本发明涉及兽药残留检测领域，具体涉及一种检测禽组织、禽蛋或猪肉中青霉素g残留的确证分析方法。
背景技术：
国内外关于青霉素g残留的检测方法主要有微生物法、免疫分析法、薄层色谱法、液相色谱法、液相色谱-串联质谱法、气相色谱法、气相色谱-质谱法等，曾有文献报道gc结合外标法与gc-ms结合内标法检测动物性食品中的青霉素g，样品前处理过程复杂，耗时耗力，且内标物昂贵，回收率较低。而gc-ms/ms结合外标法检测禽组织及猪肉中的青霉素g残留的方法尚未见报道，与上述文献报道的gc、gc-ms相比较，样品前过程简单，省时省力，节省试验成本。该方法定性、定量更准确，准确度和灵敏度好，回收率高，重复性、重现性好，弥补了国内外关于禽组织、禽蛋或猪肉中青霉素g残留gc-ms/ms检测方法的空白。
技术实现要素：
为了能准确、高效的检测青霉素g在禽组织(鸡肉、鸡肝、鸡肾、鹅肉、鸭肉)、鸡蛋、鸭蛋(全蛋、蛋清、蛋黄)及猪肉中的残留，本发明提供了一种检测禽组织、禽蛋或猪肉中青霉素g残留的确证分析方法，该方法定性、定量准确，回收率较高，灵敏度好。
本发明的技术方案如下：
一种检测禽组织、禽蛋或猪肉中青霉素g残留的确证分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
将禽组织、禽蛋或猪肉样品通过加速溶剂萃取技术提取，固相萃取净化，三甲基硅烷基重氮甲烷衍生，经gc-ms/ms检测；所述禽组织为鸡肉、鸡肝、鸡肾、鹅肉或鸭肉；所述禽蛋为鸡蛋或鸭蛋。
进一步的，以全扫描和选择离子监测方式定性，选择反应监测方式定量。
进一步的，gc-ms/ms检测的气相色谱条件为：以tg-1ms为毛细管色谱柱；高纯氦气为载气，载气柱流速为1.0ml/min；所述高纯氦气纯度>99.999％，压力为60psi。
进一步的，gc-ms/ms检测的程序升温步骤为初始温度100℃，保持1min；30℃/min升至220℃，保持1min；30℃/min升至280℃，保持5min。
进一步的，gc-ms/ms检测的质谱条件为：电子轰击离子源；70ev电离能；高纯氩气为碰撞气；所述高纯氩气纯度>99.999％，压力为40psi。
进一步的，离子源温度为280℃；传输线温度为280℃；溶剂延迟时间为5.0min。
进一步的，gc-ms/ms检测的进样口温度为280℃。
进一步的，载气流速为1.0ml/min；2min后开阀，载气节省时间为2min，载气节省流量为20.0ml/min；进样体积：1.0μl。
进一步的，禽组织或猪肉样品用0.2m磷酸盐缓冲溶液提取，禽蛋用80％乙腈提取；所述0.2m磷酸盐缓冲溶液的ph为8.0。
进一步的，加速溶剂萃取仪的提取条件是1500psi，30℃。
有益效果
本发明中采用tg-1ms(30.0m×0.25μm×0.25mmi.d.)毛细管色谱柱，采用全扫描(scan)和选择离子监测(sim)方式定性，选择反应监测(autosrm)方式定量，最终所得青霉素g衍生产物的色谱峰峰形良好(即灵敏度高)，分析物保留时间适中，无其他杂质峰干扰。
本发明提供了一种气相色谱-串联质谱检测(gc-ms/ms)方法。本发明在分析效率、溶剂消耗、回收率、精密度、灵敏度及重现性角度，与其它检测方法相比，本方法分析效率更高、回收率、准确度和灵敏度高，重现性好，适合在批量样品分析中应用与推广。该方法能高效、准确的检测禽组织、禽蛋及猪肉中青霉素g残留，且满足中国农业农村部和欧盟兽药残留检测要求。附图说明
图1空白鸡肉样品(a)和空白鸡肉样品添加50.0μg/kg青霉素g标准品(b)的总离子流色谱图(tic)和定量、定性离子的质量色谱图(mc)
图2空白鸡肝脏样品(a)和空白鸡肝脏样品添加50.0μg/kg青霉素g标准品(b)的总离子流色谱图(tic)和定量、定性离子的质量色谱图(mc)
图3空白鸡肾脏样品(a)和空白鸡肾脏样品添加50.0μg/kg青霉素g标准品(b)的总离子流色谱图(tic)和定量、定性离子的质量色谱图(mc)
图4空白鹅肉样品(a)和空白鹅肌肉样品添加50.0μg/kg青霉素g标准品(b)的总离子流色谱图(tic)和定量、定性离子的质量色谱图(mc)
图5空白鸭肉样品(a)和空白鸭肌肉样品添加50.0μg/kg青霉素g标准品(b)的总离子流色谱图(tic)和定量、定性离子的质量色谱图(mc)
图6空白鸡全蛋样品(a)和空白鸡全蛋样品添加25.0μg/kg青霉素g标准品(b)的总离子流色谱图(tic)和定量、定性离子的质量色谱图(mc)
图7空白鸡蛋清样品(a)和空白鸡蛋清样品添加25.0μg/kg青霉素g标准品(b)的总离子流色谱图(tic)和定量、定性离子的质量色谱图(mc)
图8空白鸡蛋黄样品(a)和空白鸡蛋黄样品添加25.0μg/kg青霉素g标准品(b)的总离子流色谱图(tic)和定量、定性离子的质量色谱图(mc)
图9空白鸭全蛋样品(a)和空白鸭全蛋样品添加25.0μg/kg青霉素g标准品(b)的总离子流色谱图(tic)和定量、定性离子的质量色谱图(mc)
图10空白鸭蛋清样品(a)和空白鸭蛋清样品添加25.0μg/kg青霉素g标准品(b)的总离子流色谱图(tic)和定量、定性离子的质量色谱图(mc)
图11空白鸭蛋黄样品(a)和空白鸭蛋黄样品添加25.0μg/kg青霉素g标准品(b)的总离子流色谱图(tic)和定量、定性离子的质量色谱图(mc)
图12空白猪肉样品(a)和空白猪肉样品添加50.0μg/kg青霉素g标准品(b)的总离子流色谱图(tic)和定量、定性离子的质量色谱图(mc)
图13空白鸡肉基质中添加青霉素g标准曲线
图14空白鸡肝脏基质中添加青霉素g标准曲线
图15空白鸡肾脏基质中添加青霉素g标准曲线
图16空白鹅肉基质中添加青霉素g标准曲线
图17空白鸭肉基质中添加青霉素g标准曲线
图18空白鸡全蛋中基质添加青霉素g标准曲线
图19空白鸡蛋清基质中添加青霉素g标准曲线
图20空白鸡蛋黄基质中添加青霉素g标准曲线
图21空白鸭全蛋基质中添加青霉素g标准曲线
图22空白鸭蛋清基质中添加青霉素g标准曲线
图23空白鸭蛋黄基质中添加青霉素g标准曲线
图24空白猪肉基质中添加青霉素g标准曲线
具体实施方式
实施例1
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
1.试验畜禽的饲养和样品采集
本试验随机选取70日龄海扬黄鸡(江苏京海禽业集团有限公司)、142日龄高邮鸭(江苏高邮鸭集团)、70日龄扬州鹅(江苏天歌鹅业发展有限公司)各20只(公、母各半)；选取6月龄三元(杜×长×大)杂交猪(常州康乐农牧有限公司)6头(公、母各半)。单笼(栏)饲养，试验期间均饲喂不添加任何药物的全价饲料(江苏京海禽业集团有限公司饲料厂和扬州市扬大饲料厂提供)，自由饮水。饲养14日后屠宰，分别采集试验鸡胸肌肉、肝脏、肾脏和鸭、鹅胸肌肉以及猪背最长肌肉作为空白样品，分装，密封，置于-34℃冰柜中保存备用。
本试验随机选取28～30周龄产蛋海扬黄鸡40只(江苏京海禽业集团有限公司)，28～30周龄产蛋高邮鸭40只(江苏高邮鸭集团)，试验前预饲14天，饲喂不添加任何药物的全价饲料(由江苏京海禽业集团有限公司饲料厂和扬州市扬大饲料厂提供)，自由饮水。单笼(圈)饲养，试验期间均饲喂不添加任何药物的全价饲料，于每天17:30～18:00收集禽蛋，连续收集10天，禽蛋样品均保存在低温蛋库中。鸡蛋和鸭蛋样品收集后分别将其全蛋、蛋清、蛋黄匀浆后，分装，贴好标签，作为空白禽蛋样品，置于-34℃冰柜中保存。
2.本发明提取、净化、浓缩、复溶与衍生化步骤
1)准确称取(2.0±0.02)g均质好的空白样品放于研钵中，加入适量硅藻土研磨，将样品研磨成小颗粒，装入22ml萃取池中，用ase进行萃取；
2)在1500psi，30℃提取条件下，步骤1：正己烷去脂，静态提取5min，冲洗溶剂总量为40％，每个样品之间自动冲洗1次，氮气吹扫60s，静态提取1次，弃掉提取液；步骤2：禽组织和猪肉样品用0.2m磷酸盐缓冲溶液(ph8.0)提取，禽蛋用80％乙腈提取，其他提取条件(压力、温度、时间、冲洗溶剂总量、样品之间冲洗次数及氮气吹扫时间)与步骤1相同，静态提取2次，收集提取液于60ml收集瓶，转移至50ml离心管，待用。
3)将上述收集的提取液经过hlb固相萃取柱(60mg/3ml)净化，先用3ml甲醇、3ml水、3ml磷酸盐缓冲液活化平衡小柱，将上样液匀速全部过柱后，依次用3ml磷酸盐缓冲液、3ml水淋洗1次，去除杂质，待淋洗液全部匀速流出后，抽干2min，最后用3ml1％甲醇乙腈分两次进行洗脱，洗脱液用10ml离心管收集。将洗脱液置于氮吹仪中35℃吹干，待用。
4)将浓缩干后的样品用100μl乙醇复溶，涡旋混匀1min，然后加入400μl三甲基硅烷基重氮甲烷(tmsd)，密封，在30℃烘箱中避光反应30min，反应结束后取出，乙醇定容至1.0ml，然后转移至2.0ml具塞离心管中，涡旋混匀1min，在常温下12000×g离心10min，经过0.22μm有机相针头式滤器，滤液供gc-ms/ms检测分析。
3.gc-ms/ms分析条件
3.1气相色谱条件
毛细管色谱柱：tg-1ms(30.0m×0.25μm×0.25mmi.d.)；载气：高纯氦气(>99.999％，60psi)，载气柱流速：1.0ml/min。程序升温步骤：初始温度100℃，保持1min；30℃/min升至220℃，保持1min；30℃/min升至280℃，保持5min；详见表1。进样口温度：280℃；分流模式：不分流进样；分流流量：50.0ml/min；不分流时间：1.0min；载气模式：恒流模式；载气流速：1.0ml/min；2min后开阀，载气节省时间2min，载气节省流量20.0ml/min；进样体积：1.0μl。
表1程序升温步骤
3.2质谱条件
电离模式：电子轰击离子源(ei)；电子束能量(电离能)：70ev；碰撞气：高纯氩气(>99.999％，40psi)；离子源温度：280℃；传输线温度：280℃；溶剂延迟：5.0min；采集数据模式：全扫描(scan)和选择离子监测(sim)方式定性，选择反应监测(autosrm)方式定量。青霉素g衍生物的分子量和质谱参数见表2。
表2青霉素g衍生物的分子量和质谱参数
注：*定量离子对
4.定量方法
4.1标准曲线的绘制
分别准确称取10份(2.0±0.02)g均质好的鸡肉、鸡肝脏、鸡肾脏、鹅肉、鸭肉、鸡全蛋、鸡蛋清、鸡蛋黄、鸭全蛋、鸭蛋清、鸭蛋黄和猪肉空白样品，按2中的方法对上述空白样品进行提取和净化，制备空白样品基质提取液，备用。
分别移取适量的空白样品基质提取液将标准工作液稀释成一系列浓度，使得最终对应在空白鸡肉、鹅肉、鸭肉及猪肉中青霉素g的添加浓度为loq、15.0、25.0、50.0、100.0、150.0、200.0μg/kg；在空白鸡肝脏和鸡肾脏中青霉素g的添加浓度为loq、25.0、50.0、100.0、150.0、200.0、250.0μg/kg；在空白鸡蛋、鸭蛋(全蛋、蛋清、蛋黄)中青霉素g的添加浓度为loq、10.0、25.0、50.0、100.0、150.0、200.0μg/kg。
将上述处理的各浓度样品在优化好的gc-ms/ms方法下进行检测分析。每个浓度设置6个平行，取平均值。以青霉素g标准工作液在不同空白基质中添加浓度为横坐标(x)，青霉素g衍生产物的定量离子对m/z174.1＞114.1*的峰面积为纵坐标(y)，绘制基质标准曲线并作为待测样品的定量曲线。
由表3和附图1-12可见，青霉素g在空白禽肉、禽蛋及猪肉样品基质提取液中的添加浓度在loq～200.0μg/kg范围内，青霉素g在空白鸡肝和鸡肾样品基质提取液中的添加浓度在loq～250.0μg/kg范围内，青霉素g衍生产物的定量离子对m/z174.1＞114.1*的峰面积(y轴)与浓度(x轴)呈现良好的线性关系，其线性范围、回归方程和决定系数见表3。如果分析的浓度超过样品的线性范围，需将分析的浓度稀释至该范围内，检测出的结果乘以稀释倍数得到原样品的浓度。
表3禽组织、禽蛋及猪肉中青霉素g线性范围、回归方程和决定系数
4.2回收率及精密度的测定
准确称取(2.0±0.02)g均质好的空白样品，按2中的方法制取空白基质提取液。加入青霉素g标准工作液适量，使其最终在每个空白样品中的添加浓度为loq、0.5mrl、1.0mrl、2.0mrl，每个添加浓度设6个平行，再分别按2中的方法对空白样品进行提取、净化、浓缩及衍生化处理后，所得滤液按3描述的气相色谱和质谱分析条件下，进行gc-ms/ms检测，最终将检测结果带入空白基质标准曲线中求得浓度，与实际添加的分析物的浓度相比求得样品加标回收率。
空白鸡肉样品(a)和空白鸡肉样品添加50.0μg/kg青霉素g标准品(b)的总离子流色谱图(tic)和定量、定性离子的质量色谱图(mc)见图1；空白鸡肝脏样品(a)和空白鸡肝脏样品添加50.0μg/kg青霉素g标准品(b)的总离子流色谱图(tic)和定量、定性离子的质量色谱图(mc)见图2；空白鸡肾脏样品(a)和空白鸡肾脏样品添加50.0μg/kg青霉素g标准品(b)的总离子流色谱图(tic)和定量、定性离子的质量色谱图(mc)见图3；空白鹅肉样品(a)和空白鹅肌肉样品添加50.0μg/kg青霉素g标准品(b)的总离子流色谱图(tic)和定量、定性离子的质量色谱图(mc)见图4；空白鸭肉样品(a)和空白鸭肌肉样品添加50.0μg/kg青霉素g标准品(b)的总离子流色谱图(tic)和定量、定性离子的质量色谱图(mc)见图5；空白鸡全蛋样品(a)和空白鸡全蛋样品添加25.0μg/kg青霉素g标准品(b)的总离子流色谱图(tic)和定量、定性离子的质量色谱图(mc)见图6；空白鸡蛋清样品(a)和空白鸡蛋清样品添加25.0μg/kg青霉素g标准品(b)的总离子流色谱图(tic)和定量、定性离子的质量色谱图(mc)见图7；空白鸡蛋黄样品(a)和空白鸡蛋黄样品添加25.0μg/kg青霉素g标准品(b)的总离子流色谱图(tic)和定量、定性离子的质量色谱图(mc)见图8；空白鸭全蛋样品(a)和空白鸭全蛋样品添加25.0μg/kg青霉素g标准品(b)的总离子流色谱图(tic)和定量、定性离子的质量色谱图(mc)见图9；空白鸭蛋清样品(a)和空白鸭蛋清样品添加25.0μg/kg青霉素g标准品(b)的总离子流色谱图(tic)和定量、定性离子的质量色谱图(mc)见图10；空白鸭蛋黄样品(a)和空白鸭蛋黄样品添加25.0μg/kg青霉素g标准品(b)的总离子流色谱图(tic)和定量、定性离子的质量色谱图(mc)见图11；空白猪肉样品(a)和空白猪肉样品添加50.0μg/kg青霉素g标准品(b)的总离子流色谱图(tic)和定量、定性离子的质量色谱图(mc)见图12。
日内(批内)精密度：用同一台仪器和同一标准曲线在同一天不同时间点对上述4个添加浓度(loq、0.5mrl、1.0mrl、2.0mrl)的样品进行测定，每个添加浓度设置6个平行，计算日内rsd。
日间(批间)精密度：用同一台仪器在一周内不同天和不同标准曲线(每天都绘制标准曲线)对上述4个添加浓度(loq、0.5mrl、1.0mrl、2.0mrl)的样品进行测定，每个添加浓度设置6个平行，计算日间rsd。
在此条件下，本发明方法提取禽组织、禽蛋及猪肉中青霉素g的添加回收率及精密度见表4-5。
表4空白禽组织和猪肉中青霉素g的添加回收率和精密度(n＝6)
注：α.最高残留限量
表5空白禽蛋中青霉素g的添加回收率和精密度(n＝6)
注：α.最高残留限量
4.3检测限及定量限的确定
准确称取(2.0±0.02)g均质好的空白样品，按2中的方法制取空白基质提取液。用空白基质提取液逐级稀释低浓度的青霉素g标准工作液，按照已建立好的gc-ms/ms方法进行检测。每个浓度重复分析6次，计算信噪比(s/n)的平均值。当s/n≥3时所对应的青霉素g浓度即为检测限(lod)；当s/n≥10时所对应的青霉素g浓度即为定量限(loq)。
根据上述6个平行空白样品的添加回收试验，得到在现有条件下，青霉素g在鸡肉、鸡肝脏、鸡肾脏、鹅肉、鸭肉、鸡全蛋、鸡蛋清、鸡蛋黄、鸭全蛋、鸭蛋清、鸭蛋黄和猪肉中的lod分别为2.1、2.3、3.4、1.5、4.1、2.5、2.1、3.2、2.4、1.7、1.8、1.8μg/kg，loq分别为5.3、6.7、7.2、4.5、8.2、7.9、6.8、8.5、7.4、6.1、6.4、5.1μg/kg。
实施例2
为了能准确、高效的检测青霉素g在禽组织(鸡肉、鸡肝、鸡肾、鹅肉、鸭肉)、鸡蛋、鸭蛋(全蛋、蛋清、蛋黄)及猪肉中的残留，本发明提供了一种柱前衍生-气相色谱-串联质谱法(gc-ms/ms)检测方法。该方法定性、定量准确，回收率较高，灵敏度好。经方法学参数验证，且满足中国农业农村部和欧盟兽药残留检测要求。
将禽组织(鸡肉、鸡肝、鸡肾、鹅肉、鸭肉)、鸡蛋、鸭蛋(全蛋、蛋清、蛋黄)及猪肉样品通过加速溶剂萃取(ase)技术提取，固相萃取净化，三甲基硅烷基重氮甲烷衍生，经gc-ms/ms检测。气相色谱条件：以tg-1ms(30.0m×0.25μm×0.25mmi.d.)为毛细管色谱柱；高纯氦气(>99.999％，60psi)为载气，载气柱流速为1.0ml/min。程序升温步骤为初始温度100℃，保持1min；30℃/min升至220℃，保持1min；30℃/min升至280℃，保持5min。进样口温度为280℃；不分流进样模式；分流流量为50.0ml/min；不分流时间为1.0min；恒流模式；载气流速为1.0ml/min；2min后开阀，载气节省时间为2min，载气节省流量为20.0ml/min；进样体积：1.0μl。质谱条件：电子轰击离子源(ei)；70ev电离能；高纯氩气(>99.999％，40psi)为碰撞气；离子源温度为280℃；传输线温度为280℃；溶剂延迟时间为5.0min；以全扫描(scan)和选择离子监测(sim)方式定性，选择反应监测(autosrm)方式定量。
准确称取(2.0±0.02)g均质好的空白样品放于研钵中，加入适量硅藻土研磨，将样品研磨成小颗粒，装入22ml萃取池中，在1500psi，30℃条件下用ase提取，步骤1：正己烷去脂，静态提取5min，冲洗溶剂总量为40％，每个样品之间自动冲洗1次，氮气吹扫60s，静态提取1次，弃掉提取液；步骤2：禽组织和猪肉样品用0.2m磷酸盐缓冲溶液(ph8.0)提取，禽蛋用80％乙腈提取，其他提取条件(压力、温度、时间、冲洗溶剂总量、样品之间冲洗次数及氮气吹扫时间)与步骤1相同，静态提取2次，收集提取液于60ml收集瓶，转移至50ml离心管，待用。将上述收集的提取液经过hlb固相萃取柱(60mg/3ml)净化，先用3ml甲醇、3ml水、3ml磷酸盐缓冲液活化平衡小柱，将上样液匀速全部过柱后，依次用3ml磷酸盐缓冲液、3ml水淋洗1次，去除杂质，待淋洗液全部匀速流出后，抽干2min，最后用3ml1％甲醇乙腈分两次进行洗脱，洗脱液用10ml离心管收集。将洗脱液置于氮吹仪中35℃吹干，待用。将浓缩干后的样品用100μl乙醇复溶，涡旋混匀1min，然后加入400μltmsd，密封，在30℃烘箱中避光反应30min，反应结束后取出，乙醇定容至1.0ml，然后转移至2.0ml具塞离心管中，涡旋混匀1min，在常温下12000×g离心10min，经过0.22μm有机相针头式滤器，滤液供gc-ms/ms检测分析。
本发明中采用tg-1ms(30.0m×0.25μm×0.25mmi.d.)毛细管色谱柱，采用全扫描(scan)和选择离子监测(sim)方式定性，选择反应监测(autosrm)方式定量，最终所得青霉素g衍生产物的色谱峰峰形良好(即灵敏度高)，分析物保留时间适中，无其他杂质峰干扰。
本发明提供了一种气相色谱-串联质谱检测(gc-ms/ms)方法。本发明在分析效率、溶剂消耗、回收率、精密度、灵敏度及重现性角度，与其它检测方法相比，本方法分析效率更高、回收率、准确度和灵敏度高，重现性好，适合在批量样品分析中应用与推广。该方法能高效、准确的检测禽组织、禽蛋及猪肉中青霉素g残留，且满足中国农业农村部和欧盟兽药残留检测要求。