直接测定复方氨基酸注射液中色氨酸3种降解产物的方法与流程

本发明属于药物检测
技术领域：
，具体涉及一种直接测定复方氨基酸注射液中色氨酸3种降解产物的方法。
背景技术：
：复方氨基酸注射液处方中含有色氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸等几种到几十种氨基酸，其作为重要的肠外营养药，广泛应用于临床，满足患者体内氨基酸需要。其中，色氨酸作为人体内必需氨基酸，在光、热、氧等条件下，容易发生降解，影响产品质量。其中，色氨酸及其三种降解产物的结构式如下：因复方氨基酸类产品处方成分较复杂，并且大多数成分结构近似，很容易干扰二氧吲哚丙氨酸、犬尿氨酸和2-羟基色氨酸的测定。目前，尚无文献或报道同时检测复方氨基酸注射液中这3种色氨酸降解产物的方法，因此，需建立一种专属性强、简便可行的检测方法，用于控制复方氨基酸产品中这3种色氨酸降解产物的含量。技术实现要素：针对以上不足，本发明的目的是提供一种准确、简便的直接测定复方氨基酸注射液中色氨酸3种降解产物的方法，能够同时测定二氧吲哚丙氨酸、犬尿氨酸和2-羟基色氨酸的含量，从而保证复方氨基酸类产品的质量，专属性强、灵敏度高、重复性好。本发明所述的直接测定复方氨基酸注射液中色氨酸3种降解产物的方法，色氨酸3种降解产物是指：二氧吲哚丙氨酸、犬尿氨酸和2-羟基色氨酸，包括如下步骤：(1)液相色谱仪的色谱条件如下：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；流动相：流动相a为磷酸盐缓冲液，流动相b为乙腈；流速：0.95～1.05ml/min；柱温：25～35℃；进样量：5～100μl；洗脱方式：梯度洗脱；紫外检测器波长：254nm；(2)制备供试品溶液；(3)制备对照品溶液；(4)测定：量取供试品溶液与对照品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算含量。其中：所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱为岛津、月旭、安捷伦、waters、thermo、phenomenex、cosmosil、ymc或shiseido品牌c18色谱柱中的一种。所述色谱柱的长度为250mm、150mm、100mm或80mm中的一种。所述流动相中，磷酸盐缓冲液的ph为7.5～7.7。优选地，所述流速为1.0ml/min。优选地，所述柱温为30℃。优选地，所述进样量为20μl。所述梯度洗脱程序如下：所述制备供试品溶液的方法为：精密量取复方氨基酸注射液，加水稀释制成含色氨酸0.1～2.0mg/ml的溶液，作为供试品溶液。所述制备对照品溶液的方法为：精密称取二氧吲哚丙氨酸、犬尿氨酸和2-羟基色氨酸，加水溶解，并定量稀释制成各含1.5±0.1μg/ml的溶液，作为对照品溶液。与现有技术相比，本发明的有益效果如下：1、本发明能够同时测定二氧吲哚丙氨酸、犬尿氨酸和2-羟基色氨酸的含量，分析效果好，相互之间无干扰。2、本发明提供的方法专属性强、灵敏度高、重复性好，解决了处方中其他氨基酸成分干扰，以及其他检测方法中因衍生反应导致测定结果不准确等技术难题，保证了产品质量。3、本发明提供的方法流动相为常见的磷酸盐缓冲液和乙腈体系，无离子对试剂，ph值近中性，能较大程度的延长色谱柱的使用寿命，大大降低成本。附图说明图1为本发明实施例1阴性空白溶液的hplc图；图2为本发明实施例1二氧吲哚丙氨酸对照品溶液的hplc图；图3为本发明实施例1犬尿氨酸对照品溶液的hplc图；图4为本发明实施例12-羟基色氨酸对照品溶液的hplc图；图5为本发明实施例1供试品溶液的hplc图；图6为本发明实施例1加标供试品溶液的hplc图。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步说明，但不仅仅局限于下述实施例。实施例11、色谱条件色谱柱：岛津inertsustainaqc18柱(250×4.6mm，5μm)，检测波长：254nm，流速1.0ml/min，柱温：30℃，进样量20μl。2、溶液制备2.1流动相a：磷酸盐缓冲液(0.01mol/l磷酸氢二铵溶液，用三氟乙酸调节ph值至7.6±0.1)。流动相b：乙腈。梯度洗脱条件：2.2供试品溶液：精密量取复方氨基酸注射液，加水稀释制成含色氨酸0.95mg/ml的溶液，作为供试品溶液。2.3对照品溶液：分别精密称取二氧吲哚丙氨酸、犬尿氨酸和2-羟基色氨酸对照品适量，加乙腈溶解并用水定量稀释制成各含1.43μg/ml的混合溶液，作为对照品溶液。3、测定方法精密量取供试品溶液与对照品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算。以下通过方法验证来说明本发明所述方法的有益效果：(1)专属性试验阴性空白溶液的制备：按处方配制不含色氨酸的溶液。未破坏样品的制备：取供试样品10ml，用流动相稀释定容至20ml。酸破坏样品的制备：取供试样品10ml，加1mol/l盐酸溶液1ml，水浴2h，加入1mol/l氢氧化钠溶液1ml中和，加水定容至20ml。碱破坏样品的制备：取供试样品10ml，加1mol/l氢氧化钠溶液1ml，水浴2h，加入1mol/l盐酸溶液1ml中和，加水定容至20ml。氧化样品的制备：取供试样品10ml，加入30％过氧化氢0.5ml，70℃加热1h，加水定容至20ml。高温样品的制备：取供试样品10ml，水浴加热3h，加水定容至20ml。光照样品的制备：取光照24h(光照度约5000lx、近紫外能量约100μw/cm2)的供试样品10ml，加水定容至20ml。分别取上述样品，依法检验，结果见表1。表1二氧吲哚丙氨酸、犬尿氨酸、2-羟基色氨酸强制降解试验结果汇总方式主成分含量％二氧吲哚丙氨酸％犬尿氨酸％2-羟基色氨酸％未破坏1000.0170.0020.012酸99.670.0290.0070.031碱99.390.0380.0020.011氧化90.291.6590.0092.216高温99.050.0900.0240.066光照99.340.0350.0010.037结论：阴性空白溶液不影响色氨酸3种降解产物的检测，各破坏条件下，二氧吲哚丙氨酸、犬尿氨酸、2-羟基色氨酸含量增幅不一，以氧化和高温趋势最明显。考虑到色氨酸对氧敏感，高温条件下各杂质增长可能因氧气存在导致。综合而言，色氨酸对氧更敏感。(2)定量限取已知浓度的二氧吲哚丙氨酸、犬尿氨酸、2-羟基色氨酸对照品溶液，逐级稀释。计算各峰的信号峰高与基线噪音的比值，即s/n值，s/n在8～12时对应的浓度即为其定量限浓度，平行配制6份定量限浓度溶液，依法检测，记录色谱图，各峰面积的rsd应不大于5.0％。结果见表2。表2二氧吲哚丙氨酸、犬尿氨酸、2-羟基色氨酸的定量限测定结果结论：二氧吲哚丙氨酸、犬尿氨酸、2-羟基色氨酸的定量限分别为0.431μg/ml、0.141μg/ml、0.146μg/ml，rsd均符合要求。(3)线性范围取二氧吲哚丙氨酸、犬尿氨酸、2-羟基色氨酸对照品各适量，用水溶解并定量稀释制成不同浓度的溶液，作为线性溶液1～5。分别取上述样品，依法检验，以各物质的浓度c(μg/ml)为横坐标，峰面积a为纵坐标绘制标准曲线，得线性回归方程。结果见表3～5。表3二氧吲哚丙氨酸线性测定结果浓度(μg/ml)峰面积0.43192150.719162931.15246651.437318382.156480912.87465837线性方程：a＝23017c-974.87相关系数：0.9995表4犬尿氨酸线性测定结果浓度(μg/ml)峰面积0.14149510.705210411.128307531.41334342.115496442.8263970线性方程：a＝21461c+4209.4相关系数：0.9965表52-羟基色氨酸线性测定结果浓度(μg/ml)峰面积0.14651270.731242061.17384571.462472672.193711142.92495760线性方程：a＝32507c+254.8相关系数：0.9999结论：二氧吲哚丙氨酸在0.431μg/ml～2.874μg/ml、犬尿氨酸在0.141μg/ml～2.82μg/ml、2-羟基色氨酸在0.146μg/ml～2.924μg/ml范围，各物质的线性关系良好，线性相关系数r分别为0.9995、0.9965、0.9999，符合要求。(4)精密度取二氧吲哚丙氨酸、犬尿氨酸、2-羟基色氨酸对照品各适量，加入供试样品中，加水溶解并稀释制成一定浓度的加标供试品溶液，平行制备6份，依法检验，要求6次测定结果的rsd≤3.0％，以证实方法具有良好的精密度，结果见表6。表6二氧吲哚丙氨酸、犬尿氨酸、2-羟基色氨酸检查精密度测定结果溶液序号二氧吲哚丙氨酸％犬尿氨酸％2-羟基色氨酸％10.1720.1420.20320.1680.1440.19230.1730.1460.19440.1700.1420.20050.1670.1430.20460.1670.1440.197rsd(n＝6)1.501.012.41结论：精密度6次测定结果，各物质含量的rsd均小于3.0％，符合要求。(5)准确度在供试样品中加入定量限、60％、80％、100％不同限度浓度的二氧吲哚丙氨酸、犬尿氨酸、2-羟基色氨酸，测定回收率所得。要求回收率在90％～108％之间，以证实该方法具有良好的准确度，结果见表7～9。表7二氧吲哚丙氨酸检查回收率测试结果表8犬尿氨酸检查回收率测试结果表92-羟基色氨酸检查回收率测试结果结论：准确度试验中，二氧吲哚丙氨酸、犬尿氨酸、2-羟基色氨酸12个测定结果的回收率分别在98.96％～107.54％、90.23％～98.63％、101.33％～107.19％之间，回收率平均值分别为104.78％、92.83％、103.17％，rsd分别为2.94％、3.00％、1.61％，方法的准确度良好。(6)溶液稳定性考察对照品溶液与供试品溶液随时间的变化规律，对照品溶液与供试品溶液室温放置0、3、6、9、12h，依法检测。要求对照品溶液与供试品溶液中各杂质峰面积的rsd≤10.0％，结果见表10。表10二氧吲哚丙氨酸、犬尿氨酸、2-羟基色氨酸稳定性试验结果结论：对照品溶液与供试品溶液室温放置12h内，各杂质峰面积的rsd均小于10.0％，且无新杂质生成，溶液稳定性良好。(7)耐用性通过改变不同的流速、柱温、流动相ph值、不同品牌色谱柱等来评估测定条件参数有微小变动时，测定结果的影响程度，结果见表11。表11二氧吲哚丙氨酸、犬尿氨酸、2-羟基色氨酸耐用性试验结果结论：柱温25℃～35℃、流速0.95ml/min～1.05ml/min、流动相ph值7.5～7.7、更换不同品牌色谱柱，各杂质含量的rsd均符合要求。以上所述仅为本发明的优选实施例，对于熟悉本领域的技术人员，在本发明的基础上，依然可以进行一定程度的方法优化，因此凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页12