本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及2019新型冠状病毒(sars-cov-2)igg抗体检测试剂盒。
背景技术：
：冠状病毒是自然界广泛存在的一个大型病毒家族，因其形态在电镜下观察似王冠而得名，主要引起呼吸系统疾病。冠状病毒属于单股正链rna病毒，其遗传物质是所有rna病毒中最大的，分为α、β、γ和δ四个属。2019新型冠状病毒(sars-cov-2)是一种新的冠状病毒，2020年2月11日，世界卫生组织将新型冠状病毒感染的肺炎命名为“covid-19”。与此同时，国际病毒分类委员会将新型冠状病毒命名为“sars-cov-2”。2019新型冠状病毒是一类呈球形、表面有突起、电镜下观察形似皇冠的病毒，病毒基因为连续线性单链rna，直径在75-160nm。2019-ncov是目前发现的可以感染人类的冠状病毒科中的第七个成员。其他6个成员分别为：hcov229e、hcovnl63、hcovoc43、hcovhku1、sars-cov和mers-cov。新冠病毒感染人的潜伏期1-14天，多为3-7天。病毒主要经呼吸道飞沫和密切接触传播；患者出现发热、乏力和干咳，并逐渐出现呼吸困难等严重症状。病毒感染人后，机体会发生针对病毒的免疫反应并产生抗体。igm抗体产生较快(5-7天)，数周或数月后逐渐消失；igg抗体产生较晚(10-14天)，亲和力更高，可持续多年甚至终生存在。目前研究发现，虽然sars-cov-2与sars-cov、mers-cov同属于β-cov，其基因组与sars-cov基因组表现出较高的序列同源性。但是，sars-cov-2基因组在两个核心位置具有高度变异性。一个是orf1ab基因中的沉默变异，另一个为氨基酸orf8中的多态性。据预测，orf8中的突变会导致其两个变异体(即orf8-l和orf8-s)，导致蛋白质的结构异常。在对sars-cov-2进行结构分析时发现，其刺突糖蛋白及核衣壳蛋白发生突变。这提示sars-cov-2具有独特的基因组特征及结构特征，需要对其做进一步的研究。2019新型冠状病毒传染性强，能引起病毒性肺炎，在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。为了控制疫情，大家都在积极研发相应的诊断试剂盒，但由于新型冠状病毒(sars-cov-2)的发现时间短，对其基因组特征、结构特征、发病机理等方面还在不断的研究当中。目前的新型冠状病毒抗体检测试剂盒，也因研发周期短，检测试剂盒的灵敏度和特异性都有待提高。技术实现要素：为解决上述问题，本发明第一方面，提供一种灵敏度高、特异性好的2019新型冠状病毒igg抗体检测试剂盒。该试剂盒包括：包被在固相载体上的两种抗原和可检测标记物标记的鼠抗人igg抗体；所述两种抗原为新型冠状病毒rbd抗原和新型冠状病毒n抗原。本发明中，“新型冠状病毒rbd抗原”为包括新型冠状病毒s1蛋白受体结合域的抗原表位的抗原，可以是天然抗原，也可以是通过常规基因工程技术表达后得到的重组抗原；“新型冠状病毒n抗原”为包括新型冠状病毒n蛋白的抗原表位的抗原，可以是天然抗原，也可以是通过常规基因工程技术表达后得到的重组抗原。新型冠状病毒(sars-cov-2)的氨基酸序列及其编码核酸序列已在ncbi上公开，其基因组排列顺序为5'-复制酶多聚糖蛋白(orf1/ab)-结构蛋白[刺突糖蛋白(spike，s)-小包膜糖蛋白(envelope，e)-膜糖蛋白(membrane，m)-核衣壳蛋白(nucleocapsid，n)]-3'。在冠状病毒中有一个关键的s蛋白(棘突蛋白，spikeprotein)，包含2个亚单位：s1和s2。s1能够促进病毒与宿主细胞受体的结合，其含有一个重要的c端rbd结构域，正是这个区域负责和受体结合。新型冠状病毒的重组抗原已有许多市售产品，例如四川迈克生物新材料技术有限公司生产的重组新型冠状病毒rbd抗原(货号为xcl1831)，四川迈克生物新材料技术有限公司生产的重组新型冠状病毒n抗原(货号为xcl1829)，北京孚博生物科技有限公司生产的重组新型冠状病毒s1抗原(货号为fb2019his)。作为优选，本发明的2019新型冠状病毒igg抗体检测试剂盒中，新型冠状病毒rbd抗原和新型冠状病毒n抗原的质量比为18:1～18:3；更优选地，新型冠状病毒rbd抗原和新型冠状病毒n抗原的质量比为9:1。本发明中，“固相载体”可以是聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚乙烯基甲苯、聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、尼龙、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、乳胶、脂质体、明胶、琼脂糖、纤维素、玻璃、金属、陶瓷或磁性体等材质形成的珠粒(beads)、微孔板、试管、棒、膜(membrane)或试验片等形状的固相载体。优选地，固相载体为磁微粒，更优选地，固相载体为链霉亲和素磁微粒，即，链酶亲和素蛋白包被的磁性微粒。本发明中，“可检测标记物”是指一类可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电、光学或化学等手段进行检测的物质，例如酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和elisa中常用的其它酶)、荧光染料(例如，荧光素、德克萨斯红、罗丹明和绿色荧光蛋白等，参见例如molecularprobes,eugene,oreg.,usa)、放射性标记物(例如，3h、125i、35s、14c或32p)、发光物质(例如，化学发光物质，进一步地，例如吖啶(例如吖啶-9-羧酰胺)、啡啶(phenanthridinium)、二氧杂环丁烷(dioxetanes)和鲁米诺等)。作为优选，“可检测标记物”为化学发光物质。“化学发光物质”是指一类经催化剂的催化和/或氧化剂的氧化,形成一激发态的中间体,当这种激发态中间体回到稳定的基态时,同时发射出光子的物质。作为优选，“可检测标记物”为“吖啶类化学发光物质”。“吖啶类化学发光物质”是指吖啶酯及其衍生物、吖啶磺酰胺化学发光物质和光泽精，其适用于化学发光免疫分析系统。在碱性h2o2溶液中，分子受到过氧化氢离子进攻时，生成不稳定的二氧乙烷，此二氧乙烷分解为co2和电子激发态的n-甲基吖啶酮，当其回到基态时发出光子。优选地，“可检测标记物”为“吖啶酯衍生物”。吖啶酯衍生物”在化学发光免疫分析领域中是众所周知的，例如中国专利201510090045.7中记载了用于化学发光免疫分析的吖啶酯衍生物及其制备方法；law等(novelpoly-substitutedarylacridiniumestersandtheiruseinimmunoassay,jbioluminchemilumin.1989jul；4(1):88-98)合成了一系列可用于免疫分析的吖啶酯类似物。进一步地，本发明的2019新型冠状病毒igg抗体检测试剂盒中，还包括新型冠状病毒igg抗体校准品。“校准品”，即校准物质，指在校准函数中用作独立变量值的参考物质，在体外诊断临床检测中起到检测和监督检验结果具有准确性和一致性的作用。“校准品”可以包括阳性校准品(含有新型冠状病毒igg抗体)和阴性校准品(不含新型冠状病毒igg抗体)。进一步地，本发明的2019新型冠状病毒igg抗体检测试剂盒中，包被在固相载体上的两种抗原通过以下方法得到：(1)将两种抗原分别包被在固相载体上，然后再进行混合，即得；或(2)将两种抗原混合后，再包被在固相载体上，即得。本发明的另一个方面，提供一种新型冠状病毒igg抗体检测试剂盒的制备方法，包括包被在固相载体上的两种抗原的制备方法，包括以下内容：(1)将新型冠状病毒rbd抗原和新型冠状病毒n抗原分别进行生物素修饰，分别得到生物素化的新型冠状病毒rbd抗原和生物素化的新型冠状病毒n抗原；(2)将生物素化的新型冠状病毒rbd抗原和生物素化的新型冠状病毒n抗原分别包被在链霉亲和素磁微粒上，分别得到包被有新型冠状病毒rbd抗原的磁微粒和包被有新型冠状病毒n抗原的磁微粒；(3)将包被有新型冠状病毒rbd抗原的磁微粒和包被有新型冠状病毒n抗原的磁微粒进行混合，即得。进一步地，上述步骤(2)中，按照5μg/mg的包被量，即按照每mg链霉亲和素磁微粒包被5μg抗原的比例，将生物素化的新型冠状病毒rbd抗原和生物素化的新型冠状病毒n抗原分别包被在链霉亲和素磁微粒上。进一步地，上述步骤(3)中，按照新型冠状病毒rbd抗原和新型冠状病毒n抗原的质量比为18:1～18:3的比例，将包被有新型冠状病毒rbd抗原的磁微粒和包被有新型冠状病毒n抗原的磁微粒进行混合。作为进一步优选，按照新型冠状病毒rbd抗原和新型冠状病毒n抗原的质量比为9:1的比例，对两种包被抗原的磁微粒进行混合。本发明的2019新型冠状病毒igg抗体检测试剂盒中，包被在固相载体上的两种抗原保存在本领域熟知的基础缓冲液中。“基础缓冲液”是指一类具有盐平衡、ph缓冲、保护活性成分结构和生物学特性的溶液，包括ph值调节剂、无机盐离子、表面活性剂和稳定剂成分。其中，“ph值调节剂”，是指能在一定程度上抵消、减轻外加强酸或强碱对溶液酸碱度的影响，从而保持溶液的ph值相对稳定的试剂，选自磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、醋酸缓冲液、tris缓冲液和hepes缓冲液中的一种或多种。“无机盐离子”是指一类维持溶液的离子浓度处于相对稳定平衡状态的试剂，选自氯化钠、氯化钾中的一种或多种。“表面活性剂”是指加入少量能够使其溶液体系的界面状态发生明显变化的物质，其具有固定的亲水亲油基团且在溶液的表面能够定向排列，选自tween、span、曲拉通、emulgen系列表面活性剂(如吐温20、吐温40和曲拉通100)以及月桂酸聚乙二醇甘油酯、阴离子烷基多苷、十二烷基二甲基甜菜碱、3aramt1、sho62c和amphitol中的一种或几种。“稳定剂”是指一类其稳定作用的试剂，选自甘露醇、牛血清白蛋白、丙三醇、海藻糖、酪蛋白、聚乙烯吡咯烷酮和羟乙基淀粉中的一种或多种。本文中“新型冠状病毒”、“2019新型冠状病毒”、“sars-cov-2”、“2019-ncov”、“新冠病毒”可互换，均为被国际病毒分类委员会命名为“sars-cov-2”的新型冠状病毒。有益效果与现有技术相比，申请人意外地发现，在新型冠状病毒检测试剂盒中采用新型冠状病毒rbd抗原和新型冠状病毒n抗原这两种抗原进行新型冠状病毒igg抗体检测时，检测结果的灵敏度和特异性有很大提高。并且，申请人还意外地发现，当新型冠状病毒rbd抗原和新型冠状病毒n抗原按照特定的比例混合后，再进行igg抗体检测时，检测结果的灵敏度和特异性具有显著提升。具体实施方式下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。以下具体实施例中涉及的试剂成分均为市售产品，例如，磁微粒购自四川迈克生物新材料技术有限公司(货号：xcl1026)，新型冠状病毒rbd抗原购自四川迈克生物新材料技术有限公司(货号：xcl1831)，新型冠状病毒n抗原购自四川迈克生物新材料技术有限公司(货号：xcl1829)，鼠抗人igg抗体购自四川迈克生物新材料技术有限公司(货号：xcl1833)，新型冠状病毒s1抗原购自北京孚博生物科技有限公司(货号为fb2019his)，新型冠状病毒igg抗体标准品购自四川省临床检验中心。实施例12019新型冠状病毒igg抗体检测试剂盒及其制备方法2019新型冠状病毒igg检测试剂盒包括：包被在链霉亲和素磁微粒上的新型冠状病毒rbd抗原、包被在链霉亲和素磁微粒上的新型冠状病毒n抗原、吖啶酯标记的鼠抗人igg抗体、以及2019新型冠状病毒igg抗体校准品。该检测试剂盒中，包被在固相载体上的两种抗原通过以下方法得到：(1)将新型冠状病毒rbd抗原和新型冠状病毒n抗原分别进行生物素修饰，分别得到生物素化的新型冠状病毒rbd抗原和生物素化的新型冠状病毒n抗原；(2)将生物素化的新型冠状病毒rbd抗原和生物素化的新型冠状病毒n抗原分别包被在链霉亲和素磁微粒上，分别得到包被有新型冠状病毒rbd抗原的磁微粒和包被有新型冠状病毒n抗原的磁微粒；(3)将包被有新型冠状病毒rbd抗原的磁微粒和包被有新型冠状病毒n抗原的磁微粒进行混合，即得。实施例22019新型冠状病毒igg抗体检测试剂盒及其制备方法2019新型冠状病毒igg检测试剂盒包括：试剂r1、试剂r2和2019新型冠状病毒igg抗体校准品。其中，试剂r1中含有包被在链霉亲和素磁微粒上的新型冠状病毒rbd抗原和包被在链霉亲和素磁微粒上的新型冠状病毒n抗原；试剂r2中含有吖啶酯标记的鼠抗人igg抗体；试剂r1中还包括基础缓冲液。“基础缓冲液”是指一类具有盐平衡、ph缓冲、保护活性成分结构和生物学特性的溶液，本实施例以及后面对比例采用的基础缓冲液相同，均为本领域常规的组分，包括ph值调节剂、无机盐离子、表面活性剂和稳定剂组分。2019新型冠状病毒igg抗体检测试剂盒的制备方法如下：1.包被在链霉亲和素磁微粒上的新型冠状病毒抗原的制备：1.1生物素化新型冠状病毒rbd抗原的制备1)用0.02mpbs缓冲液对新型冠状病毒rbd抗原进行透析；透析完成后，用0.02mpbs将其稀释至0.5mg/ml；2)然后每毫克新型冠状病毒rbd抗原加入10mm/l的生物素酯3.33ul，室温下反应30min；3)反应完成后，加入1m的tris缓冲液至其终浓度为0.01m，终止反应，室温混匀反应10min，最后用0.02mpbs缓冲液透析12-36小时，取透析后的液体即得到biotin-新型冠状病毒rbd抗原。1.2生物素化新型冠状病毒n抗原的制备1)用0.02mpbs缓冲液对新型冠状病毒n抗原进行透析；透析完成后，用0.02mpbs将其稀释至1mg/ml；2)然后每毫克新型冠状病毒n抗原加入10mm/l的生物素酯3.33ul，室温下反应30min；3)反应完成后，加入1m的tris缓冲液至其终浓度为0.01m，终止反应，室温混匀反应10min，最后用0.02mpbs缓冲液透析12-36小时，取透析后的液体即得到biotin-新型冠状病毒n抗原。1.3将生物素化的新型冠状病毒rbd抗原包被在链霉亲和素磁微粒上1)取18ml链霉亲和素磁微粒悬浮液，磁分离去上清，用基础缓冲液清洗三次，然后用90ml基础缓冲液重悬；2)按照5μg/mg的包被量加入biotin-新型冠状病毒rbd抗原，室温下混匀反应30min，磁分离去上清，用基础缓冲液清洗一次后再重悬至90ml，然后加入封闭剂biotin-bsa，室温下混匀反应15min，磁分离去上清，用基础缓冲液清洗三次后重悬至900ml，即得到biotin-新型冠状病毒rbd抗原包被的链霉亲和素磁微粒。1.4将生物素化的新型冠状病毒n抗原包被在链霉亲和素磁微粒上1)取2ml链霉亲和素磁微粒悬浮液，磁分离去上清，用基础缓冲液清洗三次，然后用10ml基础缓冲液重悬；2)按照5μg/mg的包被量加入biotin-新型冠状病毒n抗原，室温下混匀反应30min，磁分离去上清，用基础缓冲液清洗一次后再重悬至10ml，然后加入封闭剂biotin-bsa，室温下混匀反应15min，磁分离去上清，用基础缓冲液清洗三次后重悬至100ml，即得到biotin-新型冠状病毒n抗原包被的链霉亲和素磁微粒。1.5混合磁微粒将新制备的biotin-新型冠状病毒rbd抗原磁微粒和biotin-新型冠状病毒n抗原磁微粒按9:1比例混合，得到混合的、两种包被在磁微粒上的新型冠状病毒抗原。2.吖啶酯标记的鼠抗人igg抗体的制备1)采用0.02mpbs缓冲液对鼠抗人抗体进行透析；2)吸取1mg透析后的鼠抗人抗体于适当容器中，以0.02mpbs稀释至终浓度为0.3mg/ml，加入2.5mmol/l吖啶酯20μl，立即涡旋混匀，避光条件下，室温置血液混匀仪上反应1小时；3)加入10mg/ml的赖氨酸溶液335μl，立即涡旋混匀，避光条件下，室温在血液混匀反应10min；4)反应完成后过脱盐柱，得到吖啶酯标记的鼠抗人igg抗体。3.2019新型冠状病毒igg抗体校准品制备：准备含有2019新型冠状病毒igg抗体的阳性校准品、以及不含有2019新型冠状病毒igg抗体的阴性校准品。2019新型冠状病毒igg抗体检测试剂盒的检测原理为：包被在磁微粒上的新型冠状病毒抗原与样本中的特异性igg抗体结合，形成免疫复合物，洗涤后加入吖啶酯标记的鼠抗人igg抗体。再次洗涤后加入底物液，发生化学发光反应，产生的发光信号值与样本中特异性igg抗体的含量呈正相关。实施例32019新型冠状病毒igg抗体检测试剂盒的性能考察对实施例2中的试剂盒进行性能考察，采用的检测仪器为迈克生物股份有限公司生产的i3000全自动化学发光免疫分析仪。1.试剂盒稳定性考察将实施例2中制备好的试剂盒分别于2℃-8℃冰箱和37℃水浴锅进行处理，用阴性校准品和阳性校准品检测试剂盒的热稳定性，检测结果如表1所示。表1阴性校准品(rlu)阳性校准品(rlu)2℃-8℃保存试剂盒732048237℃保存7天试剂盒5715577信号保留率78.1％76.1％从表1可以看出，将2019新型冠状病毒igg抗体检测试剂盒在37℃水浴处理7天(模拟2℃～8℃保存1年)，阳性校准品信号保留率为76.1％，满足临床需求。2.试剂盒批内精密度和批间精密度考察批内精密度考察选择企业精密性参考品(即，两个不同浓度的灭活样本)作为测定样本。每个样本使用同一批试剂盒重复测定10次。测定完后，分别计算测定结果的均值和标准差。按变异系数为标准差与均值得比值，计算每个测定样本的变异系数，检测结果如表2所示。表2从表2中可见，本发明试剂盒的批内变异系数均低于5％，满足临床需求。批间精密度考察选择企业精密性参考品作为测定样本。取三个批号的试剂盒，每个批次试剂盒重复测定样本10次。测定完后，分别计算30个测定结果的均值和标准差。按变异系数为标准差与均值得比值，计算变异系数。检测结果如表3所示。表3从表3中可见，本发明试剂盒的批间变异系数均小于6％，满足临床中批间变异系数低于10％的要求。3.试剂盒分析特异性采用实施例2中的2019新型冠状病毒igg抗体检测试剂盒，分别将hiv、hbv、hcv、hav、梅毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、结核杆菌、甲型流感、乙型流感的阳性血清作为样本进行检测。检测结果如表4所示。表4阳性阴性合计hiv阳性血清033hbv阳性044hcv阳性033hav阳性033tp阳性033肺炎支原体阳性066肺炎衣原体阳性055结核杆菌阳性033甲型流感阳性044乙型流感阳性022从表4中可以看出：本发明的检测试剂盒与hiv、hbv、hcv、hav、梅毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、结核杆菌、甲型流感、乙型流感的特异性抗体无交叉反应。4.试剂盒灵敏度和特异性将实施例2中的检测试剂盒，对372例临床样本(确诊的阳性血清62例、正常人血清310例)进行检测，检测结果见表5。表5表5中，灵敏度＝检测得到的阳性样本数/实际的阳性样本数＝58/62＝93.5％；特异性＝检测得到的阴性样本数/实际的阴性样本数＝308/310＝99.4％。此外，申请人采用购自北京义翘神州生物技术有限公司(sinobiological)的新型冠状病毒rbd抗原(货号40592-v05h)，替换实施例2中购自四川迈克生物新材料技术有限公司的新型冠状病毒rbd抗原，其他试剂原料及制备方法均与实施例2相同，按照实施例2的方法进行性能考察，各个性能结果与实施例3类似。对比例对比例1本对比例与实施例2相比，除了抗原只采用包被在链霉亲和素磁微粒上的新型冠状病毒rbd抗原外，其余成分及制备方法均与实施例2相同。将对比例1的检测试剂盒，对372例临床样本(确诊的阳性血清62例、正常人血清310例)进行检测，检测结果见表6。对比例2本对比例与实施例2相比，除了抗原只采用包被在链霉亲和素磁微粒上的新型冠状病毒n抗原外，其余成分及制备方法均与实施例2相同。将对比例2的检测试剂盒，对372例临床样本(确诊的阳性血清62例、正常人血清310例)进行检测，检测结果见表6。表6结合表5和表6的数据，通过对相同的临床样本进行检测，本发明的试剂盒在检测灵敏度和特异性方面均优于对比例1和对比例2的检测试剂盒。对比例3本对比例与实施例2相比，除了抗原只采用包被在链霉亲和素磁微粒上的新型冠状病毒s1抗原外(其中，新型冠状病毒s1抗原购自北京孚博生物科技有限公司)，其余成分及制备方法均与实施例2相同。将对比例3的检测试剂盒，对112例临床样本(确诊的阳性血清62例、正常人血清50例)进行检测，检测结果见表7。表7从表7可见，对比例3的试剂盒的检测灵敏度较低，其灵敏度还有待提高。对比例4本对比例与实施例2相比，除了按照新型冠状病毒rbd抗原和新型冠状病毒n抗原的质量比为1:1的比例，将包被有新型冠状病毒rbd抗原的磁微粒和包被有新型冠状病毒n抗原的磁微粒进行混合外，其余成分及制备方法均与实施例2相同。将对比例4的检测试剂盒，对372例临床样本(确诊的阳性血清62例、正常人血清310例)进行检测，检测结果见表8。表8从表8可以看出，对比例4的试剂盒灵敏度较高，高于对比例1-3的试剂盒的灵敏度。但是，对比例4的试剂盒灵敏度和特异性还有待进一步提高。对比例5本对比例与实施例2相比，除了按照新型冠状病毒rbd抗原和新型冠状病毒n抗原的质量比为9:2的比例，将包被有新型冠状病毒rbd抗原的磁微粒和包被有新型冠状病毒n抗原的磁微粒进行混合外，其余成分及制备方法均与实施例2相同。将对比例5的检测试剂盒，对80例临床样本(确诊的阳性血清30例、正常人血清50例)进行检测，检测结果见表9。表9从表9可以看出，对比例5的试剂盒灵敏度较高，高于对比例1-3的试剂盒的灵敏度。但是，对比例5的试剂盒灵敏度和特异性还有待进一步提高。当前第1页12