蛋白才能制备试剂盒，而纯蛋白的表达、纯化难度较大，所以制备成本较高。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种p53自身抗体检测试剂盒，采用非同位素标记特异性优异的合成小分子多肽抗原，可以与血清中的自身抗体充分、有效的结合，同时采用蛋白agl琼脂糖磁珠俘获样本体系中所有的免疫球蛋白，并定量自身抗体，检测灵敏度高，非特异性本底低，检测准确度高，可用于自身抗体的自动化检测技术，特别适用于肿瘤早期自身抗体的检测。

还提供了一种上述试剂盒在肺癌p53自身抗体检测中的应用，检测特异性强，灵敏度高、假阴性率低，成本低廉，操作简便，更有利于自动化、大样本筛查技术的实现。

本发明的目的之一采用如下技术方案实现：

一种p53自身抗体检测试剂盒，包括：辣根过氧化物酶标记多肽、蛋白agl琼脂糖磁珠、血清稀释液、tbst缓冲液、50％二甲基亚砜水溶液、3,3’,5,5’-四甲基联苯胺底物溶液、反应终止液；

所述多肽的氨基酸序列如seqidno.1所示。

优选地，所述：辣根过氧化物酶标记多肽是通过碘酸钠法制备而得的。

进一步地，所述血清稀释液为含1％脱脂奶粉的tbst缓冲液；所述反应终止液为2mol/l的硫酸溶液。

所述血清稀释液与待测血清用量的体积比为(9-11)：1。

进一步地，所述p53自身抗体检测试剂盒还包括非特异性本底对照液，所述非特异性本底对照液包括多肽溶液。

所述多肽溶液是通过将所述多肽溶解在所述50％二甲基亚砜水溶液中配制而得的。

优选地，按mg/ml计，所述多肽的质量与所述50％二甲基亚砜水溶液的体积比为5:1。

进一步地，所述非特异性本底对照液用于检测所述试剂盒的非特异性本底，包括以下步骤：

1)将待测血清与血清稀释液混合，得到稀释血清；然后向所述稀释血清中加入辣根过氧化物酶标记多肽和多肽溶液，室温下温育2-3h；

2)将步骤1)温育后的混合物加入到沉降体积为30-35μl的蛋白agl磁珠中，室温下温育2-3h，tbst缓冲液清洗，然后向磁珠中加入3,3’,5,5’-四甲基联苯胺底物液，反应15-20min后检测上清的450nmod值。

优选地，所述稀释血清、辣根过氧化物酶标记多肽、多肽溶液的体积比为(200-250)：1：(2-3)。

本发明的目的之二采用如下技术方案实现：

一种上述p53自身抗体检测试剂盒在肺癌p53自身抗体检测中的应用。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

1、本发明采用的合成小分子多肽抗原具有特异性明确的优点，但如果它依靠物理吸附取向随机地包被在微孔板上，与自身抗体结合的空间位阻非常大，很难检测到微量自身抗体，其自身抗体检测灵敏度低的问题更加严重。本发明试剂盒采用非同位素辣根过氧化物酶标记多肽，小分子的多肽特异性强，先在样本中与待测自身抗体充分、有效的结合，得到标记多肽-自身抗体复合体，然后用蛋白agl琼脂糖磁珠俘获样本体系中所有的免疫球蛋白，包括标记多肽-自身抗体复合体，通过检测被俘获的标记多肽的量即可实现自身抗体的定量检测，检测特异性强、灵敏度高，特别适用于肿瘤早期自身抗体检测。本发明试剂盒采用辣根过氧化物酶标记多肽，结合上述使用方法，操作更简便，更有利于自动化、大样本筛查。

2、本发明采用的蛋白agl琼脂糖磁珠的琼脂糖是亲水基质，与标记抗原的非特异吸附较低，试剂盒非特异性本底较弱；本发明同时设置了非特异性本底对照液，通过加入过量未标记小分子多肽抗原的作为对照来考察和矫正标记抗原非特异吸附本底，进而消除非特异本底带来的影响。

3、本发明试剂盒及其应用是非常重要的突破，将来可以实现多个特异性清晰的多肽抗原组来做非常灵敏、特异和自动化、方便的血清学癌症早期筛查以及治疗的疗效和预后判定。

附图说明

图1为实施例4中蛋白变性凝胶电泳图；

图2为实施例4中免疫印迹检测图；1、空白琼脂糖磁珠；2、蛋白agl琼脂糖磁珠。

具体实施方式

下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。

一种p53自身抗体检测试剂盒，包括：辣根过氧化物酶标记多肽、蛋白agl琼脂糖磁珠、血清稀释液、tbst缓冲液、50％二甲基亚砜水溶液、3,3’,5,5’-四甲基联苯胺底物溶液、反应终止液；多肽的氨基酸序列如seqidno.1所示。

其中，辣根过氧化物酶(hrp)标记多肽是通过碘酸钠法制备而得的。蛋白agl琼脂糖磁珠对各类免疫球蛋白均有较高的亲和力，可以俘获人血清中所有类型的免疫球蛋白，包括早期免疫应答出现并长期存在与循环系统的igm，特别适用于肿瘤早期自身抗体检测的场景。

tbst缓冲液的组成为：10mmol/ltris-hcl、150mmol/lnacl、0.05％(v/v)tween-20，hcl调节ph至7.6。

血清稀释液为含1％脱脂奶粉的tbst缓冲液，检测时血清稀释液与待测血清用量的体积比为(9-11)：1；反应终止液为2mol/l的硫酸溶液。

上述p53自身抗体检测试剂盒还包括非特异性本底对照液，非特异性本底对照液包括多肽溶液。这里，多肽溶液通过将多肽溶解在50％二甲基亚砜水溶液中配制而得的，按mg/ml计，多肽的质量与50％二甲基亚砜水溶液的体积比为5:1。

上述非特异性本底对照液用于检测试剂盒的非特异性本底，包括以下步骤：

1)将待测血清与血清稀释液混合，得到稀释血清；然后向所述稀释血清中加入辣根过氧化物酶标记多肽和多肽溶液，室温下温育2-3h；稀释血清、辣根过氧化物酶标记多肽、多肽溶液的体积比为(200-250)：1：(2-3)。

2)将步骤1)温育后的混合物加入到沉降体积为30-35μl的蛋白agl磁珠中，室温下温育2-3h，tbst缓冲液清洗，然后向磁珠中加入3,3’,5,5’-四甲基联苯胺底物液，反应15-20min后检测上清的450nmod值。

一种上述p53自身抗体检测试剂盒在肺癌p53自身抗体检测中的应用，包括以下步骤：

1)将待测样本与血清稀释液混合，得到稀释血清；然后向所述稀释血清中加入辣根过氧化物酶标记多肽和50％二甲基亚砜水溶液，室温下温育2-3h；稀释血清、辣根过氧化物酶标记多肽、50％二甲基亚砜水溶液的体积比为(200-250)：1：(2-3)。

2)将步骤1)温育后的混合物加入到沉降体积为30-35μl的蛋白agl磁珠中，室温下温育2-3h，tbst缓冲液清洗，然后向磁珠中加入3,3’,5,5’-四甲基联苯胺底物液，反应15-20min后检测上清的450nmod值；

3)按照上述试剂盒非特异性本底的检测步骤，检测得到非特异性本底的od值；

4)将步骤2)测得的od值减去步骤3)得到的od值即为血清中p53自身抗体的含量。

实施例1

辣根过氧化物酶标记多肽的制备

(1)溶液配制：

溶液1：1mm醋酸-醋酸钠缓冲液，ph为5左右；

溶液2：100mm碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，ph为9.5左右；

溶液3：naio4溶液：6mgnaio4溶解于250μl溶液1中；

溶液4：nabh4溶液：4mgnabh4溶解于1ml去离子水中；

溶液5：多肽溶液：5mg多肽sg-13溶解在1ml的50％二甲基亚砜/水溶剂中，-20℃保存；多肽sg-13的序列如seqidno.1所示；

其中，溶液1、溶液2和溶液5事先配制，溶液3和4临时配制使用。

(2)hrp标记多肽的制备，包括以下步骤：

1)氧化反应：称取5mghrp溶解于500μl溶液1中，加入60μl溶液3，避光摇晃或搅拌反应30min；反应进行的同时，以溶液1平衡离心脱盐柱(杭州立昂科技有限公司产品p0201或p0202)；氧化反应结束后脱盐以除去未反应的naio4；

2)偶联反应：向脱盐后的溶液中加入100μl溶液2以调节ph到9左右，然后加30μl溶液5，避光摇晃或搅拌反应3h；

3)还原反应：向偶联反应结束后的溶液中加入40μl溶液4，4℃避光静置反应2h，每30min摇晃一次；反应进行的同时，以磷酸缓冲盐溶液平衡离心脱盐柱(杭州立昂科技有限公司产品p0201或p0202)；氧化反应结束后脱盐以除去未反应的nabh4。

4)向脱盐后的溶液中补充磷酸缓冲盐溶液使体积达到1ml，然后加入甘油至体积达到2ml，即得到hrp标记多肽。

实施例2

一种p53自身抗体检测试剂盒，包括：实施例1中的hrp标记多肽、蛋白agl琼脂糖磁珠、血清稀释液、tbst缓冲液、50％二甲基亚砜水溶液、3,3’,5,5’-四甲基联苯胺底物溶液、反应终止液、实施例1中的溶液5多肽溶液；其中血清稀释液为含1％脱脂奶粉的tbst缓冲液，反应终止液为2mol/l的硫酸溶液。

本实施例p53自身抗体检测试剂盒用于检测肺癌p53自身抗体的方法，包括以下步骤：

(1)将血清稀释液和肺癌病人血清按照体积比10:1混合，得到稀释血清；

(2)在200μl步骤(1)稀释血清中加入0.8μl实施例1中的hrp标记多肽以及2μl的50％二甲基亚砜水溶液，作为阳性样；

(3)在200μl步骤(1)稀释血清中加入0.8μl实施例1中的hrp标记多肽以及2μl的溶液5多肽溶液，作为本底对照样；

(4)将上述阳性样和本底对照样室温下温育2h后，分别加入到30μl沉降体积的蛋白agl(杭州立昂科技有限公司产品p0102)琼脂糖磁珠中，在室温下温育2h；磁吸后弃上清，用tbst缓冲液摇晃5min清洗3次，弃上清而保留磁珠；最后往磁珠中加入3,3’,5,5’-四甲基联苯胺底物液(杭州立昂科技有限公司产品d0301)200μl，室温反应15min后磁吸取上清，加50μl的2mol/l的硫酸溶液终止反应，450nm测量od值，结果如表1所示。

实施例3

一种p53自身抗体检测试剂盒，组成与实施例2中的试剂盒相同。

采用本实施例的p53自身抗体检测试剂盒检测正常人血清中的p53自身抗体，除检测血清样本不同外，检测肺癌p53自身抗体的方法与实施例2相同，此处不再赘述，检测结果如表1所示。

表1实施例2和3中450nmod值

由表1可以看出，实施例2中肺癌血清自身抗体在体系中能很好地与hrp标记多肽结合，而这种结合能够被同样在体系中的未标记的p53多肽抗原竞争抑制，其抑制度约为0.240，即表征p53自身抗体含量；肺癌血清的本底对照样均值约为0.640，即表征hrp标记多肽在检测系统中的本底。而实施例3中正常人血清的阳性样和本底对照样无显著差别，表明没有检测到p53自身抗体的存在。

实施例4

蛋白agl琼脂糖磁珠对免疫球蛋白的结合

(1)将200μl正常人血清加入到30μl沉降体积的蛋白agl琼脂糖磁珠中，在室温下温育2h；磁吸后弃上清，用tbst缓冲液摇晃5min清洗3次，弃上清而保留磁珠；将还原变性的蛋白上胶液加入磁珠中，100℃加热5min；磁吸取上清，凝胶电泳检测结果如图1所示。

(2)将10μl正常人血清加入到100μl磷酸缓冲盐溶液中进行稀释，然后加入10μl沉降体积的空白琼脂糖磁珠，作为空白样；将10μl正常人血清加入到100μl磷酸缓冲盐溶液中进行稀释，然后加入10μl沉降体积的蛋白agl琼脂糖磁珠，作为阳性样；

(3)将步骤(2)中的空白样和阳性样分别室温下温育1h后，进行磁分离，分别去10μl上清液进行sds-page检测；然后按照本领域常规方法将凝胶所含的蛋白质转移固定到nc膜上，采用兔抗人igm一抗、羊抗兔igg-hrp二抗、沉淀型3,3’,5,5’-四甲基联苯胺显色剂进行免疫印迹检测，结果如图2所示。

由图1可得，本实施例蛋白agl琼脂糖磁珠结合的免疫球蛋白以igg为主。由图2可以看出，本实施例蛋白agl琼脂糖磁珠处理过的血清样品igm以较大的幅度下降，即磁珠结合了血清中的igm。因此，蛋白agl琼脂糖磁珠能够充分结合血清中以igg和igm为代表的免疫球蛋白，包括本发明自身抗体。

对比例1

p53自身抗体微孔板俘获法检测，包括以下步骤：

1)用ph9.6、0.1mol/l碳酸缓冲液稀释蛋白agl至0.1mg/ml；取该稀释液50μl加入微孔板孔中，室温下温育1h；弃液，往微孔板微孔加入100μl含1％脱脂奶粉的tbst缓冲液，室温下温育1h；

2)按照实施例2步骤(1)-(3)的方法分别制备肺癌病人血清的阳性样和本底对照样、正常人血清的阳性样和本底对照样，再分别加入步骤1)包被蛋白agl的微孔板中；室温下温育2h，弃液，tbst缓冲液摇晃5min清洗3次；最终加入3,3’,5,5’-四甲基联苯胺底物液200μl，室温反应90min后加50μl的2mol/l的硫酸溶液终止，450nm测量吸收od值。

本实施例平行试验4次，所有检测均显示较低的od值，且未能检测到任何阳性样和本底对照样之间的差别，说明微孔板包被的蛋白agl未能有效俘获血清中的免疫球蛋白，以致自身抗体的检测的信号和灵敏度均较低。

对比例2

p53自身抗体微孔板抗原包被间接elisa法检测，包括以下步骤：

1)用ph9.6、0.1mol/l碳酸缓冲液稀释实施例1中的溶液5多肽溶液至10μm；取该多肽稀释液50μl加入微孔板孔中，室温下温育1h；弃液，往微孔板孔中加入100μl含1％脱脂奶粉的tbst缓冲液，室温下温育1h；

2)将含1％脱脂奶粉的tbst缓冲液分别与肺癌病人血清、正常人血清按照体积比10:1混合，得到肺癌稀释血清和正常稀释血清；

3)分别在200μl步骤2)的肺癌稀释血清和正常人稀释血清中加入2μl的50％二甲基亚砜水溶液，室温下温育2小时，作为肺癌血清阳性样和正常人血清阳性样；分别在200μl步骤2)的肺癌稀释血清和正常人稀释血清中加入2μl的实施例1中溶液5多肽溶液，室温下温育2小时，作为肺癌血清对照样和正常人血清对照样；

3)将步骤3)中的各阳性样和对照样分别加入步骤1)微孔板孔中，室温下温育2小时，弃液；加入100μl羊抗人hrp偶合物(赛默飞产品a18817)稀释液(稀释方法：含1％脱脂奶粉的tbst缓冲液与羊抗人hrp偶合物按照体积比10000:1混合)，室温下温育2h；弃液，tbst缓冲液摇晃5min清洗3次；最终加入3,3’,5,5’-四甲基联苯胺底物液200μl，室温反应60min后加50μl的2mol/l硫酸终止，450nm测量吸收od值。

本实施例所有检测反应显示低od值，未能检测到任何样品的阳性样和对照样之间的差别，说明微孔板的包被的多肽抗原未能有效结合血清中的自身抗体，检测的信号和灵敏度较低。

上述实施方式仅为本发明专利的优选实施方式，不能以此来限定本发明专利保护的范围，本领域的技术人员在本发明专利的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明专利所要求保护的范围。

序列表

<110>浙江省肿瘤医院

<120>一种p53自身抗体检测试剂盒及其应用

<130>20200206

<141>2020-01-08

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>13

<212>prt

<213>人工合成()

<400>1

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