本发明属于肉制品加工领域，具体涉及一种利用模拟体外消化提取广式腊肠中酚类物质的方法。
背景技术：
广式腊肠是我国一种传统的猪肉制品，其口感清淡，口味清甜，拥有色泽明亮、芳香醇厚等优点。由于其油脂含量高，在加工和储藏过程中容易发生脂肪和蛋白质的过氧化，造成产品品质的劣变。
由于传统抗氧化剂安全性的问题，人们开始将专注力转向天然植物提取物。许多植物提取物富含多酚等活性成分，可以有效调控肉制品的氧化，同时可以赋予产品一定的抗氧化活性。
在评价植物酚类物质与肉类成分的相互作用时，往往需要检测植物酚类物质在加工肉制品的含量。然而由于酚类物质容易与蛋白质发生相互作用，在对富含多酚的肉制品中酚类物质提取中往往存在提取不完全的问题，使得研究者对酚类物质在产品中的含量难以准确把握。
目前人们主要借助甲醇、丙酮等有机溶剂从植物提取物中分离酚类物质，然后再进行分析。然而，由于酚类物质容易与肉制品中蛋白质发生相互作用，常规的有机溶剂萃取法很难高效地分离与蛋白质结合的酚类物质，致使人们对富含多酚的蛋白制品中酚类物质的含量评判带来偏差。
因此，探索一种可以高效提取肉制品中的酚类物质且对环境负担较小的方法符合当下研究需求。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种利用模拟体外消化提取广式腊肠中酚类物质的方法，该方法利用胃蛋白酶溶液，能有效地提高广式腊肠中酚类物质的提取率。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：一种利用模拟体外消化提取广式腊肠中酚类物质的方法，包括以下步骤：
(1)样品前处理：选取富含酚类物质的腊肠样品，粉碎，加入水和模拟胃液后进行均质处理；
(2)体外消化：向均质处理后样品中加入胃蛋白酶液，进行水浴消化，得消化液；
(3)酚类物质的回收：向消化液中加入乙醇终止消化反应，过滤，回收滤液中的乙醇，将回收乙醇后的沉淀物用甲醇溶解，即得酚类物质提取液；
(4)酚类物质含量检测：对酚类物质提取液中的总酚、总黄酮和总花青素的含量进行定量分析。
在上述利用模拟体外消化提取广式腊肠中酚类物质的方法中：
优选的，所述酚类物质为植物酚类物质，如桑椹多酚、玫瑰多酚等，这些多酚可以采用现有的方法制备获得，也可以通过市售获得。这些酚类物质通常作为调控肉制品氧化的物质加入广式腊肠中，可以赋予产品一定的抗氧化活性。
优选的，步骤(1)中所述水为蒸馏水，所述蒸馏水与所述腊肠样品的用量关系为3～5ml：1g。
优选的，步骤(1)中所述模拟胃液由hcl和nacl组成，其中hcl的浓度为0.1～0.5mol/l，nacl的浓度为6～10g/l，所述模拟胃液用所述hcl调节ph值为1.0～3.5。
更佳的，步骤(1)中所述模拟胃液由hcl和nacl组成，其中hcl的浓度为0.4mol/l，nacl的浓度为8g/l，所述模拟胃液用所述hcl调节ph值为1.2。
优选的，所述模拟胃液与所述腊肠样品的用量关系为3～5ml：1g。
优选的，步骤(1)中均质处理时，转速为8000～10000rpm，均质时间为0.5～2min。
更佳的，步骤(1)中均质处理时，转速为10000rpm，均质时间为1min。
优选的，步骤(2)中所述胃蛋白酶液的体积为所述均质处理后样品总体积的3～5倍，所述胃蛋白酶液通过将胃蛋白酶溶于hcl和nacl的混合溶液中获得，其中所述胃蛋白酶的浓度为1200～3000u/l，所述hcl和nacl的混合溶液中hcl的浓度为0.01～0.05mol/l，nacl的浓度为0.1～0.5g/l，所述hcl和nacl的混合溶液的ph值用所述hcl调至1.0～3.5。
更佳的，步骤(2)中所述胃蛋白酶液的体积为所述均质处理后样品总体积的4倍，所述胃蛋白酶液通过将胃蛋白酶溶于hcl和nacl的混合溶液中获得，其中所述胃蛋白酶的浓度为1200u/l，所述hcl和nacl的混合溶液中hcl的浓度为0.02mol/l，nacl的浓度为0.4g/l，所述hcl和nacl的混合溶液的ph值用所述hcl调至1.2。
优选的，步骤(2)中水浴消化时，水浴温度为36～38℃，水浴时间为3～5h。
更佳的，步骤(2)中水浴消化时，水浴温度为37℃，水浴时间为4h。
优选的，步骤(3)中乙醇的用量为消化液总体积的3～5倍，所述乙醇的体积百分含量为75％～95％。
更佳的，步骤(3)中乙醇的用量为消化液总体积的4倍，所述乙醇的体积百分含量为95％。
优选的，步骤(3)中采用旋转蒸发仪回收滤液中的乙醇，其中旋转蒸发仪的温度为58～62℃。
更佳的，步骤(3)中采用旋转蒸发仪回收滤液中的乙醇，其中旋转蒸发仪的温度为60℃。
优选的，步骤(4)中利用福林酚法、ph示差法、分光光度法分别对酚类物质提取液中总酚、总黄酮和总花青素的含量进行定量分析。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明利用模拟体外消化提取广式腊肠中酚类物质的方法，能有效分离与蛋白质组分结合的酚类物质，实现肉制品中的酚类物质的高效提取。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式作进一步说明。
实施例1
本实施例通过模拟体外消化的方法提取广式腊肠中酚类物质，主要包括以下步骤：
(1)样品前处理：取10g富含多酚的腊肠样品剁碎，加入50ml蒸馏水和50ml模拟胃液(0.4mhcl+8g/lnacl,ph用hcl调至1.2)后进行均质(10000rpm，1min)处理；
(2)体外消化：向上述腊肠前处理样品体系中加入50ml胃蛋白酶液(1200u/l,溶于0.02mhcl,0.4g/lnacl,ph用hcl调至1.2)，置于37℃水浴锅中进行水浴消化4h；
(3)酚类物质的回收：向上述消化液中加入50ml95％的乙醇终止消化反应，用纱布过滤后，滤液用旋转蒸发仪旋蒸至乙醇全部回收。残渣用甲醇溶解，即得多酚提取液。
(4)酚类物质含量的检测
为了便于进行对比，本实施例腊肠中的酚类物质采用添加的方式加入，加入的是桑椹多酚，桑椹多酚的添加量为1％，所使用的桑椹多酚中活性成分分别为：总酚含量438.242±35.366mggae/g，总花青素含量76.091±18.376mgc3ge/g，总黄酮含量9.007±1.045mgqe/g。
经体外模拟消化后，提取液分别采用福林酚法、aoacph示差法、分光比色法分析成品腊肠中总酚、花青素、黄酮的含量，得到总酚含量为316.955±39.245mggae/g，总花青素含量为3.785±0.836mgc3ge/g，总黄酮含量为0.012±0.003mgqe/g。
实施例2
本实施例通过酸性甲醇法提取广式腊肠中酚类物质，具体过程如下：
(1)样品前处理：称取10g样品，加入50ml酸性甲醇(甲醇：浓盐酸＝85:15，v/v)，旋涡震荡；
(2)超声提取酚类物质：将上述样品体系置于超声机中浸提60min，重复三次；
(3)酚类物质的回收：将上述样品体系用纱布过滤后，滤液用旋转蒸发仪旋蒸至溶剂全部回收。残渣用甲醇溶解，即得多酚提取液。
(4)酚类物质含量的检测
本实施例腊肠中的桑椹多酚的添加量为1％，所使用的桑椹多酚中活性成分分别为：总酚含量438.242±35.366mggae/g，总花青素含量76.091±18.376mgc3ge/g，总黄酮含量9.007±1.045mgqe/g(添加方式及添加量同实施例1)。
经酸性甲醇提取后，提取液分别采用福林酚法、aoacph示差法、分光比色法分析成品腊肠中总酚、花青素、黄酮的含量，得到总酚含量为184.152±64.455mggae/g，总花青素含量为6.763±1.484mgc3ge/g，总黄酮含量为0.077±0.029mgqe/g。
实施例3
本实施例通过甲醇-丙酮-水混合液方法提取广式腊肠中酚类物质，具体过程如下：
(1)样品前处理：称取10g样品，加入50ml甲醇-丙酮-水混合液(7:7:6,v/v/v)，旋涡震荡；
(2)超声提取酚类物质：将上述样品体系置于超声机中浸提60min，重复三次；
(3)酚类物质的回收：将上述样品体系用纱布过滤后，滤液用旋转蒸发仪旋蒸至溶剂全部回收。残渣用甲醇溶解，即得多酚提取液。
(4)酚类物质含量的检测
本实施例中腊肠的桑椹多酚添加量为1％，所使用的桑椹多酚中活性成分分别为：总酚含量438.242±35.366mggae/g，总花青素含量76.091±18.376mgc3ge/g，总黄酮含量9.007±1.045mgqe/g(添加方式及添加量同实施例1)。
经甲醇-丙酮-水混合液提取后，提取液分别采用福林酚法、aoacph示差法、分光比色法分析成品腊肠中总酚、花青素、黄酮的含量，得到总酚含量为107.258±13.488mggae/g，总花青素含量为5.316±1.300mgc3ge/g，总黄酮含量为0.035±0.018mgqe/g。
实施例4
本实施例通过丙酮-水混合液提取广式腊肠中酚类物质，具体过程如下：
(1)样品前处理：称取10g样品，加入50ml丙酮-水混合液(1:1，v/v)，旋涡震荡；
(2)超声提取酚类物质：将上述样品体系置于超声机中浸提60min，重复三次；
(3)酚类物质的回收：将上述样品体系用纱布过滤后，滤液用旋转蒸发仪旋蒸至溶剂全部回收。残渣用甲醇溶解，即得多酚提取液。
(4)酚类物质含量的检测
本实施例中腊肠的桑椹多酚添加量为1％，所使用的桑椹多酚中活性成分分别为：总酚含量438.242±35.366mggae/g，总花青素含量76.091±18.376mgc3ge/g，总黄酮含量9.007±1.045mgqe/g(添加方式及添加量同实施例1)。
经丙酮-水混合液提取后，提取液分别采用福林酚法、aoacph示差法、分光比色法分析成品腊肠中总酚、花青素、黄酮的含量，得到总酚含量为244.455±134.058mggae/g，总花青素含量为4.175±3.616mgc3ge/g，总黄酮含量为0.017±0.005mgqe/g。
实施例5
本实施例通过分步提取法，即游离酚和结合酚分别提取广式腊肠中酚类物质，具体过程如下：
(1)样品前处理：称取10g样品，加入50ml乙醇-水(乙醇：水＝80：20，v/v)，旋涡震荡；
(2)游离酚提取：将上述样品体系置于超声机中浸提60min，离心(10000rpm，1min)，收集上述样品的上清液，沉淀重复提取三次，即得游离酚；
(3)酚类物质的回收：上述样品的沉淀继续用20ml氢氧化钠溶液(2m)利用氮吹仪氮吹1h(25℃)，然后用3m盐酸调ph至3.0，再加入50ml乙酸乙酯，离心(10000rpm，15min)；
(4)结合酚回收：取8ml上清液，利用氮吹仪吹干溶剂，沉淀用2ml乙醇-水(乙醇：水＝80：20，v/v)溶解，即得结合酚。
(5)酚类物质含量的检测
本实施例中腊肠的桑椹多酚添加量为1％，所使用的桑椹多酚中活性成分分别为：总酚含量438.242±35.366mggae/g，总花青素含量76.091±18.376mgc3ge/g，总黄酮含量9.007±1.045mgqe/g(添加方式及添加量同实施例1)。
经分部提取法提取后，提取液分别采用福林酚法、aoacph示差法、分光比色法分析成品腊肠中总酚、花青素、黄酮的含量，将两部分酚类提取液中的检测到的酚类物质合并，得到总酚含量为282.848±32.047mggae/g，总花青素含量为2.811±1.342mgc3ge/g，总黄酮含量为0.086±0.030mgqe/g。
表1实施例1-5中不同提取方法得到的酚类物质提取液中总酚、总花青素和总黄酮含量对比
从表1中的结果中可以看出，通过本发明中的模拟体外消化方式得到的多酚提取液中酚类物质含
量是最高的，花青素和黄酮类物质均属于酚类物质，也就是说凭借模拟体外消化途径可以有效提高酚类物质的提取率，较其他方法而言更适合于富含多酚类物质的肉制品中酚类物质的评价。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，其中本申请实施例中以桑椹多酚为代表说明了酚类物质的提取过程，采用其他的酚类物质如玫瑰多酚等，也可以得到类似的提取结果，都包含在本发明的保护范围之内。