一种芍药属植物根尖染色体制片的方法与流程

本发明涉及植物的染色体制片方法，具体涉及一种芍药属植物根尖染色体制片的方法。

背景技术：

芍药属系芍药科植物的灌木或草本，分为三个组：牡丹组、芍药组和北美芍药组，其中北美芍药组仅有两种，分布在北美西部；芍药组系属内最大的组，为草本类型，分布在亚欧大陆，牡丹组为木本类型，为我国特有种。该属植物多具有鲜艳的花朵，其中牡丹花和芍药花分别被冠以“花王”和“花相”，都是中国栽培历史悠久的传统名花，素有“花中二绝”的美誉。因其花色富丽，花型妩媚，被广泛应用于园林和庭院栽种。

染色体核型分析是细胞分类学的重要指标，对于研究植物的起源和进化、物种之间的亲缘关系以及种间杂种鉴定等都很有价值。植物染色体制片是进行核型分析、带型分析和染色体原位杂交等细胞遗传学研究的基础。近年来随着细胞遗传学研究在植物分类和育种中的应用，染色体制片技术尤为重要。芍药染色体属于大型染色体，长度约10～20μm，染色体基数为5。在芍药属的三个组里，牡丹组所有种的染色体数目均为二倍体(2n＝2x＝10)，芍药组内存在着二倍体(2n＝2x＝10)和四倍体(2n＝4x＝20)的分化。分析其染色体大小、数量、形态特征、核不对称系数，在一定范围能反映芍药属品种群演化和种间亲缘关系，可为杂交育种和新品种选育提供细胞学基础。

因此，如果能找到芍药属植物根尖染色体制片的最佳技术方法，有利于对芍药属染色体进行深入研究，对芍药属植物的起源进化、品种分类、不同倍性品种杂交后代的倍性鉴定等研究也具有十分重要的理论和实践意义。

过去在芍药属植物染色体制片中，取材主要通过沙藏种子生根，由于种子纯合性较难保证，故无法取得准确的原种染色体信息。有些方法在植株上取新根，但预处理试剂多具有毒性，价格较贵或难获得，并且处理时间较长。常规解离阶段多用酶解法或用1mol/l盐酸在60℃处理，制片步骤复杂且需要特定条件。

中国专利申请201811625900.x提出了一种芍药染色体的全年制片方法，针对芍药全年范围内分生能力强的组织，均可实现成功的制片，而且还可以根据时间直接选取芍药不同分生组织或者间接通过对芍药不同器官进行处理后所获得的分生组织作为染色体制片材料，可获得较多分裂相、分散良好、清晰的染色体图像。但是该方法的取材范围较窄，只进行了芍药根尖染色体制片，该专利中的解离步骤与正常解离步骤相似，需在55～65℃下进行，制片条件要求较高，整个步骤过程用时较长，并且在常规根尖染色体制片的过程中细胞壁和细胞质对制片结果的影响较大，而且在高温酸性条件下，良好的分裂相数量少且染色体易断裂分解，影响核型分析结果。

技术实现要素：

本发明为了克服上述技术问题，提供了一种适合大田生长的芍药属植物根尖染色体的制片方法，不仅操作简单方便，制片成本低廉，用时较短而且得出的染色体分散均匀，背景干净，易于观察。

解决上述技术问题的技术方案如下：

一种芍药属植物根尖染色体制片的方法，包括以下步骤：

(1)取材：取大田中生长健壮的芍药属植物实生苗的白色根尖，置于盛有清水的容器中，作为制片的材料备用；取材是在上午9点到11点挖取实生苗；

白色根尖为1～1.5cm。

(2)预处理：将制片的材料清洗干净，放入对二氯苯饱和水溶液中，在0～4℃预处理3.5h；为了达到最好的效果，取材后到预处理步骤不超过2h。

(3)固定：将预处理后的材料用蒸馏水漂洗3次，吸干水分，置于新配制的卡诺固定液中，在0～4℃固定22～24h；

(4)解离：将固定后的材料用蒸馏水漂洗3次，吸干水分，放入无水乙醇与37％盐酸体积比为3:1的解离液中，室温下解离6～8min；

(5)低渗：将解离后的材料用蒸馏水漂洗3次，吸干水分，再放入蒸馏水中低渗20～30min；

(6)染色：将低渗后的材料置于载玻片上，取根尖前端2mm呈现出乳白色的部分，解剖刀将取下的根尖沿纵向切割成两部分，用吸水纸吸干根尖周围的水分，滴入1滴改良型卡宝品红染色剂，染色6～8min；

(7)压片：盖上盖玻片，吸除材料周围多余的染色剂，用带橡皮头的铅笔轻压盖玻片，使组织成为一薄层，用铅笔的橡皮头在盖玻片上轻轻敲击，使细胞分散。

(8)镜检：将步骤(7)得到的压片置于motic显微镜下观察，选择染色体分散、清晰的细胞进行显微照相，以便进行核型分析。

本发明的有益效果是：

本发明制片技术成本低廉，简单方便，取材于大田中的芍药和牡丹的实生苗，大大扩大芍药属染色体制片的取材范围；解离采用无水乙醇与37％盐酸体积比为3:1的解离液在室温下解离6～8min，一方面降低了制片方法所需的条件，更便于制片过程的进行；另一方面适当地提升了盐酸浓度，不仅降低了细胞壁对制片结果的影响，同时也防止在高温酸性条件下，染色体的断裂分解；解离后置于蒸馏水中低渗20～30min，使得染色体分散良好，背景干净，计数方便。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1为实施例1的芍药‘西施粉’的制片的材料；

图2为实施例1的芍药‘西施粉’的100倍的光学显微镜镜检图像；

图3为实施例2的牡丹‘凤丹’的制片的材料；

图4为实施例2的牡丹‘凤丹’的100倍的光学显微镜镜检图像；

图5为实施例3的牡丹‘花王’的40倍的光学显微镜镜检图像；

图6为实施例3的牡丹‘花王’的100倍的光学显微镜镜检图像；

图7-8为对比例1的芍药‘西施粉’的40倍光学显微镜镜检图像；

图9为对比例2的芍药植株秋季萌发新根的根尖染色体63倍光学显微镜镜检图像；

图10为对比例3的芍药植株早春萌动新根的根尖染色体63倍光学显微镜镜检图像(预处理时间6h，解离时间5min，染色时间3min)；

图11为对比例4的芍药植株早春萌动新根的根尖染色体63倍光学显微镜镜检图像(预处理时间8h，解离时间10min，染色时间5min)；

图12为对比例5的芍药植株早春萌动新根的根尖染色体63倍光学显微镜镜检图像(预处理时间10h，解离时间5min，染色时间5min)。

具体实施方式

实施例1：

(1)取材：2019年9月下旬上午9～11时挖取大田中生长健壮的芍药‘西施粉’实生苗秋季萌发新根的白色根尖1～1.5cm(由图1所示)，放入装有清水的容器带回实验室，距下一步处理时间不得超过2小时。

(2)预处理：将取下的根尖清洗干净，放入对二氯苯饱和水溶液中，在0～4℃冷藏条件下预处理3.5h。

(3)固定：将预处理后的根尖用蒸馏水漂洗3次，吸干水分，置于新配制的卡诺固定液(无水乙醇∶冰醋酸＝3：1)在0～4℃冷藏条件固定22～24h。

(4)解离：将固定后的根尖用蒸馏水漂洗3次，吸干水分，放入无水乙醇与37％盐酸体积比为3:1的解离液中室温下解离6～8min。

(5)低渗：将解离后的根尖用蒸馏水漂洗3次，吸干水分，再放入蒸馏水中低渗20～30min。

(6)染色：将低渗后的根尖置于载玻片上，取根尖前端大约2mm呈现出乳白色的部分(分生区)，解剖刀将取下的根尖沿纵向切割成两部分，用吸水纸吸干根尖周围的水分，滴入1滴改良的卡宝品红染色剂，染色6～8min。

(7)压片：盖上盖玻片，吸除材料周围多余的染色剂，用带橡皮头的铅笔轻压盖玻片(不要使盖玻片移动)，使组织成为一薄层，用铅笔的橡皮头在盖玻片上轻轻敲击，使细胞分散。

(8)镜检：将压片置于motic显微镜下观察，选择染色体分散、清晰的细胞进行显微照相，以便进行核型分析，结果见图2。

光学显微镜检测效果表明：100倍镜检，细胞壁被分解，细胞质分散，染色体分散良好，背景干净，计数方便，可用作核型分析。

本实施例成功观察并统计出了芍药‘西施粉’的染色体数目2n＝10。

实施例2：

(1)取材：2019年9月下旬上午9～11时挖取大田中生长健壮的牡丹‘凤丹’实生苗秋季萌发新根的白色根尖1～1.5cm(由图3所示)，放入装有清水的容器带回实验室，距下一步处理时间不得超过2小时。

(2)预处理：将取下的根尖清洗干净，放入对二氯苯饱和水溶液中，在0～4℃冷藏条件下预处理3.5h。

(3)固定：将预处理后的根尖用蒸馏水漂洗3次，吸干水分，置于新配制的卡诺固定液(无水乙醇∶冰醋酸＝3：1)在0～4℃冷藏条件固定22～24h。

(4)解离：将固定后的根尖用蒸馏水漂洗3次，吸干水分，放入无水乙醇与37％盐酸体积比为3:1的解离液中室温下解离6～8min。

(5)低渗：将解离后的根尖用蒸馏水漂洗3次，吸干水分，再放入蒸馏水中低渗20～30min。

(6)染色：将低渗后的根尖置于载玻片上，取根尖前端大约2mm呈现出乳白色的部分(分生区)，解剖刀将取下的根尖沿纵向切割成两部分，用吸水纸吸干根尖周围的水分，滴入1滴改良的卡宝品红染色剂，染色6～8min。

(7)压片：盖上盖玻片，吸除材料周围多余的染色剂，用带橡皮头的铅笔轻压盖玻片(不要使盖玻片移动)，使组织成为一薄层，用铅笔的橡皮头在盖玻片上轻轻敲击，使细胞分散。

(8)镜检：将压片置于motic显微镜下观察，选择染色体分散、清晰的细胞进行显微照相，以便进行核型分析。结果见图4。

光学显微镜检测效果表明：100倍镜检，细胞壁被分解，细胞质分散，染色体分散良好，背景干净，计数方便，可用作核型分析。

本实施例成功观察并统计出了牡丹‘凤丹’的染色体数目2n＝10。

实施例3：

(1)取材：2019年9月下旬上午9～11时挖取大田中生长健壮的牡丹‘花王’实生苗秋季萌发新根的白色根尖1～1.5cm，放入装有清水的容器带回实验室，距下一步处理时间不得超过2小时。

(2)预处理：将取下的根尖清洗干净，放入对二氯苯饱和水溶液中，在0～4℃冷藏条件下预处理3.5h。

(3)固定：将预处理后的根尖用蒸馏水漂洗3次，吸干水分，置于新配制的卡诺固定液(无水乙醇∶冰醋酸＝3：1)在0～4℃冷藏条件固定22～24h。

(4)解离：将固定后的根尖用蒸馏水漂洗3次，吸干水分，放入无水乙醇与37％盐酸体积比为3:1的解离液中室温下解离6～8min。

(5)低渗：将解离后的根尖用蒸馏水漂洗3次，吸干水分，再放入蒸馏水中低渗20～30min。

(6)染色：将低渗后的根尖置于载玻片上，取根尖前端大约2mm呈现出乳白色的部分(分生区)，解剖刀将取下的根尖沿纵向切割成两部分，用吸水纸吸干根尖周围的水分，滴入1滴改良的卡宝品红染色剂，染色6～8min。

(7)压片：盖上盖玻片，吸除材料周围多余的染色剂，用带橡皮头的铅笔轻压盖玻片(不要使盖玻片移动)，使组织成为一薄层，用铅笔的橡皮头在盖玻片上轻轻敲击，使细胞分散。

(8)镜检：将压片置于motic显微镜下观察，选择染色体分散、清晰的细胞进行显微照相，以便进行核型分析。结果见图5、图6。

光学显微镜检测效果表明：由40倍镜检(图5)和100倍镜检(图6)可见，细胞壁被分解，细胞质分散，染色体分散良好，计数方便，背景干净,可用作核型分析。

本实施例成功观察并统计出了牡丹‘花王’的染色体数目2n＝10。

对比例1：

与实施例1相比，区别在于：解离液及其处理温度不同，也没有低渗步骤，具体如下：

(1)取材：2019年9月下旬上午9～11时挖取大田中生长健壮的芍药‘西施粉’实生苗秋季萌发新根的白色根尖1～1.5cm，放入装有清水的容器带回实验室，距下一步处理时间不得超过2小时。

(2)预处理：将取下的根尖清洗干净，放入对二氯苯饱和水溶液中，在0～4℃冷藏条件下预处理3.5h。

(3)固定：将预处理后的根尖用蒸馏水漂洗3次，吸干水分，置于新配制的卡诺固定液(无水乙醇∶冰醋酸＝3：1)在0～4℃冷藏条件固定22～24h。

(4)解离：将固定后的根尖用蒸馏水漂洗3次，吸干水分，放入无水乙醇与37％盐酸体积比为3:1的解离液中室温下解离6～8min。

(5)染色：将解离后的根尖置于载玻片上，取根尖前端大约2mm呈现出乳白色的部分(分生区)，解剖刀将取下的根尖沿纵向切割成两部分，用吸水纸吸干根尖周围的水分，滴入1滴改良的卡宝品红染色剂，染色6～8min。

(6)压片：盖上盖玻片，吸除材料周围多余的染色剂，用带橡皮头的铅笔轻压盖玻片(不要使盖玻片移动)，使组织成为一薄层，用铅笔的橡皮头在盖玻片上轻轻敲击，使细胞分散。

(7)镜检：将压片置于motic显微镜下观察，选择染色体分散、清晰的细胞进行显微照相，以便进行核型分析。结果见图7和图8。

光学显微镜检测效果表明：40倍镜检，由图7可见，有大量细胞壁存在，细胞堆积不分散，由图8可见，有大量细胞质残存，染色体聚集成团并断裂分解，无法计数，不可用作核型分析。

对比例2：

采用中国专利申请201811625900.x的实施例1的方法进行制片。光学显微镜检测效果如图9所示，图9表明：63倍镜检，染色体清晰可见，长度适合，染色效果好，细胞分散均匀，可计数，且可用做核型分析。经计数，中国芍药品种染色体2n＝10。

该方法虽与本发明制片的材料相同，均为9月～11月芍药植株秋季萌发的新根的根尖，但其取材不涉及牡丹组，制作成本明显高于本发明方法，实验用时也比本发明方法长。

对比例3：

早春萌动新根的根尖染色体制片，与对比例2相比，其区别在于，预处理的时间，酸解的时间等参数不同，具体包括：

1)取材料：于2017年3月中旬早上9:00～11:00，在北京林业大学国家花卉工程技术研究中心小汤山基地芍药种质资源圃挖出中国芍药品种植株，取得早春已萌动的肉质根上幼嫩根系的根尖1～2cm。

2)预处理：将取得的根尖材料置于装有饱和对二氯苯溶液的离心管中，低温(4℃)预处理6h后，待固定使用。

3)固定：将预处理后的材料从离心管取出，用蒸馏水清洗3遍，再将材料置于滤纸上吸干水分，最后转移至装有卡诺固定液的离心管中，在4℃条件下固定24h以上。固定后不立即使用的材料转移至70％乙醇溶液中保存备用。

4)解离：将固定后的材料用蒸馏水清洗三遍，滤纸吸干水分，转移至装有1mol/l的盐酸溶液的离心管中，在恒温水浴锅中60℃下解离5min后，立即用蒸馏水清洗材料三遍，滤纸吸干水分，待用。

5)染色制片：将解离后的材料进行常规压片法制片。用解剖针在载玻片上截取根尖顶端乳白色的部位2～3mm压片，并用解剖针捣碎，加卡宝品红溶液1～2滴，再将其搅拌均匀，染色3min后，盖上盖玻片，用滤纸夹住玻片，再用解剖针的另一头轻轻的砸盖玻片，使细胞和染色体分布均匀。待镜检用。

光学显微镜检测效果表明(图10)：63倍镜检，染色体长度过长，染色效果较差，细胞未完全解离开，分散不均匀，不可计数。

对比例4：

早春萌动新根的根尖染色体制片，具体过程与对比例2类似，区别在于：用饱和对二氯苯溶液预处理根尖材料的时间为8h。

光学显微镜检测效果表明(图11)：63倍镜检，细胞分散均匀，解离效果较好，但是染色体长度仍较长，计数较困难，不可用做核型分析。

对比例5：

早春萌动新根的根尖染色体制片，具体过程与对比例1类似，区别在于：在恒温水浴锅中60℃下解离时间控制为5min。

光学显微镜检测效果表明(图12)：63倍镜检，染色效果较差，细胞未完全解离开，分散不均匀，不可计数，不可用做核型分析。

由图10～12可以看出，对比例2、3、4、5的方法制片，与本发明方法相比，本发明方法明显降低了细胞壁和细胞质对实验结果的影响，分裂相背景更清晰。

从实施例1～3和对比例1～5的结果可以看出，在芍药和牡丹的根尖染色体制片过程中，用无水乙醇与37％盐酸体积比为3:1的解离液在室温下解离6～8min，适当地提升了盐酸浓度，不仅降低了细胞壁和细胞质对实验结果的影响，同时也防止在高温酸性条件下，染色体的断裂分解；解离后置于蒸馏水中低渗20～30min，使得染色体分散良好，背景干净，计数方便。

本发明提供的芍药属植物根尖染色体的制片技术，不仅适用于芍药根尖，同时也适用于牡丹根尖，操作简单方便，制片成本低廉，用时较短而且得出的染色体分散均匀，背景干净，易于观察，可用于后期核型分析、染色体原位杂交等技术，有利于对芍药属植物的染色体进行深入研究，对芍药属植物的起源进化、品种分类、不同倍性品种杂交子代的倍性鉴定等研究也具有十分重要的理论和实践意义。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质上对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。