非洲猪瘟病毒N蛋白IgY抗体检测胶体金试纸及方法与流程

本发明涉及非洲猪瘟病毒n蛋白igy抗体的快速检测
技术领域：
，尤其涉及一种非洲猪瘟病毒n蛋白igy抗体检测胶体金试纸及方法。
背景技术：
：非洲猪瘟(africanswinefever，asf)是一种具有高度传染性的猪病毒病。在家猪中可导致接近100％的高死亡率。asf是由非洲猪瘟病毒(asfvirus，asfv)引起，asfv是一种较大的双链dna病毒，主要在巨噬细胞的细胞质中复制，asfv是asfarviridae科asfivirus属唯一的成员。asfv的天然宿主包括野猪和ornithodoros属的节肢动物媒介。asfv在其储存宿主的感染通常是无症状的，并且发展为持续感染。相反，asfv对家猪的感染可导致致命的出血热。非洲猪瘟病毒最大的特性就是“两高”：高传染和高死亡。猪场一旦被感染非洲猪瘟病毒，很快就会向四周蔓延，染病的生猪死亡率达100％，无一幸免。非洲猪瘟一般是通过检测手段才能发现，肉眼辩识并不一定准确。在感染了该病毒的猪体内，其五脏、血液和粪便都有病毒的生存。现阶段对于这种病毒的灭杀还具有很大的难度，至今还没有特效药能够有效的消灭它，其相应的接种疫苗也没有成熟，还不能临床应用。胶体金免疫层析技术作为一种新的免疫学方法，在生物医学各领域得到了日益广泛的应用。它是继传统三大免疫标记技术之后又一较为成熟的、得到广泛应用的免疫标记技术。当待测样品加入到样品膜上后，由于微孔滤膜的毛细管作用，使抗原抗体反应在固相膜上快速进行，检测一般只要5～10min就会出结果，相比其它方法(如elisa需1～2h，荧光定量pcr法需要2小时)大大的缩短了检测时间。其测试结果以肉眼可见的显色条带来判断，不需要特别仪器设备，只需要试纸条或渗滤试剂盒，样品只要做非常简单的处理或不需要做前处理。且具有成本较低、操作简单、试剂稳定不受温度等外界因素影响、方便快捷、特异敏感、稳定性强、结果判断直观等优点，因而特别适合于现场快速检查，具有巨大的发展潜力和广阔的应用前景，代表了诊断试剂简单快速、便于普及的发展方向。中国专利文献cn201920618571.x公开了一种非洲猪瘟抗体胶体金检测卡，所述检测卡包括检测试纸，检测试纸包括pvc底板、及依次搭接在pvc底板上的样品垫、结合垫、全血膜、硝酸纤维素膜和吸水垫，结合垫上包被有胶体金标记的非洲猪瘟重组抗原，硝酸纤维素膜上依次设有检测线、半对照线、对照线和质控线，所述检测线、半对照线和对照线上包被非洲猪瘟病毒重组抗原，所述质控线上包被兔抗金黄色葡萄球菌a多克隆抗体。中国专利文献cn201310197035.4公开了一种非洲猪瘟病毒抗体检测胶体金免疫层析试纸条制备方法，并具体公开了用胶体金颗粒标记纯化p54重组抗原，以金黄色葡萄球菌a蛋白作为检测线，以p54免疫血清作为质控线，制备胶体金免疫层析试纸条。以上发明仅能定性检测猪体内是否有该抗体，而不能定量检测出该抗体的含量是否已经达到抵抗病毒的滴度，无法判断猪体内的抗体是否足以抵抗非洲猪瘟病毒。本发明制备2种纯化的asfv重组抗原asfv-1和asfv-2，混合使用后，不仅能定性检测非洲猪瘟病毒，而且能够提高检测的灵敏度和检测范围，抗体浓度在50ng/ml-800ng/ml还有很高的检测线，明显提高了检测线性范围。技术实现要素：本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种新的针对非洲猪瘟病毒n蛋白igy抗体检测胶体金试纸及其制备方法，以提高非洲猪瘟病毒n蛋白igy抗体检测的灵敏度和线性范围。本发明通过以下技术方案来实现上述目的：本发明提供了一种非洲猪瘟病毒n蛋白igy抗体检测胶体金试纸，包括pvc底板，及依次搭接在pvc底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中，所述结合垫为包被有兔抗鸡igg-胶体金复合物的胶体金垫，所述硝酸纤维素膜上设有由山羊抗兔igg包被的质控线和asfv重组抗原包被的检测线。作为本发明的进一步优化方案，所述检测线包括2种asfv重组抗原。本发明还提供了上述非洲猪瘟病毒n蛋白igy抗体检测胶体试纸的制备方法，包括以下步骤：(1)制备纯化的asfv重组抗原；(2)制备硝酸纤维素膜：将山羊抗兔igg和纯化的asfv重组抗原分别稀释后，包被在硝酸纤维素膜的质控线和检测线上；(3)制备胶体金；(4)胶体金标记兔抗鸡igg：取兔抗鸡igg，将胶体金与兔抗鸡igg混合，离心，用pbs溶液重悬沉淀，获得兔抗鸡igg-胶体金复合物；(5)制备胶体金垫：将兔抗鸡igg-胶体金复合物均匀喷在结合垫上，充分干燥，获得胶体金垫；(6)样品垫的处理：将样品垫浸泡在20mmol/l的pbs缓冲液中2-5小时，并且边震荡边混匀，其中缓冲液中加入活化剂，活化剂选用peg6000、peg8000、曲拉通100中的一种，终浓度为1％～2％质量百分比，活化剂用量一般为1％～2％的peg6000、peg8000、曲拉通100中的一种。；浸泡结束后，将样品垫放入烘箱中烘干；(7)组装：在干燥环境下，将样品垫、胶体金垫、包被好的硝酸纤维素膜和吸水垫粘贴在pvc板上，裁切后，获得试纸。作为本发明的进一步优化方案，所述步骤(1)包括制备2种纯化的asfv重组抗原asfv-1和asfv-2，步骤包括：根据已知的asfvn-1、n-2蛋白基因序列制备asfvn蛋白的大肠杆菌重组菌，将重组菌进行发酵表达并离心获得菌体，将菌体超声破碎，离心后取上清，将上清液过亲和层析柱，即为纯化的asfv-1重组抗原。作为本发明的进一步优化方案，所述步骤(2)中，山羊抗兔igg和纯化的asfv重组抗原分别以25-80mmol/l的tris缓冲液稀释至终浓度为1mg/ml，再以0.75μl/cm的喷量喷施包被在质控线和检测线上，充分干燥。作为本发明的进一步优化方案，所述步骤(3)中，制备胶体金的方法为柠檬酸三钠还原法，步骤包括：(ⅰ)取质量分数为0.005％-0.015％的haucl4水溶液100ml，加热煮沸；(ⅱ)迅速加入质量分数为0.5％-5％的柠檬酸三钠水溶液1ml，继续煮沸，溶液由淡黄色变成灰色，继而转成黑色，随后逐渐稳定成酒红色，制成胶体金溶液。作为本发明的进一步优化方案，所述步骤(4)中，胶体金标记兔抗鸡igg的步骤包括：(i)取兔抗鸡igg溶于0.1-0.2ml10mm的缓冲液中，将胶体金溶液的ph值调至7.2；(ii)每20-50mg兔抗鸡igg中，加入10ml胶体金溶液；(iii)混合3-5min后，加入质量分数为0.05％的bsa，室温作用结合15min；(iv)先2000r/min低速离心15min，再12000r/min高速离心25min；(v)用100mmol/l的ph7.8的含0.2％质量分数proclin300的缓冲液重悬沉淀，获得兔抗鸡igg-胶体金复合物。作为本发明的进一步优化方案，所述缓冲液为tris缓冲液、pbs缓冲液或hepes缓冲液。作为本发明的进一步优化方案，所述兔抗鸡igg-胶体金复合物在玻璃纤维膜上的喷洒量为10μl/cm。本发明还提供了利用上述非洲猪瘟病毒n蛋白igy抗体检测胶体试纸检测asfvigy抗体的方法，步骤包括：步骤一、将试纸平放，取待测血清样品50-100μl，加入样品垫；步骤二、室温静置15min后，判断：若质控线出现紫红色线且检测线不出现色线，为阴性；若质控线和检测线都出现紫红色线，为阳性；检测线的颜色深浅与抗体滴度成正比。本发明的有益效果在于：本发明提供了一种非洲猪瘟病毒n蛋白igy抗体检测胶体试纸及其制备方法和应用，利用检测试纸检测后，阳性结果说明所检测样本asfvigy抗体阳性且达到了要求的抗体水平，阴性结果说明样本asfvigy抗体阴性或未达到要求的抗体水平，该试纸条可迅速检测asfvigy抗体水平。本发明为了提高检测的灵敏度和线性范围，特制备了2种纯化的asfv重组抗原，相比较其它常规elisa抗体检测或胶体金检测方法，本发明更加的方便快捷，灵敏度更高。附图说明图1为本发明非洲猪瘟病毒n蛋白igy抗体检测胶体试纸的整体结构示意图。具体实施方式下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。实施例1本实施例的非洲猪瘟病毒n蛋白igy抗体检测胶体试纸的制备方法，包括以下步骤：(1)纯化的asfv重组抗原的制备从genbank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)获取asfvn-1、n-2蛋白基因序列(asfvn-1和asfvn-2是从genbank基因登录号：mk128995.1中截取获得的，其中mk128995.1基因编码蛋白的信号肽后60个氨基酸对应的基因序列作为asfvn-1，60个氨基酸后面剩下的氨基酸对应的基因序列作为asfvn-2)，送华大基因公司制备asfv蛋白的大肠杆菌重组菌，将重组菌发酵表达并离心获得菌体，将菌体使用高压均质机破碎，并使用超声破碎仪二次破碎，离心取上清，将上清过亲合层析柱，即为纯化的asfv重组抗原，将两种纯化的抗原分别命名为asfv-1和asfv-2。(2)制备硝酸纤维素膜将山羊抗兔igg和纯化的asfv重组抗原(asfv-1，asfv-2)分别以25-80mmol/l的tris缓冲液(缓冲液中含有0.9％nacl，tween20和pc300)稀释至终浓度为1mg/ml，然后分别均匀喷在硝酸纤维素膜上的质控线c和检测线t，喷量均为0.75μl/cm，充分干燥。(3)胶体金溶液的制备采用柠檬酸三钠还原法，制备10-40nm胶体金，具体操作方法如下：(ⅰ)取质量分数为0.005％-0.015％的haucl4水溶液100ml，加热煮沸。(ⅱ)迅速加入质量分数为1％-5％的柠檬酸三钠水溶液1ml，继续煮沸约5min；(ⅲ)制成粒径10-40nm金颗粒后，此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸三钠加入后很快变成灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成酒红色；(ⅳ)冷却至室温后4℃避光保存。(4)制备胶体金标记兔抗鸡igg(i)取高纯度兔抗鸡igg溶于0.1-0.2ml的10mm的tris缓冲液中，将胶体金溶液的ph值调至7.2；(ii)按以下组合将兔抗鸡igg与胶体金混合：每20-50mg兔抗鸡igg，加入10ml40nm胶体金溶液；(iii)混合3-5min后，加入质量分数为0.05％的bsa，室温作用结合15min；(iv)先2000r/min低速离心15min，再12000r/min高速离心25min；(v)用100mmol/l的ph7.8的含0.2％质量分数proclin300的tris缓冲液重悬沉淀，获得兔抗鸡igg-胶体金复合物。(5)制备胶体金垫3将上述制备的兔抗鸡igg-胶体金复合物按照10μl/cm的喷量均匀喷在玻璃纤维素膜上，充分干燥，获得胶体金垫3。(6)样品垫2的处理为提高检测的准确度和稳定性，使检测样本时的c线和t线颜色更加均一，特将样品垫2进行处理。处理方式为：将样品垫2泡在20mmol/l的pbs缓冲液中2-5小时，并且边震荡边混匀，其中缓冲液中加入1％的peg8000。浸泡结束后，将样品垫2放入烘箱中烘干，本实施例中，烘干的温度为37℃，时间14小时。(7)试纸条的组装在干燥间内准备好吸水垫5、样品垫2、pvc底板1，在pvc底板1中央贴上步骤2.2包被好的硝酸纤维素膜4，硝酸纤维素膜4上缘粘贴吸水垫5，硝酸纤维素膜4下缘粘贴步骤2.5制备的胶体金垫3，胶体金垫3下缘粘贴步骤2.6处理后的样品垫2，各组分相互叠加部分为1-2mm，完成后用裁切机将贴好的试纸板切成4.1mm宽的试纸条，结构如图1所示。将切好的试纸条装入卡壳中，再将试纸条和干燥剂密封于铝箔袋中，完成产品的组装。实施例2从genbank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)获取asfvn-1蛋白基因序列，送华大基因公司制备asfv蛋白的大肠杆菌重组菌，将重组菌发酵表达并离心获得菌体，将菌体使用高压均质机破碎，并使用超声破碎仪二次破碎，离心取上清，将上清过亲合层析柱，即为纯化的asfv-1重组抗原。将山羊抗兔igg和纯化的asfv-1重组抗原分别以25-80mmol/l的tris缓冲液(缓冲液中含有0.9％nacl，tween20和pc300)稀释至终浓度为1mg/ml，然后分别均匀喷在硝酸纤维素膜上的质控线c和检测线t，喷量均为0.75μl/cm，充分干燥。采用柠檬酸三钠还原法，制备10-40nm胶体金。制备胶体金标记兔抗鸡igg，将胶体金标记兔抗鸡igg均匀喷洒在玻璃纤维素膜上，充分干燥，获得胶体金垫。将样品垫用含有活化剂和抗干扰物质的pbs缓冲液浸泡处理，烘干。在干燥间内将吸水垫、样品垫、pvc底板、包被有质控线和检测线的硝酸纤维素膜、胶体金垫进行组装，裁切后，获得试纸。实施例3从genbank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)获取asfvn-2蛋白基因序列，送华大基因公司制备asfv蛋白的大肠杆菌重组菌，将重组菌发酵表达并离心获得菌体，将菌体使用高压均质机破碎，并使用超声破碎仪二次破碎，离心取上清，将上清过亲合层析柱，即为纯化的asfv-2重组抗原。将山羊抗兔igg和纯化的asfv-2重组抗原分别以25-80mmol/l的tris缓冲液(缓冲液中含有0.9％nacl，tween20和pc300)稀释至终浓度为1mg/ml，然后分别均匀喷在硝酸纤维素膜上的质控线c和检测线t，喷量均为0.75μl/cm，充分干燥。采用柠檬酸三钠还原法，制备10-40nm胶体金。制备胶体金标记兔抗鸡igg，将胶体金标记兔抗鸡igg均匀喷洒在玻璃纤维素膜上，充分干燥，获得胶体金垫。将样品垫用含有活化剂和抗干扰物质的pbs缓冲液浸泡处理，烘干。在干燥间内将吸水垫、样品垫、pvc底板、包被有质控线和检测线的硝酸纤维素膜、胶体金垫进行组装，裁切后，获得试纸。试验例1参照实施例1的方法制备试纸，不同之处在于采用未经含活化剂和抗干扰物质的缓冲液浸泡处理。试验例2从genbank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)获取asfvn-1、n-2蛋白基因序列，送华大基因公司制备asfv蛋白的大肠杆菌重组菌，将重组菌发酵表达并离心获得菌体，将菌体使用高压均质机破碎，并使用超声破碎仪二次破碎，离心取上清，将上清过亲合层析柱，即为纯化的asfv重组抗原，将两种纯化的抗原分别命名为asfv-1和asfv-2。将兔抗金黄色葡萄球菌a多克隆抗体代替实施例1中的山羊抗兔igg均匀喷在硝酸纤维素膜上的质控线c上，将纯化的asfv重组抗原(asfv-1，asfv-2)均匀喷在硝酸纤维素膜的检测线t上。采用柠檬酸三钠还原法，制备10-40nm胶体金。制备胶体金标记兔抗鸡igg，将胶体金标记兔抗鸡igg均匀喷洒在玻璃纤维素膜上，充分干燥，获得胶体金垫。将样品垫用含有活化剂和抗干扰物质的pbs缓冲液浸泡处理，烘干。在干燥间内将吸水垫、样品垫、pvc底板、包被有质控线和检测线的硝酸纤维素膜、胶体金垫进行组装，裁切后，获得试纸。试验例3本试验例参照中国专利文献cn201310197035.4，用胶体金颗粒标记纯化p54重组抗原，喷洒在玻璃纤维素膜上制备胶体金垫，以金黄色葡萄球菌a蛋白作为检测线，以p54免疫血清作为质控线，制备试纸。试纸条检测效果验证：分别利用本发明的试纸条和酶联免疫吸附法(elisa)检测抗体浓度，步骤包括：将试纸条平放于桌面上，根据asfvigy抗体出厂时要求的抗体水平，取asfvigy抗体，用50mm的tris溶液稀释至50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml、800ng/ml，作为检测样品，同时设置空白对照。分别取检测样品和空白对照50-100μl，加入样品垫2，室温静置15min，根据质控线和检测线的颜色读取结果：若质控线出现紫红色线且检测线不出现色线，为阴性；若质控线和检测线都出现紫红色线，为阳性；检测线的颜色深浅与抗体滴度成正比。酶联免疫吸附法(elisa)检测抗体浓度按照常规酶联免疫吸附法进行。结果如下表1所示：表1：不同方法检测asfvigg抗体浓度结果样品浓度50ng/ml100ng/ml200ng/ml400ng/ml800ng/ml空白实施例1阳性(色浅)阳性(色浅)阳性(正常)阳性(正常)阳性(色深)阴性实施例2阴性(无线)阳性(色浅)阳性(色浅)阳性(正常)阳性(色深)阴性实施例3阴性(无线)阳性(色浅)阳性(色浅)阳性(正常)阳性(色深)阴性试验例1阴性(无线)阴性(无线)阳性(色浅)阳性(色浅)阳性(正常)阴性试验例2阴性(无线)阳性(色浅)阳性(色浅)阳性(正常)阳性(色深)阴性试验例3阴性(无线)阳性(色浅)阳性(色浅)阳性(正常)阳性(色深)阴性elisa阳性阳性阳性阳性阳性阴性说明：实施例1，本发明中使用了2种asfv重组抗原的检测结果；实施例2-3为分别用1种asfv重组抗原的检测结果；试验例1是样品垫未经处理；试验例2为cn201920618571.x专利方法检测结果；试验例3为cn201310197035.4专利方法检测结果；表1可以看出，本发明的胶体金试纸条的检测结果与elisa检测结果具有高度一致性，说明本发明胶体金试纸条的准确率为100％，利用本申请的胶体金试纸条检测asfvigy抗体及其含量是可行的。由于色线深浅与抗体滴度成正比，抗体滴度越高，色线越深，可由此来检测市售的asfvigy抗体产品是否达到了出厂抗体水平，以判断购买的产品质量，进一步地本发明实施例1使用了2种asfv重组抗原明显优于以下实施例，并且检测50ng/ml抗体浓度，能够看到色浅的一条线。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。当前第1页12