一种基于场效应晶体管的核酸微损伤检测方法和生物传感器

1.本发明属于生物电子以及多功能传感领域，具体涉及一种基于场效应晶体管的核酸微损伤检测方法和生物传感器。


背景技术：

2.内源性代谢物、环境中的致癌物质以及具有基因毒性的化疗药物等都会攻击dna，从而造成损伤。这些dna损伤会导致基因突变和染色体损伤，进而可能使生命体发生癌变和肿瘤增生。然而，为了限制基因的不稳定性，在生命体细胞内存在dna损伤响应途径和修复蛋白，以清除和减轻dna损伤。未修复的dna损伤可能成为促进细胞消亡的途径，如细胞凋亡和坏死，这些途径也被认为是抑制肿瘤的有效途径。通过研究细胞如何通过细胞死亡取代dna修复，科研人员利用基因毒性化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用来治疗癌症。然而，化疗药物并不具备特异性识别癌细胞的作用，在杀死癌细胞的同时，会通过体内循环扩散到生命体的正常细胞内，对正常细胞造成损伤，在造成正常细胞死亡的同时，也会存在微量的dna损伤潜伏在细胞内，长时间的累积下，会诱发基因突变，增加二次患癌的风险。例如，研究人员利用全基因组测序方法，分析了放化疗抗癌疗法对转移肿瘤的影响，找到了放化疗治疗方式在细胞dna上留下的突变特征，还发现铂类等常用化疗药物会大幅加快dna突变频率，最高能达到自然突变频率的100倍，甚至是1000倍。他们发现虽然这些药物在大部分时候会杀死癌细胞或者正常细胞，也会损伤部分细胞，转化成突变。化疗药物会导致癌细胞和健康细胞出现基因突变(pich o,et al.nat.gene.,2019,51,1732-1740.)。多项研究表明，化疗引起的dna突变，是治疗之后给患者造成长期不良影响的因素之一(alexandrov l b,et al.nature,2013,500,415-421；kucab j e,et al.cell,2019,177,821-836.)。因此，能够在体外高灵敏的检测dna的微损伤，对物质生物安全性评估、癌症早期预警、药物筛选等都具有非常重要的科学意义。
3.目前，体外dna损伤的检测方法有很多种，例如文献(shu,x.,et al.angew.chem.int.ed engl.2016,55,14246-14249)以及文献(wu,j.j.am.chem.soc.2018,140,9783-9787)均需要利用全基因组方法，并且需要体内蛋白酶的辅助，检测方法复杂。又如文献(zirkin,s.,et al.j.am.chem.soc.2014,136,7771-7776)利用荧光成像方法，而且需要dna损伤密度较高才能够检测到，因此需要的检测仪器复杂、不方便、且方法灵敏度低。再如，中科院物理研究所王鹏业研究员利用原子力显微镜(afm)和磁镊研究了抗癌药物顺铂对单个dna分子结构的影响；在顺铂浓度为77μm和770μm条件下研究了顺铂对dna的影响。基于afm成像和单分子拉伸两方面的实验结果，提出一个顺铂导致的dna变软-成环-缩短-凝聚模型来解释观察到的dna凝聚过程(hou x m,et al.nucleic acids research,2009,37,1400-1410.)。然而这些方法需要高剂量的损伤剂和高富集的核酸才能保证信号放大程度，这使得它们不适合在体内检测浓度为pm量级(gietema,j.a.,et al.lancet 2000,355,1075-1076.)的超低剂量药物的低发生率dna损伤，因此亟待发展能够检测到pm量级致基因损伤药物(如顺铂)对dna的损伤的高灵敏方法。
4.场效应晶体管(fet)是一类三端器件，可以通过改变栅极电压调控半导体层中载流子浓度，从而改变源漏电极之间的电流。这种调控模式赋予了晶体管器件独特的信号转换及放大能力。因此，场效应晶体管有望成为核酸分子损伤高灵敏检测的平台。利用场效应晶体管接枝核酸分子作为探针分子，能够赋予晶体管器件以生物功能，人们已经报道了多种类型的fet生物传感器(knopfmacher o,et al.nat.commun.,2014,5,2954；nakatsuka n,et al.science,2018,362,319-324.)。


技术实现要素：

5.本发明提供一种核酸损伤检测方法，其包括如下步骤：利用场效应晶体管检测核酸分子损伤。优选地，所述核酸分子可以为单链dna、双链dna、单链rna或双链rna。例如，所述核酸分子的长度至少为2bp。优选地，所述损伤为微损伤。
6.根据本发明，所述核酸损伤检测方法包括如下步骤：将存储有溶液的储液池固定在负载有核酸分子的场效应晶体管上，检测时向储液池中加入能够损伤核酸的物质，使其与场效应晶体管中的核酸分子相作用，引发核酸分子构型发生变化，进而引起场效应晶体管的电流变化。
7.其中，所述核酸分子可以通过共价结合、物理吸附、化学吸附等作用固定在场效应晶体管中。示例性地，可以在场效应晶体管中设置核酸分子连接位点层。其中，所述核酸分子连接位点层的制备方法可以选用本领域已知方法，例如真空热蒸镀、氧化还原化学反应方法。比如，所述核酸分子连接位点层为金属纳米层，例如金纳米层。
8.根据本发明，所述储液池中的溶液为核酸分子损伤检测提供液体环境。例如所述能够损伤核酸的物质可以为内源性代谢物、环境中的致癌物质或具有基因毒性的化疗药物基因毒性药物；比如为铂类药物。示例性地，所述储液池中的溶液为顺铂溶液、卡铂溶液或奥沙利铂溶液。例如，所述储液池可以设置(例如紧密贴合)在所述场效应晶体管的半导体层之上。其中，所述半导体层的制备方法可以选用本领域已知方法，例如采用滴涂、旋涂、提拉、蒸镀或喷墨打印的方法。
9.根据本发明，所述核酸分子连接位点层设置在所述半导体层的上方。优选地，所述储液池具有侧壁和由侧壁围成的顶面和底面，所述底面由核酸分子连接位点层封闭，所述顶面不封口。其中，所述侧壁的材质为pdms(聚二甲基硅氧烷)。
10.根据本发明，所述场效应晶体管还包括栅极、源电极、漏电极和绝缘层。例如，所述场效应晶体管可以选自底栅底接触、底栅顶接触、顶栅顶接触和顶栅底接触四种结构中的任意一种。
11.根据本发明的一个实施方式，当所述场效应晶体管为底栅顶接触结构或顶栅顶接触结构时，所述储液池设置在具有核酸分子连接位点层的半导体层之上。其中，所述场效应晶体管的导电沟道位于靠近栅极的电介质的半导体层内，其中，源电极和漏电极呈对称设置在所述具有核酸分子连接位点层的半导体层表面。
12.例如，当所述场效应晶体管为底栅顶接触结构时，所述半导体层、绝缘层和栅极依次连接。优选地，所述半导体层的材质为具有场效应传输性能的无机半导体材料或有机半导体材料；例如，所述无机半导体材料可以为碳纳米管、石墨烯、mos2和ges中的至少一种；例如，所述有机半导体材料可以为小分子材料和聚合物材料中的至少一种；其中，所述小分
子材料可以为并五苯、ndi(2od)(4tbuph)-dtym2、ndi3hu-dtym2和酞菁铜中的至少一种；其中，所述聚合物材料可以为p3ht、pbttt、pdtt3t和pdpp2t-tt-od中的至少一种，优选为pdpp2t-tt-od或pdtt3t。优选地，所述绝缘层的材质可以选自无机绝缘材料或有机绝缘材料：例如，所述无机绝缘材料为二氧化硅、三氧化二铝、二氧化锆和五氧化二钽中的至少一种，优选为二氧化硅；例如，所述有机绝缘材料为聚乙烯醇肉桂酸酯、聚乙烯醇(pva)、聚对二甲苯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚二甲基硅氧烷、透明氟树脂、聚苯乙烯和聚乙烯基苯酚中的至少一种。优选地，所述栅极、源电极和漏电极的材质均可以选自金属、陶瓷、合金、金属氧化物、重掺杂半导体和导电聚合物中的至少一种；例如，所述金属为金、银、铝、镍和铜中的至少一种，优选为金；例如，所述陶瓷为硅片；例如，所述合金为镁银合金、铂金合金、锡箔合金、铝箔合金、锰镍铜合金、镍钛铝合金、镍锰铁合金、镍铁合金和镍锌合金中的至少一种；例如，所述金属氧化物为氧化铟锡、二氧化锰和二氧化铅中的至少一种；例如，所述重掺杂半导体为磷掺杂的硅、硼掺杂的硅和砷掺杂的硅中的至少一种，优选为硼掺杂的硅；例如，所述导电聚合物为聚苯胺、聚吡咯和聚噻吩中的至少一种。根据本发明的实施方案，所述栅极为硼重掺杂的硅衬底。根据本发明的实施方案，所述源电极和漏电极的材质均可以为金。其中，所述栅极的厚度为10nm-1000μm，例如为1μm-100μm，示例性为30μm。其中，所述源电极和漏电极的厚度均可以为10nm-300nm，例如20-100nm，示例性为30nm。其中，所述绝缘层的厚度为1-1000nm，例如为10-500nm，示例性为50nm。
13.例如，当所述场效应晶体管为顶栅顶接触结构时，绝缘层为电解质溶液，其位于所述储液池内。其中，所述栅极与绝缘层连接。优选地，所述栅极选自金属电极，例如为ag/agcl电极、金、铂或钨电极。优选地，所述场效应晶体管还可以含有衬底，所述衬底与半导体层连接。其中，衬底可以选用本领域已知衬底，例如硅衬底。优选地，所述源电极、漏电极和半导体层均具有如当所述场效应晶体管为底栅顶接触结构时的含义。
14.优选地，所述场效应晶体管还包括电极保护层，所述电极保护层包覆在所述漏电极和源电极的上方，避免源电极和漏电极与储液池内的溶液直接接触。例如，所述电极保护层的材质为sio。其中，所述电极保护层的厚度可以为10-150nm，例如40-100nm，示例性为80nm。
15.根据本发明的另一个实施方式，当所述场效应晶体管为底栅底接触结构或顶栅底接触结构时，所述储液池设置在具有核酸分子连接位点层的半导体层上，所述源电极和漏电极对称设置在半导体层之下。
16.例如，当所述场效应晶体管为底栅底接触结构时，所述源电极和漏电极均位于绝缘层之上且与半导体层连接。其中，所述半导体层、源/漏电极、绝缘层和栅极顺次连接。优选地，所述源电极、漏电极、绝缘层和半导体层均具有如当所述场效应晶体管为底栅顶接触结构时的含义。
17.例如，当所述场效应晶体管为顶栅底接触结构时，绝缘层为电解质溶液，其位于所述储液池内。其中，所述栅极与绝缘层连接。优选地，所述栅极选自金属电极，例如为ag/agcl电极、金、铂或钨电极。优选地，所述场效应晶体管还可以含有衬底，所述衬底与半导体层连接。优选地，所述源电极和漏电极设置在衬底表面。其中，所述衬底可以选用本领域已知衬底，例如硅衬底。优选地，所述源电极、漏电极和半导体层均具有如当所述场效应晶体管为底栅顶接触结构时的含义。
18.根据本发明，所述栅极的制备方法可以选用本领域已知方法，例如选用真空热蒸镀、磁控溅射、转移、喷墨打印或等离子增加的化学气相沉积。
19.根据本发明，所述绝缘层的制备方法可以选用本领域已知方法，例如为旋涂、化学气相沉积、热氧化或热蒸镀。
20.根据本发明，所述半导体层的制备方法可以选用本领域已知方法，例如为滴涂、旋涂、提拉、蒸镀或喷墨打印。
21.根据本发明，所述源电极和漏电极的制备方法可以选用本领域已知方法，例如为真空热蒸镀、磁控溅射、转移、喷墨打印或等离子增加的化学气相沉积。
22.根据本发明，所述电极保护层的制备方法可以选用本领域已知方法，例如为真空热蒸镀。
23.根据本发明，所述储液池的制备方法为真空加热交联。
24.根据本发明，所述源电极和漏电极可以与信号检测系统连接。
25.根据本发明的实施方式，所述核酸分子损伤检测时，将场效应晶体管置于恒定栅压、恒定源电压和恒定漏电压条件下进行检测。例如，所述栅压为-4～-0.1v，示例性为-2v，所述源电压和漏电压均为-1.5～-0.1v，示例性为-1v。例如，所述能够损伤核酸的物质为铂类药物，优选为顺铂、卡铂或奥沙利铂。这三种铂药分子结构相似，与dna作用机理相似，它们能够与dna形成单臂或双臂加和物，铂药-dna加和物的形成破坏了dna的结构，导致dna损伤。
26.本发明还提供一种生物传感器，所述生物传感器包含上述场效应晶体管和设置在场效应晶体管上的上述储液池。优选地，所述储液池与场效应晶体管具有如上文所述的含义、位置关系和连接关系。
27.优选地，上述检测方法采用所述生物传感器进行核酸损伤检测。
28.本发明还提供上述生物传感器和/或上述场效应晶体管在核酸损伤检测中的应用，优选在核酸微损伤检测中的应用，更优选在体外核酸微损伤检测中的应用。
29.本发明的有益效果：
30.本发明提供的基于场效应晶体管的核酸损伤检测方法，能够直接原位检测外部刺激造成的核酸损伤，并且能够实时对检测信号进行输出，具有直接、快速的特点，省去了检测细胞内核酸损伤的细胞培养步骤。
31.本发明方法将场效应晶体管与核酸分子损伤检测结合起来，易于集成化、自动化、便携化，有望实现高灵敏度(能够检测到pm量级药物对核酸分子的损伤)、高通量、大规模、实时的核酸损伤快速检测。
32.本发明提供的含有场效应晶体管用于核酸损伤检测的生物传感器，其构建材料灵活多变，可以是有机材料、无机材料，构建方法和核酸连接方法简单易行，能够大大降低检测时间和成本。
附图说明
33.图1为实施例1提供的基于底栅顶接触结构的场效应晶体管的用于核酸损伤检测的生物传感器的结构示意图；
34.图2为实施例5提供的基于底栅底接触结构的场效应晶体管的用于核酸损伤检测
的生物传感器的结构示意图；
35.图3为实施例6提供的基于顶栅底接触结构的场效应晶体管的用于核酸损伤检测的生物传感器的结构示意图；
36.图4为实施例7提供的基于顶栅顶接触结构的场效应晶体管的用于核酸损伤检测的生物传感器的结构示意图；
37.附图标记：1为栅极，2为绝缘层，3为半导体层，4为源电极，5为漏电极，6为电极保护层，7为金纳米颗粒，8为核酸分子，9为微型储液池，10为衬底。
38.图5为实施例1-3中所用的半导体材料的分子式。
39.图6为实施例1方法检测到的由于顺铂引起的dna损伤的信号响应图。
40.图7为实施例1-2方法检测到的由于顺铂、卡铂、奥沙利铂引起的dna损伤的信号响应对比图。
41.图8为实施例1中dna损伤后dna构型变化的示意图。
具体实施方式
42.下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
43.除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
44.实施例1
45.如图1所示的基于场效应晶体管的生物传感器，其具有底栅顶接触结构。该生物传感器包括：由下至上依次为栅极1、绝缘层2、半导体层3、源电极4、漏电极5、电极保护层6和微型储液池9。源电极4和漏电极5设置在半导体层3的表面，半导体层3的表面固定金纳米颗粒7，由金纳米颗粒形成核酸分子连接位点层。金纳米颗粒7与核酸分子8连接。
46.微型储液池9具有侧壁和由侧壁围成的顶面和底面，底面由核酸分子连接位点层封闭，顶面不封闭，顶面具有半径为2mm的圆形开口；其中，侧壁的材质为pdms(聚二甲基硅氧烷)。微型储液池9紧密贴合、固定在设置在半导体层3上，场效应晶体管的导电沟道由位于靠近栅极的电介质的半导体层内，其中源电极4和漏电极5呈对称设置在具有核酸分子连接位点层的半导体层3表面。微型储液池9内存储含有顺铂的溶液。
47.电极保护层6包覆在源电极4和漏电极5的表面，用于防止源漏电极与微型储液池9内的溶液接触。
48.本实施例生物传感器的制备方法包括如下步骤：
49.1)构筑如图1所示的底栅顶接触结构的场效应晶体管，其中栅极是硼重掺硅衬底，绝缘层是硅衬底上厚50nm的二氧化硅。将栅极经二次水、乙醇、丙酮超声、冲洗、氮气吹干后，在之后在氧气环境中，进行氧等离子气体处理(功率80w，时间5min)，之后对栅极进行十八烷基三氯硅烷(ots)气相修饰，修饰在真空烘箱中进行，温度为120℃，时间为3h；
50.2)在步骤1)所得到的ots修饰的sio2绝缘层上旋涂pdpp2t-tt-od(其结构参见图5)溶液，其中pdpp2t-tt-od的浓度为10mg/ml，溶液中的溶剂为邻二氯苯，转速为4000rpm。旋涂得到pdpp2t-tt-od半导体层，半导体层的厚度为20nm，并在热台上165℃热处理15min；
51.3)步骤2)得到的半导体层上方，在真空度为7
×
10-4
pa的条件下以/s的速度在半导体层上蒸镀金，厚度为30nm，得到源电极和漏电极；
52.4)步骤3)得到的源电极和漏电极的上方，在真空度为4
×
10-4
pa的条件下以的速度在源电极和漏电极上分别蒸镀sio，蒸镀厚度为80nm，得到源电极和漏电极的保护层；
53.5)对步骤4)得到的未被源漏电极和源漏电极保护层覆盖住的半导体层上方，在真空度为7
×
10-4
pa的条件下以的速度在其上蒸镀金，蒸镀厚度为1.5nm，得到金纳米颗粒层，作为核酸分子连接位点层；
54.6)将步骤5)所得场效应晶体管器件在含有10μm双链dna的pbs溶液中浸泡1h，之后将上述器件利用pbs冲洗，氮气吹干，并将中间有半径为2mm的孔洞的材质为pdms微型储液池紧密贴合在场效应晶体管器件中的半导体层上，得到生物传感器。
55.采用本实施例提供的生物传感器对dna损伤进行检测，检测方法如下：
56.将生物传感器置于恒定栅压-2v和恒定源漏电压-1v下，通过移液枪将含有顺铂的溶液吸入或吸出到pdms微型储液池内，置于双链dna分子(核酸分子的长度至少为2bp)修饰的场效应晶体管导电沟道部分，检测顺铂溶液浓度从1pm到1μm逐渐递增时，观测到电流信号影响变化(如图6)，即顺铂与双链dna作用后能够引起双链dna构型变化(如图8所示)，使得带有负电荷的双链dna能够更加靠近导电沟道，导致晶体管电流增加；以及随着顺铂浓度的增加，传感器的电流也逐渐增加。可据此信号快速、准确地分辨双链dna是否被顺铂攻击产生损伤，且对1pm顺铂溶液即可快速产生(约1s内)信号响应。
57.实施例2
58.按照实施例1的检测方法，仅将储液池内的被检测溶液替换为含有卡铂或奥沙利铂的溶液。测试由卡铂和奥沙利铂引起的双链dna损伤，并将测试结果与实施例1中顺铂引起双链dna损伤测试结果对比(如图7)，发现奥沙利铂引起双链dna损伤小于卡铂引起的双链dna损伤，卡铂引起的双链dna损伤小于顺铂引起的双链dna损伤，说明上述得到的基于场效应晶体管的生物传感器能够对双链dna损伤产生响应，并且能够对双链dna损伤程度进行表征。
59.实施例3
60.按照实施例1中的方法，仅将步骤6)中接枝的双链dna替换为单链dna，利用上述方法所得生物传感器检测顺铂对单链dna造成的损伤，该器件表现出对顺铂造成的单链dna损伤的响应，所得结果与实施例1结果相似。
61.实施例4
62.按照实施例1中的方法，仅将步骤2)中的半导体pdpp2t-tt-od溶液替换为pdtt3t，利用上述方法所得生物传感器检测顺铂对双链dna造成的损伤，该器件表现出对顺铂造成的双链dna损伤的响应，所得结果与实施例1结果相似。
63.实施例5
64.如图2所示的生物传感器，其具有底栅底接触结构的场效应晶体管。与实施例1不同的是，源电极4和漏电极5称对称设置在绝缘层2的表面，半导体层3覆盖源电极4、漏电极5和绝缘层2；该传感器不含有电极保护层。
65.实施例6
66.如图3所示的生物传感器，其具有顶栅底接触结构的场效应晶体管。与实施例1不同的是，源电极4和漏电极5设置在衬底10的表面，半导体层3覆盖源电极4、漏电极5和衬底10。绝缘层2设置在微型储液池9内，为液态的电解质溶液，栅极1与绝缘层连接，栅极为ag/agcl电极；该传感器不含有电极保护层。
67.实施例7
68.如图4所示的生物传感器，其具有顶栅顶接触结构的场效应晶体管。与实施例6不同的是，半导体层3设置在衬底10的表面，源电极4和漏电极5对称设置在半导体层3的表面两侧，且源电极4和漏电极5上均包覆电极保护层6。
69.实施例5-7提供的生物传感器也能够用于检测核酸微损伤。
70.以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。