一种尿素测定试剂球制备方法、试剂球及检测芯片与流程

本发明涉及尿素检测
技术领域：
，特别是涉及一种尿素测定试剂球制备方法、试剂球及检测芯片。
背景技术：
：人体内氨基酸经脱氨基作用分解成α-酮酸和nh3，nh3在肝细胞内进入尿素循环与co2生成尿素。肝脏中生成的尿素经血液循环主要由肾脏排泄。在正常情况下，血液中的非蛋白氮主要是经肾小球滤过而随尿液排出。血液中非蛋白氮是指除血浆蛋白质以外的含氮化合物，如尿素、尿酸、肌酸、肌酐和氨基酸等，其中，尿素氮含量约占50％。当肾实质受损时，由于肾小球的滤过率降低，致使血中非蛋白氮浓度增加，故测定血中非蛋白氮的含量，可粗略判断肾小球的滤过功能。在肾功能不全时，由于尿素浓度增高比非蛋白氮快而明显，故尿素浓度反应肾小球滤过功能较非蛋白氮更敏感。目前，血液尿素测定是肾脏疾病的主要检测项目之一。目前，测定尿素的常用方法是先通过尿素测定试剂中的尿素酶将尿素分解产生氨，然后利用不同方法测定氨的量再换算成尿素的量。在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术中，尿素测定试剂由于热稳定性差，在存放过程中容易变质，并且能测定出的尿素的范围较窄。技术实现要素：为了克服尿素试剂热稳定性较差以及有效测定范围较窄的问题，本发明实施例提供一种尿素测定试剂球制备方法，通过该方法制备出的冻干试剂球热稳定性好且有效测定范围较宽。为了解决上述技术问题，本发明实施例提供以下技术方案：第一方面，本发明实施例提供一种尿素测定试剂球的制备方法，所述方法包括：将缓冲液、乙二胺四乙酸二钠、α-酮戊二酸、谷氨酸脱氢酶、尿素酶、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和赋形剂与水混合形成混合液，并调整所述混合液的ph值；将所述混合液的液滴滴在液氮中，使所述液滴形成冰球；将所述冰球进行冷冻干燥制得所述尿素测定试剂球；其中，所述混合液包括以下组份：缓冲液100-300mmol/l、乙二胺四乙酸二钠2-4g/l、α-酮戊二酸4-6g/l、谷氨酸脱氢酶3.00-6.00ku/l、尿素酶35.00-95.00ku/l、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸1.10-1.80g/l和赋形剂50-100g/l。可选的，所述冰球的体积为3.0-4.0ul。可选的，所述将缓冲液、乙二胺四乙酸二钠、α-酮戊二酸、谷氨酸脱氢酶、尿素酶、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和赋形剂与水混合形成混合液，并调整所述混合液的ph值，包括以下步骤：将缓冲液加入盛有水的容器中；待所述缓冲液在水中溶解完全后，往所述容器中加入乙二胺四乙酸二钠、α-酮戊二酸和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；调节所述容器中溶液的ph值至7.0；将谷氨酸脱氢酶和尿素酶加入所述容器后，再加入赋形剂。可选的，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液和三羟甲基氨基缓冲液中的至少一种。可选的，所述赋形剂包括胆酸钠、葡聚糖1万、海藻糖、甘露醇、水溶性淀粉和葡聚糖4万中的至少一种。可选的，所述缓冲液包括二水合磷酸二氢钠和十二水合磷酸氢二钠，所述赋形剂包括海藻糖和胆酸钠；所述混合液包括以下组份：二水合磷酸二氢钠9.12g/l、十二水合磷酸氢二钠44.41g/l、乙二胺四乙酸二钠3.87g/l、α-酮戊二酸4.72g/l、谷氨酸脱氢酶3.00ku/l、尿素酶35.00ku/l、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸1.10g/l、海藻糖80g/l和胆酸钠5g/l；所述冰球的体积为4.0ul。可选的，所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷，所述赋形剂包括葡聚糖4万和甘露醇；所述混合液包括以下组份：三羟甲基氨基甲烷24.2g/l、乙二胺四乙酸二钠3.87g/l、α-酮戊二酸4.72g/l、谷氨酸脱氢酶5.00ku/l、尿素酶95.00ku/l、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸1.5g/l、葡聚糖4万50g/l和甘露醇50g/l；所述冰球的体积为3.0ul。可选的，所述缓冲液包括二水合磷酸二氢钠和十二水合磷酸氢二钠，所述赋形剂包括葡聚糖1万、水溶性淀粉和甘露醇；所述混合液以下组份：二水合磷酸二氢钠9.12g/l、十二水合磷酸氢二钠44.41g/l、乙二胺四乙酸二钠3.87g/l、α-酮戊二酸4.72g/l、谷氨酸脱氢酶3.00ku/l、尿素酶95.00ku/l、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸1.10g/l、葡聚糖1万10g/l、水溶性淀粉20g/l和甘露醇60g/l；所述冰球的体积为3.5ul。第二方面，本发明实施例还提供一种应用本发明第一方面提供的尿素测定试剂球的制备方法制备得到的尿素测定试剂球。第三方面，本发明实施例还提供一种尿素检测芯片，所述尿素检测芯片包括芯片本体和本发明第二方面提供的尿素测定试剂球，其中，所述尿素测定试剂球设置于所述芯片本体内部。本发明实施方式的有益效果是：区别于现有技术的情况，本发明实施例提供了一种尿素测定试剂球的制备方法，该方法是将一定剂量的缓冲液、乙二胺四乙酸二钠、α-酮戊二酸、谷氨酸脱氢酶、尿素酶、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和赋形剂与水混合形成混合液，并将混合液滴在液氮中，使液滴形成冰球，再将冰球进行冷冻干燥制得球形的尿素测定试剂球。通过该方法制备出的尿素测定试剂球热稳定性好，37度高温条件下可保存8天，存储过程中不易变质，对尿素的有效测试范围较宽，并且可测试尿素的最高浓度高达35mmol/l。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本发明一实施例提供的尿素试剂球的制备方法流程图。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。需要说明的是，如果不冲突，本发明实施例中的各个特征可以相互组合，均在本发明的保护范围之内。另外，虽然在装置示意图中进行了功能模块的划分，在流程图中示出了逻辑顺序，但是在某些情况下，可以以不同于装置示意图中的模块划分，或流程图中的顺序执行所示出或描述的步骤。除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的
技术领域：
的技术人员通常理解的含义相同。本说明书中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是用于限制本发明。本说明书所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。本发明实施例提供一种尿素测定试剂球的制备方法，能够制备出球形的尿素测定试剂，请参阅图1，该方法包括如下步骤：s11、将缓冲液、乙二胺四乙酸二钠、α-酮戊二酸、谷氨酸脱氢酶、尿素酶、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和赋形剂与水混合形成混合液，并调整所述混合液的ph值；具体的，量取一定体积的将缓冲液加入盛有800ml水的容器中；待缓冲液在水中溶解完全后，往容器中加入一定量的乙二胺四乙酸二钠、α-酮戊二酸和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；调节容器中溶液的ph值至7.0后，将谷氨酸脱氢酶和尿素酶加入容器中，再加入赋形剂；最后将水加入到容器中，以将容器中溶液的体积调整为1l。在一些实施例中，缓冲液可以是磷酸盐和三羟甲基氨基缓冲液(tris缓冲液)中的至少一种。赋形剂能够赋予冻干药品良好的外观，使冻干药品疏松，易于复溶。赋形剂主要包括多元醇类、糖类，氨基酸类、无机盐类以及蛋白质和肽类赋形剂，其中，多元醇类赋形剂包括甘油、山梨醇、甘露醇、肌醇、侧金盏花醇、乙二醇和聚乙二醇等；糖类赋形剂包括葡聚糖(例如，葡聚糖1万和葡聚糖4万)、麦芽糊精、水溶性淀粉、海藻糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖和葡萄糖等；氨基酸类赋形剂包括：谷氨酸钠、脯氨酸、赖氨酸和丙氨酸等；无机盐类赋形剂包括：磷酸盐、碳酸钙、硫酸锰、胆酸钠和乙酸钠等；蛋白质和肽类赋形剂包括粘多糖蛋白、酪蛋白，牛血清蛋白等。具体的混合液包括以下组份：缓冲液100-300mmol/l、乙二胺四乙酸二钠2-4g/l、α-酮戊二酸4-6g/l、谷氨酸脱氢酶3.00-6.00ku/l、尿素酶35.00-95.00ku/l、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸1.10-1.80g/l和赋形剂50-100g/l。s12、将所述混合液的液滴滴在液氮中，使所述液滴形成冰球；本实施例中，可以通过点胶机将混合液的液滴滴在液氮中，使液滴在液氮中凝结成冰球。本领域技术人员可以根据实际需要调整滴入液氮中的混合液的液滴的大小，并通过控制液滴的大小来调整冰球的体积。可选的，在一些实施例中，冰球的体积为3.0-4.0ul。s13、将所述冰球进行冷冻干燥制得所述尿素测定试剂球；本实施例中，将冰球置于真空冷冻干燥机进行冷冻干燥，获得尿素测定试剂球，待氮气复压后将尿素测定试剂球收集并保存在干燥的铝瓶中。冷冻干燥是指将含水药品预先进行降温冻结成固体，在低温减压条件下利用水的升华性能，使物质低温脱水而达到干燥目的的一种干燥方法。冷冻干燥后，药品本身留在冻结时的冰架中，因此冷冻干燥后的药品疏松多孔且体积不变，由于药品干燥前始终处于冻结状态，同时冰晶均匀分布于物质中，升华过程不会因脱水而发生浓缩现象。冷冻干燥后的物质呈海绵状疏松多孔，体积基本与干燥前保持不变，极易溶于水而恢复原状。现有技术中，常用的尿素测定试剂中的赋形剂的含量较低，通常不超过10g/l，而在本发明实施例中，为了制备出球形的尿素测定试剂球，采用较高含量(50-100g/l)的赋形剂。本发明实施例提供的尿素测定试剂球的制备方法通过先将反应试剂的液滴冻成冰球，再将冰球进行冷冻干燥制备尿素测定试剂球，制备出的尿素测定试剂球均一性好，该方法适用于尿素测定试剂球的大批量生产。本发明实施例提供的尿素测定试剂球的检测原理如下：尿素测定试剂或冻干试剂球中的尿素在尿素酶的作用下水解成nh4+和二氧化碳，在谷氨酸脱氢酶作用下，nh4+和α-酮戊二酸结合生成谷氨酸，同时，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸被氧化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，从而引起在340nm波长处吸光度下降，并且吸光度下降的速率与尿素含量成正比。因此，通过检测340nm处吸光度下降的速率，可以计算出样品中尿素的浓度。本发明实施例还提供一种尿素检测芯片，该尿素检测芯片包括芯片本体和本发明任一实施例提供的尿素测定试剂球。在一些实施例中，芯片本体由注塑成型的塑料基底和光学膜通过粘结胶层粘贴而成，芯片本体包括样本槽、稀释液槽、定量槽、混合槽、废液槽、液流通道和比色孔等结构。芯片本体还包括多个可存放尿素检测试剂球的比色孔，检测样本进入比色孔后与尿素检测试剂球发生化学反应。使用尿素检测芯片进行检测时无需对样本进行离心等预处理即可进行检测，因而血清、血浆或全血都可用于检测。通常经静脉穿刺获得血样本可在采集后60min内进行分析，而指尖末梢血样本应在采集后立即进行分析。使用移液器将样本经尿素检测芯片的样本孔加入至芯片的样本槽中，芯片自带稀释液与样本混匀后进行测试。其中，检测用的稀释液为蒸馏水。为进一步阐述本发明的技术方案，以下提供本发明的尿素测定试剂制备方法的若干实施例。实施例1：本实施例中，缓冲液包括二水合磷酸二氢钠和十二水合磷酸氢二钠组成，赋形剂包括海藻糖和胆酸钠组成。尿素测定试剂球的制备方法如下：将一定量的二水合磷酸二氢钠缓冲液、十二水合磷酸氢二钠缓冲液、乙二胺四乙酸二钠、α-酮戊二酸、谷氨酸脱氢酶、尿素酶、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、海藻糖和胆酸钠与水混合形成混合液，并调整所述混合液的ph值至7.0；将混合液的液滴滴在液氮中形成冰球体积约为4.0ul的冰球；将冰球进行冷冻干燥制得所述尿素测定试剂球。并采用该尿素测定试剂球制得尿素检测芯片。具体的，本实施例中的混合液包括以下组份：二水合磷酸二氢钠9.12g/l、十二水合磷酸氢二钠44.41g/l、乙二胺四乙酸二钠3.87g/l、α-酮戊二酸4.72g/l、谷氨酸脱氢酶3.00ku/l、尿素酶35.00ku/l、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸1.10g/l、海藻糖80g/l和胆酸钠5g/l。实施例2：本实施例中，缓冲液为三羟甲基氨基甲烷，赋形剂包括葡聚糖4万和甘露醇。尿素测定试剂球的制备方法如下：将一定量三羟甲基氨基甲烷缓冲液、乙二胺四乙酸二钠、α-酮戊二酸、谷氨酸脱氢酶、尿素酶、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、葡聚糖4万和甘露醇与水混合形成混合液，并调整所述混合液的ph值至7.0；将混合液的液滴滴在液氮中形成冰球体积约为3.0ul的冰球；将冰球进行冷冻干燥制得所述尿素测定试剂球。并采用该尿素测定试剂球制得尿素检测芯片。具体的，本实施例中的混合液包括以下组份：三羟甲基氨基甲烷24.2g/l、乙二胺四乙酸二钠3.87g/l、α-酮戊二酸4.72g/l、谷氨酸脱氢酶5.00ku/l、尿素酶95.00ku/l、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸1.5g/l、葡聚糖4万50g/l和甘露醇50g/l。实施例3：所述缓冲液包括二水合磷酸二氢钠和十二水合磷酸氢二钠，所述赋形剂包括葡聚糖1万、水溶性淀粉和甘露醇；将一定量二水合磷酸二氢钠和十二水合磷酸氢二钠缓冲液、乙二胺四乙酸二钠、α-酮戊二酸、谷氨酸脱氢酶、尿素酶、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、葡聚糖1万、水溶性淀粉和甘露醇与水混合形成混合液，并调整所述混合液的ph值至7.0；将混合液的液滴滴在液氮中形成冰球体积约为3.5ul的冰球；将冰球进行冷冻干燥制得所述尿素测定试剂球。并采用该尿素测定试剂球制得尿素检测芯片。本实施例中的混合液包括以下组份：二水合磷酸二氢钠9.12g/l、十二水合磷酸氢二钠44.41g/l、乙二胺四乙酸二钠3.87g/l、α-酮戊二酸4.72g/l、谷氨酸脱氢酶3.00ku/l、尿素酶95.00ku/l、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸1.10g/l、葡聚糖1万10g/l、水溶性淀粉20g/l和甘露醇60g/l。下面结合表格对本发明实施例1制得的尿素测定试剂球(或尿素检测芯片)的性能进行说明。本发明是通过深圳市锦瑞生物有限公司生产的vp10便携式生化分析仪检测37℃下注入血清样本的检测芯片在340nm波长吸光度的变化值。使用英国朗道公司提供的校准品进行定标，可计算得到血清样本中尿素的浓度。1)、精密度测试：采用本发明实施例1提供的尿素检测芯片测试已知尿素浓度为21.6mmol/l的血清样本中的尿素浓度20次，并通过以下公式计算测得浓度值的平均值标准差(sd)和变异系数(cv)：其中，xi为第i次测得浓度值，n为测试次数。得到测试同一血清样本20次获得的测得浓度值的平均值＝21.57mmol/l，标准差sd＝0.365，变异系数cv＝1.69％。通常，若标准差较大，代表大部分测试结果和其平均值之间差异较大；若标准差较小，则代表这些测试结果较接近平均值。2)、准确度测试：采用本发明实施例1提供的尿素检测芯片测试已知尿素浓度为7.26mmol/l的血清样本三次，获取测得的尿素浓度值，计算出3次测得尿素浓度值的平均值为7.31mmol/l，相对偏差为0.69％。3)、临床相关性分析：采用本发明实施例1提供的尿素检测芯片与abaxis试剂盘同时检测对多个不同尿素浓度的血清样本的尿素含量。相应的测得尿素浓度值(单位mmol/l)如表一所示，表一中，x列数值为abaxis试剂盘测得的血清样品中的尿素浓度，y列数值为本发明实施例1提供的尿素检测芯片测得的血清样品中的尿素浓度。例如，对于1号血清样本，采用为abaxis试剂盘测试的尿素浓度为15.2mmol/l，而采用本发明实施例1提供的尿素检测芯片测试的1号血清样本中的尿素浓度为16.2mmol/l。表一通过表一中的数据可以得到本发明实施例提供的尿素检测芯片与abaxis试剂盘的两组测试结果之间的相关方程如下：y＝0.9952x+0.4232相关系数r＝0.9981，相关系数越接近1代表两组数据之间的相关性越强。因此，本发明实施例提供的尿素检测芯片与abaxis试剂盘的测试结果相关性强。4)、线性范围测试测试方法如下：用接近线性范围上限的高浓度(活性)样本和接近线性范围下限的低浓度(活性)样本，按表二所示混合成6个稀释浓度的血清样本。表二样本号123456高浓度(活性)血清样本0份1份2份3份4份5份低浓度(活性)样本5份4份3份2份1份0份采用本发明实施例1提供的尿素检测芯片分别测试6个血清样本的尿素浓度，每个血清样本测试3次，分别求出6个血清样本中尿素测得浓度值的平均值(yi)。以每个样本稀释后的浓度(xi)为自变量，以每个样本的测得浓度值均值(yi)为因变量求出线性回归方程。按公式(4)计算线性回归的相关系数r；其中，n为测定样品的数量，xi为稀释浓度，yi为测定结果的平均值。用稀释浓度(xi)代入线性回归方程，计算yi的估计值及yi与估计值的相对偏差或绝对偏差。通常，要求在[0.2，35.0]mmol/l区间内，其线性相关系数r≥0.990。同时，相对偏差或绝对偏差应符合表三中的要求。表三尿素浓度范围(mmol/l)相对偏差(b)绝对偏差(d)[0.2，3.0]--±0.5mmol//l(3.0，35.0]±10.0％--表四为表二中1号至6号血清样本稀释后尿素的实际浓度和采用本发明实施例1提供的尿素检测芯片对1号至6号血清样本进行检测后测得的测试浓度值和分析结果。表四5)、热稳定性测试在8％空气湿度环境中，将本发明实施例1提供的尿素检测试剂球装入芯片本体内形成多个检测芯片，并包装袋进行密封。将多个检测芯片在37℃避光环境中贮存0、2、3、4、6和8天后，分别对英国朗道公司提供的两组质控品(样本1和样本2)中的尿素浓度进行多次检测，以分析多次检测的结果的平均值和相对偏差(单位为mmol/l)，从而分析检测芯片的检测准确度。为了确保检测结果的准确度，相对偏差的绝对值应在10.0％以内。表5和表6分别为存储不同时间后的检测芯片对样本1和样本2中尿素浓度检测3次的检测结果，以及计算出的检测结果的平均值和相对偏差，其中，靶值为样本1和样本2中尿素的实际浓度。从表5和表6中可以看出，本发明实施例提供的检测芯片在环境中储存2、3、4、6或8天后，相对偏差的绝对值仍在10.0％以内，因此，本实施例提供的检测芯片热稳定性好，在环境中储存多天后仍能确保其检测结果的准确性。表5：样本1123平均值靶值相对偏差0天21.720.921.321.3321.30.15％2天20.020.020.920.3221.3-4.60％3天20.119.920.520.1621.3-5.35％4天20.219.219.519.6721.3-7.65％6天19.619.519.919.6621.3-7.70％8天19.019.319.619.2821.3-9.49％表6现有的尿素检测试剂由于还原性辅酶的浓度太高而导致初始吸光度太高，超出仪器检测范围，通常试剂测试线性范围窄，最高浓度仅能测到20mmol/l，而本发明实施例提供尿素测定试剂球制备方法制备出的尿素检测试剂球有效测试范围较宽，对尿素浓度在[0.2，35.0]mmol/l区间内的血清样本均具有较好的检测效果。并且，本发明实施例提供的尿素检测试剂球热稳定性好，在存储过程中不易变质。最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明，它们没有在细节中提供；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。当前第1页12