1.本发明属于生物医药领域，涉及唾液代谢标志物及其在口腔粘膜癌前病变向口腔鳞癌演变过程中的诊断应用。
背景技术：
：：2.口腔鳞状细胞癌(oralsquamouscellcarcinoma，oscc)是头颈部恶性肿瘤中最为常见的类型之一。全球范围内，其在发展中国家的发病率要相对高于发达国家，据报道，口腔鳞癌在美国的发病率约为10例/10万，而在印度的发病率则超过了20例/10万。近几十年来，oscc的发病率呈逐年递增趋势，以上海地区为例，女性口腔鳞癌发病率为3.3/10万，男性发病率为3.8/10万。虽然口腔鳞癌的发病率相比其他肿瘤并不算高，但我国人口众多，病员基数大，口腔鳞癌的预防和治疗任重而道远。3.近几十年来，尽管口腔鳞癌的治疗技术和治疗理念不断改进，但其整体治疗效果并没有取得显著提高。口腔鳞癌患者的5年生存率并没有显著改善,仍徘徊在60％左右，晚期患者甚至还不足30％,其中的主要的原因是大多数患者在诊断时已经处于肿瘤晚期阶段。文献报道，口腔鳞癌的术后局部复发率在6.9-22％，而一旦出现术后复发，患者的生存率将明显下降。既往的研究表明，术后复发患者的3年总体生存率(overallsurvival,os)约52.6％,5年总体生存率仅24-50％。4.实现对恶性肿瘤的早期预防、早期诊断、早期治疗，对于提高恶性肿瘤的治疗效果具有积极的意义。口腔鳞癌是来源于口腔粘膜上皮的恶性肿瘤，其在病理学上的演变包括正常粘膜上皮-异常增生上皮-恶性上皮细胞。口腔粘膜癌前病变主要包括口腔白斑、红斑，其主要病理改变为上皮组织异常增生(轻、中、重度异常)。口腔粘膜癌前病变(口腔白斑、红斑)多见于中老年人，患者病程长，迁延不愈，其最大的风险在于部分患者会进展为口腔鳞癌，给患者带来极大的精神心理负担。因此，寻找能有效预测口腔粘膜癌前病变(口腔白斑、红斑)恶性转化风险的标志物，对于提高口腔粘膜癌前病变和口腔鳞癌的防治具有积极的意义。技术实现要素：5.为了实现对口腔粘膜癌前病变癌变潜能的早期、快速、无创筛查，本发明的目的在于提供一组能准确区分健康志愿者、口腔粘膜癌前病变和口腔鳞癌病人的唾液代谢标志物，利用该标志物组合，能实现对口腔粘膜癌前病变和口腔鳞癌病人的早期、快速、无创筛查。6.本发明的另一目的在于提供上述唾液代谢标志物的应用。7.本发明的技术方案如下：8.预测口腔粘膜癌前病变患者发生癌变的唾液代谢标志物，包括腐胺putrescine、尸胺cadaverine、胸苷thymidine、腺苷adenosine、马尿酸hippuricacid、磷酸胆碱phosphocholine、葡萄糖glucose或廿二碳四烯酸adrenicacid。9.进一步地，所述标志物：putrescine、cadaverine、thymidine、adenosine设为一组；所述hippuricacid、phosphocholine、glucose和adrenicacid设为另一组，两组组合在一起使用。10.进一步地，所述代谢标志物不仅是口腔鳞癌的癌性代谢标志物，还能筛查出具有高风险癌变的口腔粘膜癌前病变患者。11.一种预测口腔粘膜癌前病变患者发生癌变的试剂盒，所述试剂盒包括上述任意之一所述的唾液代谢标志物。12.唾液代谢标志物在制备预测口腔粘膜癌前病变患者发生癌变的试剂盒中的应用。13.进一步地，所述应用：提取唾液样本诊断，所述putrescine、cadaverine、thymidine、adenosine的含量从健康人-癌前病变患者-癌症患者逐渐升高；所述hippuricacid、phosphocholine、glucose和adrenicacid的含量从健康人-癌前病变患者-癌症患者逐渐递减。14.进一步地，所述代谢标志物不仅诊断出口腔鳞癌患者，还能筛查出具有高风险癌变的口腔粘膜癌前病变患者。15.本发明的优点如下：16.(1)本发明选择putrescine(腐胺)、cadaverine(尸胺)、thymidine(胸苷)、adenosine(腺苷)、hippuricacid(马尿酸)、phosphocholine(磷酸胆碱)、glucose(葡萄糖)、adrenicacid(廿二碳四烯酸)作为唾液代谢物分子标志物组合，可以有效预测口腔粘膜癌前病变向癌症转变，筛选具有高风险癌变的口腔粘膜癌前病变患者(白斑，红斑)。17.(2)本发明基于putrescine(腐胺)、cadaverine(尸胺)、thymidine(胸苷)、adenosine(腺苷)、hippuricacid(马尿酸)、phosphocholine(磷酸胆碱)、glucose(葡萄糖)、adrenicacid(廿二碳四烯酸)开发成口腔粘膜癌前病变患者(白斑，红斑)唾液诊断试剂盒，能实现对口腔粘膜癌前病变患者(白斑，红斑)恶性转化前的早期快速、无创筛查，可以满足绝大多数医疗机构的检测需求，具有广阔的临床应用前景。18.综上，本发明的唾液标志物可用于筛选具有高风险癌变的口腔粘膜癌前病变患者，且方法简单、无创操作，准确性高，为口腔鳞癌和口腔粘膜癌前病变的早期筛查、早期诊断、早期治疗提供了新的方法和思路。附图说明19.图1为实验开发组(第一批)健康志愿者(hc)、口腔粘膜癌前病变(pml)、口腔鳞癌(oscc)病例pls-da分析结果。20.图2为实验开发组(第一批)和验证组(第二批)共有代谢物维恩图分析：:(a)为健康志愿者(hc)vs口腔粘膜癌前病变(pml)在实验开发组和验证组中共有的42个代谢物；(b)为口腔粘膜癌前病变(pml)vs口腔鳞癌(oscc)在实验开发组和验证组中共有的94个代谢物。21.图3为8个标志物作为一个组合对所有373例病例进行roc曲线分析示意图,能准确区分早期健康志愿者vs癌前病变患者(auc＝0.89)、癌前病变患者vs口腔鳞癌患者(auc＝0.83)、健康志愿者vs口腔鳞癌患者(auc＝0.96)。具体实施方式22.下面结合附图和实施例对本发明做进一步的描述。23.1.实施例一：纳入研究的临床病例资料。24.本实施例中总共纳入373例唾液样本进行研究，其中口腔鳞癌病例125例、口腔粘膜癌前病变124例和健康志愿者124例，所有入组病例均签有知情同意书。将373个病例分为实验开发组(1stbatch)和验证组(1ndbatch)进行研究，其中，实验开发组共193例唾液样本，其中口腔鳞癌病例65例、口腔粘膜癌前病变64例、健康志愿者64例；验证组180例，包括口腔鳞癌病例、口腔粘膜癌前病变、健康志愿者各60例(如表1所示)。25.表1具体临床资料[0026][0027]2.实施例二：实验开发组初步确定口腔鳞癌组、口腔粘膜癌前病变组、健康组三组之间的差异代谢唾液标志物。[0028]提取唾液样本的方法：受试者先用0.9％的生理盐水漱口去除口内食物残渣，漱口后用漱口杯收集受试者唾液1ml；然后1200转，离心5min，收集上清液后进行cpsi-ms检测。[0029]导电聚合物喷雾离子化质谱技术(cpsi-ms)是一种先进的原位质谱分析技术，可以在常压、开放的环境中，仅需少量样本，即可高通量分析样本中的脂质分子。相比于传统的纸喷雾离子化，该技术具有以下优点：(1)样本消耗量少(≥100nl)；(2)极性、水溶性代谢物及药物分子；(3)操作快速简便；(4)定性、半定量；(5)灵敏度较高。上述特点使该技术满足了临床样本的及时检测(pointofcaretest,poct)要求。[0030]首先利用cpsi-ms技术对实验开发组193例唾液样本(口腔鳞癌病例65例、口腔粘膜癌前病变64例、健康志愿者64例)进行高通量代谢谱分析，总共得到627个m/z离子。使用pls-da对上述代谢物进行组别聚类分析，发现同一类型组别的病例能很好的聚类在一起(图1)。[0031]使用student’st检验方法，进行两组之间的比较分析(foldchange>1.5or<0.667,p<0.05)，在癌前病变组和健康组之间得到58个差异代谢物，口腔鳞癌组和癌前病变组之间得到106个差异代谢物(如表2和表3所示)。[0032]表2健康组和癌前病变组显著改变的差异代谢物[0033][0034]*fcrepresentfoldchangeofpmlversushc,onlymetaboliteswithfcvalueslargerthan2.0orsmallerthan0.5werelistedinthetable(n＝42).[0035]表3口腔鳞癌组和癌前病变组显著改变的差异代谢[0036][0037][0038]*fcrepresentfoldchangeofpmlversushc,onlymetaboliteswithfcvalueslargerthan2.0orsmallerthan0.5werelistedinthetable(n＝90).[0039]3.实施例三：验证组对实验开发组确定的差异代谢物进一步验证。[0040]使用另外一批180例唾液样本，即验证组(口腔鳞癌病例、口腔粘膜癌前病变、健康志愿者各60例)对前面确定的58个和106个差异代谢物进行验证分析。结果表明实验开发组口腔粘膜癌前病变vs健康志愿者确定的58个候选标志物有42个代谢物被再次检测到并有统计学意义(foldchange>2.0or<0.5,p<0.05)。口腔鳞癌组vs口腔癌前病变组确定的106个候选标志物有94个代谢物被再次检测到并有统计学意义(foldchange>2.0or<0.5,p<0.05)(如图2所示)。[0041]4.实施例四：从健康志愿者-癌前病变-口腔鳞癌演变过程中递增、递减的代谢物。[0042]对实验开发组和验证组确定的共有的差异代谢物进一步分析，确定了8个从健康志愿者-癌前病变-口腔鳞癌递增或递减趋势最明显的代谢物(表4所示)，其中4个代谢物递增，另外4个代谢物递减。统计分析证实这8个代谢物能有效区分口腔粘膜癌前病变和口腔鳞癌患者，并且这8个代谢物的相对含量从健康志愿者-癌前病变-口腔鳞癌呈逐渐递增或递减的趋势，展示了在口腔鳞癌癌变进展过程中唾液代谢物的变化情况。这8个特征代谢物不仅是区分口腔鳞癌患者的癌性代谢物，而且是预测口腔粘膜癌前病变向口腔鳞癌转变的良好标志物。[0043]表4递增或递减的代谢物[0044][0045][0046]经上述统计分析得到的目标差异代谢物的结构鉴定，主要通过以下方法及流程进行鉴定：[0047]1)通过在线数据库检索，进一步匹配与推断其可能的分子结构；[0048]2)根据分子离子峰的精确质量数与同位素丰度比，推测代谢物可能的分子式，主要针对一级高分辨质谱获得代谢物的[m+h]+或[m-h]-离子峰，；[0049]3)对于可以购买到标准品的差异代谢物离子，进一步对目标代谢物的标准品进行lc-ms/ms分析，并与二级质谱的裂解结果进行比对从而确认代谢物的结构名称。[0050]5.实施例五：唾液代谢标志物组合对健康志愿者、癌前病变患者、口腔鳞癌患者的鉴别能力。[0051]当将此8个标志物作为一个组合对所有373例病例进行roc曲线分析，能准确区分早期健康志愿者vs癌前病变患者(auc＝0.89)、癌前病变患者vs口腔鳞癌患者(auc＝0.83)、健康志愿者vs口腔鳞癌患者(auc＝0.96)(如图3，roc曲线图)，再次证明上述8个唾液代谢标志物组合不仅是口腔鳞癌的癌性代谢标志物，而且能有效筛查出具有高风险癌变的口腔粘膜癌前病变患者。基于上述标志物组合开发成口腔粘膜癌前病变患者(白斑，红斑)唾液诊断试剂盒，能实现对口腔粘膜癌前病变患者(白斑，红斑)恶性转化前的早期快速、无创筛查，具有广阔的临床应用前景。[0052]以上所述仅为本发明的优选例实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的权利要求保护范围之内。当前第1页12当前第1页12