一种苹果和苹果汁中展青霉素的快速检测方法与流程

本发明涉及检测相关技术领域，尤其涉及一种苹果和苹果汁中展青霉素的快速检测方法。

背景技术：

展青霉素，又称棒曲霉素，是一种由曲霉和青霉等真菌产生的一种次级代谢产物。毒理学试验表明，展青霉素具有影响生育、致癌和免疫等毒理作用，同时也是一种神经毒素，具有致畸性，对人体的危害很大，导致呼吸和泌尿等系统的损害，使人神经麻痹、肺水肿、肾功能衰竭。展青霉素首先在霉烂苹果和苹果汁中发现，广泛存在于各种霉变水果中。展青霉素易溶于水、氯仿、丙酮、乙醇及乙酸乙酯等有机溶剂。当前检测方法主要有高效液相色谱法和高效液相色谱串联质谱法。

现有技术中gb5009.185-2016对于苹果，苹果汁使用不同的提取和净化方式，分别采用水和乙酸乙酯或乙腈提取，提取液经混合型阴离子交换柱或净化柱净化，净化液氮气吹干后用乙酸溶液复溶，使用紫外检测器或串联质谱检测器检测。现有技术中的方法中提供了两种不同的试样净化方式：混合型离子交换柱法和净化柱法。两种不同净化处理方式对应不同的提取过程，步骤繁琐，耗时较长，不易操作，详细步骤流程图如图1和图2所示。

现有技术中检测方法的缺点如下所述：

1、现有方法试样需经过提取、过夜、旋转蒸发、复溶、过净化柱、氮吹和复溶之后才能上仪器检测。前处理步骤繁琐、耗费时间较长，苹果试样需要2天1夜，果汁样品也需要3～4小时；

2、现有方法前处理成本较高：使用混合型阴离子交换柱或净化柱净化，增加了检测成本；

3、现有方法使用大量有机试剂，不够环保。

有鉴于上述的缺陷，本设计人积极加以研究创新，以期创设一种苹果和苹果汁中展青霉素的快速检测方法，使其更具有产业上的利用价值。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种苹果和苹果汁中展青霉素的快速检测方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种苹果和苹果汁中展青霉素的快速检测方法，包括以下步骤：

步骤s1：称取5g样品到50ml离心管中，加入60:40；v/v的乙酸乙酯-正己烷10ml，再加入7.5g无水na2so4，旋紧盖子震荡后超声10min，涡旋10min，2000rpm离心；

步骤s2：取步骤s1中2.5ml上层有机相至另一离心管中，40℃条件下用氮气缓缓吹至近干；

步骤s3：加ph＝4的水至步骤s2的离心管中，定容至1.0ml，使得残留物完全溶解；

步骤s4：取步骤s3中900μl的样液至进样瓶，加入100ng/ml内标溶液100μl，涡旋30s，滤膜过滤后，进行液相色谱串联质谱检测；

其中，

液相色谱系统：agilent1200；

质谱/质谱系统：appliedbiosystemsapi4500串联质谱仪；

色谱柱：lunac18(2),5μm,150x2mm；

流动相：b：甲醇+0.05％乙酸，a：水+0.05％乙酸+0.05％乙酸铵；

进样体积：40μl；

流速:0.6ml/min；

柱温箱温度：35℃；

电离源：电喷雾；

电离模式：负；

喷雾电压：-4500v；

源温:550℃；

运行时间：11min。

作为本发明的进一步改进，所述步骤s4中液相梯度：

初始：流动相a：90％，流动相b：10％，流速:0.6ml/min；

5min：流动相a：50％，流动相b：50％，流速:0.6ml/min；

7min：流动相a：50％，流动相b：50％，流速:0.6ml/min；

7.1min：流动相a：10％，流动相b：90％，流速:0.6ml/min；

8min：流动相a：10％，流动相b：90％，流速:0.6ml/min；

8.1min：流动相a：90％，流动相b：10％，流速:0.6ml/min；

9min：流动相a：90％，流动相b：10％，流速:0.6ml/min。

作为本发明的进一步改进，步骤s4中内标溶液为：patulin¹³c。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

1、本发明所有样品统一使用乙酸乙酯-正己烷(60:40；v/v)超声提取，优化提取方法，相比单独乙酸乙酯振荡提取，提高了提取效率；

2、本发明不使用果胶酶，大大节省了前处理时间；

3、本发明不需要使用交换柱或净化柱净化，降低了检测成本；

4、本发明仅使用10ml提取试剂，较现有方法(≥20ml)更为环保，优化流程，减少试剂使用。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1是现有技术中离子交换柱方法的检测操作流程示意图；

图2是现有技术中净化柱方法的检测操作流程示意图；

图3是本发明一种苹果和苹果汁中展青霉素的快速检测方法的检测操作流程示意图；

图4是本发明第一实施例中对照标准品和苹果样品中展青霉素出峰情况的示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例

如图3所示，

一种苹果和苹果汁中展青霉素的快速检测方法，包括以下步骤：

步骤s1：称取5g样品到50ml离心管中，加入60:40；v/v的乙酸乙酯-正己烷10ml，再加入7.5g无水na2so4，旋紧盖子震荡后超声10min，涡旋10min，2000rpm离心；

步骤s2：取步骤s1中2.5ml上层有机相至另一离心管中，40℃条件下用氮气缓缓吹至近干；

步骤s3：加ph＝4的水至步骤s2的离心管中，定容至1.0ml，使得残留物完全溶解；

步骤s4：取步骤s3中900μl的样液至进样瓶，加入100ng/ml内标溶液100μl，涡旋30s，滤膜过滤后，进行液相色谱串联质谱检测；

其中，

液相色谱系统：agilent1200；

质谱/质谱系统：appliedbiosystemsapi4500串联质谱仪；

色谱柱：lunac18(2)，5μm，150x2mm；

流动相：b：甲醇+0.05％乙酸，a：水+0.05％乙酸+0.05％乙酸铵；

进样体积：40μl；

流速:0.6ml/min；

柱温箱温度：35℃；

电离源：电喷雾；

电离模式：负；

喷雾电压：-4500v；

源温:550℃；

运行时间：11min。

优选的，所述步骤s4中液相梯度：

初始：流动相a：90％，流动相b：10％，流速:0.6ml/min；

5min：流动相a：50％，流动相b：50％，流速:0.6ml/min；

7min：流动相a：50％，流动相b：50％，流速:0.6ml/min；

7.1min：流动相a：10％，流动相b：90％，流速:0.6ml/min；

8min：流动相a：10％，流动相b：90％，流速:0.6ml/min；

8.1min：流动相a：90％，流动相b：10％，流速:0.6ml/min；

9min：流动相a：90％，流动相b：10％，流速:0.6ml/min。

优选的，步骤s4中内标溶液为：patulin¹³c。

本发明第一实施例：

1)试剂

去离子水、甲醇、正己烷、乙酸、乙酸乙酯、乙酸铵和无水硫酸钠。

2)原理

均质过的样品在硫酸钠存在的条件下经乙酸乙酯/正己烷(60:40v/v)提取，提取液吹干后加入适当溶剂复溶，进行液相色谱-质谱/质谱测定。

3)样品提取

称取5g样品到50μl离心管中，加入10μl乙酸乙酯-正己烷(60:40；v/v)，再加入7.5g无水na2so4，旋紧盖子震荡数秒后超声10min，涡旋10min，2000rpm离心。取2.5μl上层有机相至另一离心管中，40℃条件下氮吹至近干。加入1μl水(ph4.0)，使得残留物完全溶解。取900μl样液至进样瓶，加入100μl内标溶液(patulin¹³c；100ng/μl)，上液相色谱串联质谱检测，详细步骤流程图如图3所示。

4)仪器

液相色谱系统：agilent1200；

质谱/质谱系统：appliedbiosystemsapi4500串联质谱仪；

色谱柱：lunac18(2),5μm,150x2mm；

流动相：b:甲醇+0.05％乙酸，a:水+0.05％乙酸+0.05％乙酸铵；

液相梯度：

进样体积：40μl；

流速:0.6μl/min；

柱温箱温度：35℃；

电离源：电喷雾；

电离模式：负；

喷雾电压：-4500v；

源温:550℃；

运行时间：11分钟；

多反监测参数：

应用此方法已多次参加国际性能力验证(fapas1653，fapas1655，fapas1657，fapas1659，fapas1665，fapas1667)，覆盖了苹果和苹果汁，并均取得满意结果。

对照标准品和阴性样品中展青霉素出峰情况分别如图4中所示：在保留时间(2.4min)处，展青霉素和展青霉素同位素在对照标准品中均出现良好的色谱峰；而在阴性样品中，展青霉素同位素得到了很好的色谱峰，展青霉素未出峰，表明在该样品中确实未检测到展青霉素。

本发明一种苹果和苹果汁中展青霉素的快速检测方法：

1、本发明所有样品统一使用乙酸乙酯-正己烷(60:40；v/v)超声提取，优化提取方法，相比单独乙酸乙酯振荡提取，提高了提取效率；

2、本发明不使用果胶酶，大大节省了前处理时间；

3、本发明不需要使用交换柱或净化柱净化，降低了检测成本；

4、本发明仅使用10ml提取试剂，较现有方法(≥20ml)更为环保，优化流程，减少试剂使用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。