本发明设计的一种掺杂二茂铁甲酸的zif-8猝灭rusi纳米微粒检测降钙素原的电化学发光传感器，具体是以rusinps@g-c3n4为发光材料，二茂铁甲酸/zif-8为猝灭剂，制备一种检测降钙素原的猝灭型电化学发光传感器，属于电化学发光检测技术领域。
背景技术：
在全世界，每年都会有超过数十万的人死于败血症，它是一种由细菌、真菌等感染引起的全身炎症反应，被看作威胁生命健康的疾病。在健康人体中降钙素原的浓度是极低的，但是在败血症患者体中降钙素原的浓度极高，研究表明，降钙素原反映了全身炎症反应的活跃程度，已被探索作为败血症可靠的预后和治疗指标。由此可见，对于人体内降钙素原开发一种新颖灵敏的免疫测定方法是非常有意义的。
近年来，电化学发光ecl作为一种高灵敏度和高选择性的分析方法引起人们极大的研究兴趣。电化学发光是指通过电化学方法产生电生物质，然后这些电生物质之间或电生物质与其它物质之间反应产生的一种发光现象，它是化学发光方法与电化学方法相结合的产物。电化学发光分析具有灵敏度高，线性范围宽；分析速度快，应用范围广；有利于研究快速发光反应和发光反应机理等优势，已经发展为分析化学的一门分支学科。
ru(bpy)32+作为一种常见的电化学发光试剂，具有良好的电化学稳定性、高发射率和良好的水溶性，可用于多种分析和生物传感器。然而，ru(bpy)32+价格偏贵，并且自身不能产生足够强的电化学发光信号以满足痕量分析的需求，因此将其与二氧化硅纳米粒子结合并且负载在g-c3n4上来提高电化学发光信号就显得尤为重要。zif-8作为一类纳米材料，具有规则的结构和丰富的表面官能团，二茂铁甲酸与ru(bpy)32+之间存在能量转移，由此可以产生猝灭现象，从而降低发光信号以满足痕量分析的需求，实现了二茂铁甲酸/zif-8猝灭rusi纳米微粒发光的电化学发光传感器的构建。
技术实现要素：
本发明设计了一种猝灭型的电化学发光免疫传感器用于降钙素原的检测。
在本发明中，二氧化硅纳米微粒具有较大的比表面积和丰富的表面官能团，易于连接和负载，可以固载ru(bpy)32+和作为共反应剂的n-丁基二乙醇胺，同时，g-c3n4作为一种导电性好的半导体材料，作为载体可以提供更好地电子空穴，两者结合，使得rusinps@g-c3n4具有优异的发光性能。n-丁基二乙醇胺与三丙胺作用形同，作为共反应剂与ru(bpy)32+发生氧化还原反应，使得ru2+被氧化ru3+，然后再因为还原剂的存在还原成ru2+，产生ecl发光，但是在整个实验过程中并没有将共反应剂单独加入，而是选择加入到发光材料中，使得整个发光过程在电极表面完成。为了灵敏的检测降钙素原，采用二茂铁甲酸/zif-8作为猝灭剂，降低rusinps@g-c3n4的发光强度，二茂铁甲酸/zif-8的紫外可见吸收峰与rusinps@g-c3n4的荧光发射峰具有波谱重叠，即存在能量转移，能够降低rusinps@g-c3n4的发光强度，实现rusinps@g-c3n4的电化学性能猝灭，当电极表面含有不同浓度的降钙素原时，不同量的二抗-二茂铁甲酸/zif-8将会结合在电极表面，引起ecl信号的不同程度的降低，达到检测目的。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
1.一种掺杂二茂铁甲酸的zif-8猝灭rusi纳米微粒检测降钙素原的电化学发光传感器的制备方法，制备步骤如下：
（1）使用洗衣粉，乙醇，丙酮，超纯水分别对分割好的ito玻璃进行超声处理，使ito玻璃表面清洁无污；
（2）将6µl5~10mg/mlrusinps@g-c3n4的壳聚糖溶液滴涂到ito玻璃表面，室温保存至干燥；
（3）滴涂5µl500µg/ml一抗溶液于玻璃表面，4ºc冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；
（4）滴涂3µl质量分数为1%的牛血清白蛋白，封闭非特异性活性位点，4ºc冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；
（5）将6µl不同浓度的降钙素原滴涂在玻璃表面，4ºc冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；
（6）将5µl1～5mg/ml二抗-二茂铁甲酸/zif-8液滴涂在玻璃表面，4ºc冰箱中保存至干燥，超纯水清洗，即制得检测降钙素原的电化学发光生物传感器。
2.本发明所述的一种掺杂二茂铁甲酸的zif-8猝灭rusi纳米微粒检测降钙素原的电化学发光传感器的制备方法，所述的rusinps@g-c3n4壳聚糖溶液制备步骤如下：
将5g三聚氰胺充分研磨，然后放入带盖的陶瓷坩埚中，在马弗炉中550ºc下加热4小时，将得到的产物研磨成粉末，然后溶解于100ml12mol/l的hno3中超声3小时，在125ºc下回流24小时，然后将回流的产物用超纯水洗涤至中性，将产物在60ºc真空干燥箱中干燥，得到g-c3n4.
将5~10mgg-c3n4加入到7.5ml环己烷中，超声至g-c3n4完全分散，然后将1.77ml曲拉通x-100，1.8ml正己醇，200μln-丁基二乙醇胺和340μlru(bpy)32+混合，然后加入100μl正硅酸乙酯，60μl氨水，形成乳化反应，该反应在磁性搅拌下持续24h后，加入丙酮破坏乳化反应使反应物结束，将所得溶液离心，收集沉淀用超纯水和乙醇洗涤，60ºc烘干，实现了rusinps@g-c3n4的制备；
称取5mgrusinps@g-c3n4溶解于1ml的壳聚糖溶液中，制得rusinps@g-c3n4壳聚糖溶液；所述质量分数为0.5%的壳聚糖溶液，是将0.5g壳聚糖加入到100ml体积分数为1%的乙酸中，搅拌2h制得。
3.本发明所述的一种掺杂二茂铁甲酸的zif-8猝灭rusi纳米微粒检测降钙素原的电化学发光传感器的制备方法，所述的二抗-二茂铁甲酸/zif-8，制备步骤如下：
（1）二茂铁甲酸/zif-8的制备
将1ml2-甲基咪唑与10~20mg二茂铁甲酸混合，然后加入到1ml20mm乙酸锌溶液中搅拌4h，最后，将得到的二茂铁甲酸/zif-8离心、洗涤，真空干燥；
（2）二抗-二茂铁甲酸/zif-8的制备
通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺活化zif-8表面的羧基与二抗表面的氨基反应，将抗体固定在二茂铁甲酸/zif-8的表面，将5mg二茂铁甲酸/zif-8分散在1mlph7.4磷酸盐缓冲溶液中，超声30min，然后，加入500μl100mm1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和500μl400mmn-羟基琥珀酰亚胺，搅拌1h，再将1ml500μg/ml二抗溶液加入到上述溶液中，4ºc搅拌6h，最后，加入100μl1%bsa封闭非特异性位点，离心得到二抗-二茂铁甲酸/zif-8，将其分散1ml在磷酸盐缓冲溶液（ph=7.4）中，保存在4ºc冰箱中待用。
4.本发明所述的一种掺杂二茂铁甲酸的zif-8猝灭rusi纳米微粒检测降钙素原的电化学发光传感器的制备方法，用于降钙素原的检测，步骤如下：
（1）将参比电极-ag/agcl电极、对电极-铂电极、所制得的电化学发光传感器作为工作电极，连接在化学发光检测仪的暗盒中，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起，光
电倍增管的高压设置为850v，扫描电压设置为0～1.2v，扫速设置为0.10v/s；
（2）使用磷酸盐缓冲溶液，通过电化学发光法检测不同浓度的降钙素原产生的电化学发光信号强度；
所述磷酸盐缓冲溶液，其ph=5.0～8.5，是用1/15mol/lna2hpo4和1/15mol/lkh2po4
配制；
（3）根据所得的电化学发光强度值与降钙素原浓度对数的线性关系，绘制工作曲线。
本发明的有益成果
(1)本发明合成了rusinps@g-c3n4纳米复合材料，提高了传感器的灵敏度和发光效率；合成了具有猝灭效果的二茂铁甲酸/zif-8，满足了痕量分析的需求；
(2)本发明成功的构建了将共反应剂加入发光材料中，使得发光过程在电极表面进行的过程；
(3)本发明采用二茂铁甲酸/zif-8作为猝灭剂，降低rusinps@g-c3n4的发光强度，二茂铁甲酸/zif-8的紫外可见吸收峰的与rusinps@g-c3n4的荧光发射峰具有波谱重叠，即存在能量转移，能够降低rusinps@g-c3n4的发光强度，实现rusinps@g-c3n4的电化学性能猝灭；
(4)本发明制备的猝灭型电化学发光传感器用于降钙素原的检测，发光物质用量少，响应时间短，可以实现简单、快速和高灵敏检测。通过构建的电化学发光传感器实现了对降钙素原的高灵敏检测，检测结果具有优异的重现性和稳定性，检测的线性范围为5pg/ml-100ng/ml，检测限为1.5pg/ml。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述，本发明保护范围不仅局限于实施例，该领域专业人员对本发明技术方案所作的改变均属于本发明保护范围。
实施例1制备rusinps@g-c3n4壳聚糖溶液；
将5g三聚氰胺充分研磨，然后放入带盖的陶瓷坩埚中，在马弗炉中550ºc下加热4小时，将得到的产物研磨成粉末，然后溶解于100ml12mol/l的hno3中超声3小时，在125ºc下回流24小时，然后将回流的产物用超纯水洗涤至中性，将产物在60ºc真空干燥箱中干燥，得到g-c3n4；
将5mgg-c3n4加入到7.5ml环己烷中，超声至g-c3n4完全分散，然后将1.77ml曲拉通x-100，1.8ml正己醇，200μln-丁基二乙醇胺和340μlru(bpy)32+混合，然后加入100μl正硅酸乙酯，60μl氨水，形成乳化反应，该反应在磁性搅拌下持续24h后，加入丙酮破坏乳化反应使反应物结束，将所得溶液离心，收集沉淀用超纯水和乙醇洗涤，60ºc烘干，实现了rusinps@g-c3n4的制备；
称取5mgrusinps@g-c3n4溶解于1ml的壳聚糖溶液中，制得rusinps@g-c3n4壳聚糖溶液；所述质量分数为0.5%的壳聚糖溶液，是将0.5g壳聚糖加入到100ml体积分数为1%的乙酸中，搅拌2h制得。
实施例2制备rusinps@g-c3n4壳聚糖溶液
将5g三聚氰胺充分研磨，然后放入带盖的陶瓷坩埚中，在马弗炉中550ºc下加热4小时，将得到的产物研磨成粉末，然后溶解于100ml12mol/l的hno3中超声3小时，在125ºc下回流24小时，然后将回流的产物用超纯水洗涤至中性，将产物在60ºc真空干燥箱中干燥，得到g-c3n4.
将10mgg-c3n4加入到7.5ml环己烷中，超声至g-c3n4完全分散，然后将1.77ml曲拉通x-100，1.8ml正己醇，200μln-丁基二乙醇胺和340μlru(bpy)32+混合，然后加入100μl正硅酸乙酯，60μl氨水，形成乳化反应，该反应在磁性搅拌下持续24h后，加入丙酮破坏乳化反应使反应物结束，将所得溶液离心，收集沉淀用超纯水和乙醇洗涤，60ºc烘干，实现了rusinps@g-c3n4的制备；
称取5mgrusinps@g-c3n4溶解于1ml的壳聚糖溶液中，制得rusinps@g-c3n4壳聚糖溶液；
所述质量分数为0.5%的壳聚糖溶液，是将0.5g壳聚糖加入到100ml体积分数为1%的乙酸中，搅拌2h制得。
实施例3制备二抗-二茂铁甲酸/zif-8
（1）二茂铁甲酸/zif-8的制备
将1ml2-甲基咪唑与10~20mg二茂铁甲酸混合，然后加入到1ml20mm乙酸锌溶液中搅拌4h，最后，将得到的二茂铁甲酸/zif-8离心、洗涤，真空干燥；
（2）二抗-二茂铁甲酸/zif-8的制备
通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺活化zif-8表面的羧基与二抗表面的氨基反应，将抗体固定在二茂铁甲酸/zif-8的表面，将5mg二茂铁甲酸/zif-8分散在1mlph7.4磷酸盐缓冲溶液中，超声30min，然后，加入500μl100mm1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和500μl400mmn-羟基琥珀酰亚胺，搅拌1h，再将1ml500μg/ml二抗溶液加入到上述溶液中，4ºc搅拌6h，最后，加入100μl1%bsa封闭非特异性位点，离心得到二抗-二茂铁甲酸/zif-8，将其分散1ml在磷酸盐缓冲溶液（ph=7.4）中，保存在4ºc冰箱中待用。
实施例4制备检测降钙素原的电化学发光传感器
（1）使用洗衣粉，乙醇，丙酮，超纯水分别对分割好的ito玻璃进行超声处理，使ito玻璃表面清洁无污；
（2）将6µl5mg/mlrusinps@g-c3n4的壳聚糖溶液滴涂到ito玻璃表面，室温保存至干燥；
（3）滴涂5µl500µg/ml一抗溶液于玻璃表面，4ºc冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；
（4）滴涂3µl质量分数为1%的牛血清白蛋白，封闭非特异性活性位点，4ºc冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；
（5）将6µl不同浓度的降钙素原滴涂在玻璃表面，4ºc冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；
（6）将5µl1mg/ml二抗-二茂铁甲酸/zif-8液滴涂在玻璃表面，4ºc冰箱中保存至干燥，超纯水清洗，即制得检测降钙素原的电化学发光生物传感器。
实施例5制备检测降钙素原的电化学发光传感器
（1）使用洗衣粉，乙醇，丙酮，超纯水分别对分割好的ito玻璃进行超声处理，使ito玻璃表面清洁无污；
（2）将6µl5mg/mlrusinps@g-c3n4的壳聚糖溶液滴涂到ito玻璃表面，室温保存至干燥；
（3）滴涂5µl500µg/ml一抗溶液于玻璃表面，4ºc冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；
（4）滴涂3µl质量分数为1%的牛血清白蛋白，封闭非特异性活性位点，4ºc冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；
（5）将6µl不同浓度的降钙素原滴涂在玻璃表面，4ºc冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；
（6）将5µl5mg/ml二抗-二茂铁甲酸/zif-8液滴涂在玻璃表面，4ºc冰箱中保存至干燥，超纯水清洗，即制得检测降钙素原的电化学发光生物传感器。
实施例6降钙素原的检测方法
（1）将参比电极-ag/agcl电极、对电极-铂电极、所制得的电化学发光传感器作为工作电极，连接在化学发光检测仪的暗盒中，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起，光
电倍增管的高压设置为850v，扫描电压设置为0～1.2v，扫速设置为0.10v/s；
（2）使用磷酸盐缓冲溶液，通过电化学发光法检测不同浓度的降钙素原产生的电化学发光信号强度；
所述磷酸盐缓冲溶液，其ph=6.0，是用1/15mol/lna2hpo4和1/15mol/lkh2po4
配制；
（3）根据所得的电化学发光强度值与降钙素原浓度对数的线性关系，绘制工作曲线。
实施例7降钙素原的检测方法
（1）将参比电极-ag/agcl电极、对电极-铂电极、所制得的电化学发光传感器作为工作电极，连接在化学发光检测仪的暗盒中，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起，光电倍增管的高压设置为850v，扫描电压设置为0～1.2v，扫速设置为0.10v/s；
（2）使用磷酸盐缓冲溶液，通过电化学发光法检测不同浓度的降钙素原产生的电化学发光信号强度；
所述磷酸盐缓冲溶液，其ph=8.5，是用1/15mol/lna2hpo4和1/15mol/lkh2po4
配制。
实施例8血清中降钙素原的检测
向稀释的血清中加入不同浓度的降钙素原，采用标准加入法测定样品中降钙素原的平
均回收率，结果见表1；
表1.标准加入法检测样品中的降钙素原
表1检测结果可以看出，样品中降钙素原检测结果的回收率为99.7～120%，表明本发明可以应用于实际生物样品的检测，结果准确可靠。