一种同时测定尿液中8种多环芳烃羟基代谢产物的方法与流程

本发明属于高效液相色谱技术领域，具体涉及一种同时测定尿液中8种多环芳烃羟基代谢产物的方法。

背景技术：

多环芳烃化合物(polycyclicaromatichydrocarbons,简称pahs)，是指由两个或两个以上苯环以一定规则排列的碳氢化合物，包括萘、菲、芘、芴等。接触高剂量pahs已严重危害到人群健康，可诱导机体发生膀胱癌、肺癌、皮肤癌等多种恶性疾病。pahs经呼吸道、消化道、皮肤等途径进入人体经肝脏代谢后，可生成多种羟基代谢产物以葡萄糖醛酸结合物的形式随尿液排出体外。目前常用的检测pahs的方法有化学滴定法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法，这些方法多用于环境介质、工业产品中pahs含量的检测，对于人体尿液样品中以葡萄糖醛酸结合状态存在的pahs羟基化合物检测多采用高效液相色谱分析，但是目前利用高效液相色谱分析过程中存在无法与其他成分有效分离的问题，导致检测结果不可靠。经过研究，是由于样品前处理方法以及所选流动相的切换程序不得当所导致的，因此建立一种同时测定尿液中8种多环芳烃羟基代谢产物的方法是实现准确反映人体pahs内暴露情况的基础。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的是提供一种同时测定尿液中8种多环芳烃羟基代谢产物的方法解决目前高效液相色谱分析过程中无法与其他成分有效分离的问题，以实现准确反映人体pahs内暴露情况。

为达到以上目的，本发明采用的技术方案是：一种同时测定尿液中8种多环芳烃羟基代谢产物的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)对尿液样品进行生物酶水解和固相萃取的预先处理；

(2)取步骤(1)中上清液，利用高效液相色谱仪进行处理：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶不锈钢柱，以色谱级甲醇和水作为流动相，采用相应的切换程序进行梯度洗脱的液相色谱条件；

(3)配置pahs羟基代谢产物1-羟基萘、2-羟基萘、1-羟基菲、2-羟基菲、2-羟基芴、9-羟基芴、1-羟基芘、3-羟基苯的混合标准母液，利用多通道荧光检测器进行检测，绘制标准曲线；

(4)取步骤(2)中样品利用多通道荧光检测器进行检测，并根据所述标准曲线进行定量分析。

进一步的，所述步骤(2)中色谱柱粒径为5μm，尺寸为250×4.6mm度。

进一步的，所述步骤(2)中流动相梯度洗脱程序为：0≤t≤14min，60％甲醇，40％超纯水；14<t≤21min，85％甲醇，15％超纯水；21<t≤35min，100％甲醇；35<t≤40min，60％甲醇，40％超纯水。

进一步的，所述步骤(2)中高效液相色谱检测进样量为10ul。

进一步的，所述步骤(2)中高效液相色谱检测流速为0.6ml/min。

进一步的，所述步骤(2)中高效液相色谱检测柱温为19-21℃。

进一步的，所述步骤(3)中多通道可调荧光检测器荧光激发(ex)和发射波长(em)切换程序为：0min，227/355nm；15.8min，272/336nm；20.5min，254/369nm；23.0min，239/392nm；28.0min，371/428nm。

本发明的效果在于，对尿液样品进行前处理，破坏葡萄糖醛酸结合状态，并采用相应梯度洗脱程序，可使8种pahs羟基代谢产物得到有效分离，节约了时间成本；选用甲醇和水作为流动相并采用相应的洗脱程序，既保证了良好的分离效果，又经济实惠安全环保。总体来说，该检测方法有着分离效率高、分析速度快、检测灵敏度高的优点，可准确反映人体8种pahs羟基代谢产物内暴露情况。

附图说明

图1为本发明所述方法的流程示意图；

图2为具体实施例中混标母液pahs羟基代谢产物色谱标准曲线图。

图3为具体实施例中尿样pahs羟基代谢产物色谱图。

具体实施方式

为使本发明解决的技术问题、采用的技术方案和达到的技术效果更加清楚，下面将结合附图对本发明实施例的技术方案作进一步的详细描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，均属于本发明保护的范围。

参阅图1，图1为本发明所述方法的流程示意图。本发明所提供的一种同时测定尿液中8种多环芳烃羟基代谢产物的方法包括以下步骤：

步骤101：对尿液样品进行生物酶水解和固相萃取的预先处理。

具体包括：将待测尿样依次加入0.1mol/l盐酸、0.5mol/l醋酸钠-醋酸缓冲溶液以及5ulβ-葡聚糖醛酸酶，恒温水浴过夜后使用spf固相萃取小柱进行萃取。依次经活化、淋洗、洗脱等程序，获得洗脱液，洗脱液经氮气吹干，用纯甲醇复溶后离心取上清液进行高效液相色谱分析。

步骤102：取步骤(1)中上清液，利用高效液相色谱仪进行处理：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶不锈钢柱，以色谱级甲醇和水作为流动相，采用相应的切换程序进行梯度洗脱的液相色谱条件。

具体的，高效液相色谱仪所选固定相为十八烷基硅烷键合硅胶不锈钢柱(粒径为5μm，250×4.6mm)，流动相为超纯水和色谱级甲醇，进样量为10ul，流速为0.6ml/min，柱温控制在19-21℃的范围。流动相切换程序为：0≤t≤14min，60％甲醇，40％超纯水；14<t≤21min，85％甲醇，15％超纯水；21<t≤35min，100％甲醇；35<t≤40min，60％甲醇，40％超纯水。经前期大量实验探索后发现，在上述色谱条件下8种pahs羟基代谢产物可以获得有效分离。

步骤103：配置pahs羟基代谢产物1-羟基萘、2-羟基萘、1-羟基菲、2-羟基菲、2-羟基芴、9-羟基芴、1-羟基芘、3-羟基苯的混合标准母液，利用多通道荧光检测器进行检测，绘制标准曲线。

具体的，采用waters2475多通道可调荧光检测器进行检测，荧光激发(ex)和发射波长(em)切换程序为：0min，ex为227nm,em为355nm；15.8min，ex为272nm,em为336nm；20.5min，ex为254，em为369nm；23.0min，ex为239，em为392nm；28.0min，ex为371，em为428nm。

步骤104：取步骤(2)中样品利用多通道荧光检测器进行检测，并根据所述标准曲线进行定量分析。

下面结合具体的实施例对本专利提供的方法进行说明。在本实施例中，仪器采用waters-2695高效液相色谱仪，检测器采用waters2475多通道可调荧光检测器。

1.对尿液样品进行生物酶水解和固相萃取的预先处理

生物酶水解：将2ml待测尿样、0.25ml的盐酸(0.1mol/l)、0.75ml的醋酸钠一醋酸缓冲溶液(0.5mol/l，ph＝5)和5ulβ-葡聚糖醛酸酶，加入玻璃离心管中混匀后37℃恒温水浴过夜，次日取出后，2000r/min转速离心30min，取2ml上清液过固相萃取小柱。

固相萃取：将spe小柱安装到固相萃取装置上，依次加入5ml甲醇和5ml超纯水活化spe小柱；待超纯水即将完全通过柱子前加入制备好的样品上清液2ml；然后，依次用10ml超纯水和10ml30％(体积比)甲醇水溶液淋洗柱子；淋洗后，真空抽干柱子去除水；最后，用2ml甲醇洗脱小柱.洗脱液45℃氮吹下吹干，残渣用400μl甲醇复溶，13000r/s离心10min，取上清液180μl入样品瓶待上机。

2.高效液相色谱仪处理

具体的，色谱柱选用粒径为十八烷基硅烷键合硅胶不锈钢柱(5μm，250×4.6mm)。

液相色谱条件：流动相：超纯水和色谱级甲醇。采用梯度洗脱方式，切换程序为：0≤t≤14min，60％甲醇，40％超纯水；14<t≤21min，85％甲醇，15％超纯水；21<t≤35min，100％甲醇；35<t≤40min，60％甲醇，40％超纯水。检测流速为0.6ml/min。柱温控制为20℃。进样量为10ul。

3.配置混合标准母液，利用多通道荧光检测器进行检测，绘制标准曲线：

称取适量单体标样，甲醇溶解，配制pahs羟基代谢产物各单体初级母液，然后用甲醇稀释各初级母液，配制次级母液，取适量各单体次级母液，甲醇定容，配制混标母液1.7ml，将混标母液用甲醇稀释2,4,6,8,16倍得5个不同浓度的梯度混标溶液。取各浓度梯度混标溶液10μl。

采用waters2475多通道可调荧光检测器进行检测：具体的，荧光激发(ex)和发射波长(em)切换程序为：0min，227/355nm；15.8min，272/336nm；20.5min，254/369nm；23.0min，239/392nm；28.0min，371/428nm。

将混合标准母液在上述色谱条件下进样分析，混标母液pahs羟基代谢产物色谱标准曲线图(见图2)，1-羟基萘、2-羟基萘、1-羟基菲、2-羟基菲、2-羟基芴、9-羟基芴、1-羟基芘、3-羟基苯并[a]芘保留时间依次15.476、14.395、21.765、20.665、19.566、16.658、25.318、31.492min。

以各pahs羟基代谢产物峰面积为横坐标，浓度为纵坐标，绘制标准曲线，线性方程和相关系数见表1，各标样标准曲线线性良好，r>0.999。

4.取步骤2中样品利用多通道荧光检测器进行检测，并根据所述标准曲线进行定量分析。

具体的，将上述步骤2中获取的上清液样品瓶插入到样品盘合适的位置，打开仓门放入样品盘，待基线平稳后进样分析。

还需要说明的是，在利用多通道荧光检测器对样品进行检测时，荧光激发(ex)和发射波长(em)切换程序为：0min，227/355nm；15.8min，272/336nm；20.5min，254/369nm；23.0min，239/392nm；28.0min，371/428nm。

参阅图3，图3为具体实施例中尿样pahs羟基代谢产物色谱图。根据图2中标准曲线的回归方程可计算得出人体尿液中8种pahs羟基代谢产物的含量。

为验证上述实施例的可行性和准确性，在上述色谱条件下，进行精密度试验。试验采用混标母液稀释2倍的溶液，连续进样6次，测定结果表2所示。由表2可得检出结果rsd小于2％，因此仪器稳定性良好，本申请提供的高效液相检测方法可行性高。

表1pahs羟基代谢产物线性方程与相关系数

表2pahs羟基代谢产物精密度试验结果(单位：μg/l)

区别于现有技术，本发明提供的一种同时测定尿液中8种多环芳烃羟基代谢产物的方法对尿液样品进行前处理，破坏葡萄糖醛酸结合状态，并采用相应梯度洗脱程序，可使8种pahs羟基代谢产物得到有效分离，节约了时间成本；选用甲醇和水作为流动相并采用相应的洗脱程序，既保证了良好的分离效果，又经济实惠安全环保。总体来说，该检测方法有着分离效率高、分析速度快、检测灵敏度高的优点，可准确反映人体8种pahs羟基代谢产物内暴露情况。

本领域技术人员应该明白，本发明所述方法并不限于具体实施方式中所述的实施例，上面的具体描述只是为了解释本发明的目的，并非用于限制本发明。本领域技术人员根据本发明的技术方案得出其他的实施方式，同样属于本发明的技术创新范围，本发明的保护范围由权利要求及其等同物限定。