本发明属于蛋白免疫印迹检测领域。
背景技术：
免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹(westernblotting)，是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法，主要包括如下步骤：1)蛋白样品凝胶电泳；2)转膜：通过电流将凝胶内的蛋白转移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidenefluoride，pvdf)膜上；3)洗脱：洗去未结合的蛋白；4)封闭：将未结合蛋白的pvdf膜位点结合封闭剂(例如牛乳蛋白)，阻止后续步骤一抗非特异性结合pvdf膜；5)洗脱：洗去未结合封闭剂；6)一抗孵育：将目标蛋白特异性抗体(即一抗)结合到膜上的蛋白；7)洗脱：洗去未结合一抗；8)二抗孵育：将靶向前述一抗的抗体(即二抗)结合到一抗上，二抗上结合有化学发光或酶标记物；9)洗脱：洗去未结合二抗；10)显色：加入发光底物，与二抗上的标记物反应，产生光学信号。在免疫印迹实验中，特别是需要同时进行多个目的蛋白检测时，一般需要在转膜前和/或转膜后对pvdf膜进行标记，以往通过对膜进行不同剪切而达到标记效果，但标记信息受限，不易区分。由于pvdf膜的高疏水性，使用前需要在乙醇等有机溶液中浸泡达活化后使用，之后在转膜、孵育、洗脱、显色等过程中需要多种无机溶剂洗涤，因此很难选择含合适溶剂的笔进行标记。日常生活中常用的中性笔墨水的成分是有机溶剂，如醇类、有机醚类。而圆珠笔油墨中所用染料为油溶性染料和醇溶性染料，标记方式欲充分排除墨水的污染和有效避免有机溶剂、无机溶剂的洗涤较难。日常生活中使用的铅笔也很难作为标记笔，笔尖太细易划破膜，笔尖太粗不易标记。
目前缺少一种行之有效的pvdf膜的标记方法。
另外，作为免疫印迹的关键步骤之一，抗体孵育方式至关重要，特别是一抗的孵育。低温(2-8℃，通常为4℃，下同)过夜孵育和37℃1-2h孵育是一抗孵育的常见方式，其中低温过夜孵育在大多数时候效果更佳。静置的孵育往往不够充分和均匀，影响结果的准确性；而经摇床缓慢摇动可达到充分孵育效果，但由于目前摇床普遍体积大，在冰箱中不宜放置。
目前缺少一种可在冰箱内进行的非静置的一抗孵育方法。
目前免疫印迹中还缺少对洗脱、显色的规范化要求，洗脱、显色效率高低不一。
技术实现要素：
本发明要解决的问题是：提供一种有效的免疫印迹pvdf膜的标记方法和一抗孵育方法和洗脱、显色方法。
本发明的技术方案如下：
一种pvdf膜的标记方法，它是手持无墨中性笔隔着不透水薄膜对pvdf膜进行书写标记。
如前述的方法，所述不透水薄膜使pe薄膜。
如前述的方法，所述pe薄膜是pe手套。
一种一抗孵育方法，它是在将pvdf膜和一抗溶液共同置于bd管中，再将bd管置于crystal试管旋转混匀器，保持试管旋转12-16h，期间的环境温度为4℃。
如前述的方法，所述环境温度为4℃孵育12-16h。
一种免疫印迹的洗脱方法，保持pvdf膜的样品面朝上，浸泡于tbs/tbst缓冲液中，摇床摇晃洗脱。
术语“样品面”，即载有蛋白样品的一面，即转膜时直接接触page胶的面。
一种免疫印迹的显色方法，包括如下步骤：pvdf膜经显色液孵育后，保持pvdf膜的样品面朝上，进行显色曝光。
一种免疫印迹方法，包括如下步骤：
1)电泳：蛋白样品进行sds-page凝胶电泳；
2)标记：用权利要求1～3任一所述方法对pvdf膜标记；
3)转膜：将电泳凝胶与pvdf膜贴合，两边均堆叠滤纸和海绵，在缓冲液中加电压进行转膜；
4)转膜后标记：用权利要求1～3任一所述方法对pvdf膜标记；
5)洗脱：用前述洗脱方法将pvdf膜浸泡于tbs中进行洗脱；
6)封闭：用封闭液对膜进行封闭；
7)洗脱：用前述洗脱方法将pvdf膜浸泡于tbst中进行洗脱；
8)一抗孵育：用权利要求4或5任一所述方法进行孵育；
9)洗脱：用前述洗脱方法将pvdf膜浸泡于tbst中进行洗脱；
10)二抗孵育：摇床上用二抗在室温下孵育；
11)洗脱：用前述洗脱方法将pvdf膜浸泡于tbst中进行洗脱；
12)显色：用前述显色方法将pvdf膜进行曝光显色。
本发明的pvdf膜标记方法留下的笔迹不受甲醇和缓冲液的影响，长时间保持清晰，且不会干扰蛋白产生的印迹信号。本发明的一抗孵育方法能提高一抗孵育效率，提升显色质量。本发明的洗脱、显色方法能提高洗涤效率，提升显色质量。
本发明免疫印迹方法，整合了前述的pvdf膜标记方法、一抗孵育方法，以及洗脱、显色方法，其显色信号十分清晰，对蛋白检测尤其是微量蛋白的检测具有重要意义。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1：转膜前对pvdf膜标记对比。转膜前，采用无墨中性笔、铅笔、中性笔和圆珠笔分别对pvdf膜进行标记，甲醇浸泡3-5秒，观察标记情况。
图2：转膜后对pvdf膜标记对比。转膜后，采用无墨中性笔、铅笔、中性笔和圆珠笔分别对pvdf膜进行标记，tbst洗涤10分钟，观察标记情况。
图3：不同笔对pvdf膜标记后对免疫印迹曝光显色信号的影响。
图4：旋转混匀器一抗孵育和静止一抗孵育对比。分别采用旋转混匀器和静止孵育(pvdf膜浸泡在一抗中静止孵育)两种孵育方式4℃一抗孵育过夜，进行免疫印迹。
图5：样品面朝上进行洗脱、显色和样品面朝下进行方式对比。
具体实施方式
实施例1本发明的标记方法和一抗孵育方法在westernblot中的应用
一、试剂和仪器
pvdf膜(
sds-page凝胶超快速配制试剂盒(p0686/p0688/p0690/p0692，碧云天生物技术)
sds-page蛋白上样缓冲液(6×)(p0015f，碧云天生物技术)
异丙醇(67-63-0，成都科隆化学)
预染的蛋白质marker(26616，thermofisherscientific)
sds-page电泳缓冲液(1l)：3.03g三羟甲基氨基甲烷(77-86-1，成都科隆化学)，14.42g甘氨酸(56-40-6，成都科隆化学)，1gsds十二烷基硫酸钠(f20060002，湖南尔康制药股份有限公司)
转膜缓冲液(1l)：3.03g三羟甲基氨基甲烷(77-86-1，成都科隆化学)，14g甘氨酸(56-40-6，成都科隆化学)，20％甲醇(67-56-1，成都科隆化学)
1×tbs(1l)：2.42gtrisbase，8gnacl，ph＝7.6
tbs/t缓冲液：1×tbs，0.1％tween(r)20(9005-64-5，成都科隆化学)
封闭液：1×tbs，0.1％(v/v)tween-20，5％(质量体积比)脱脂奶粉。
一次性防滑pe手套(bc010，biosharp)
一抗：smad3(c67h9)rabbitmab(9523，cellsignalingtechnology)
二抗：辣根酶标记山羊抗兔igg(zb-2301，中杉金桥)
immobilonwestern化学发光hrp底物(wbkls0500，millipore)
电泳仪(eps-600，tanon)
crystal试管旋转混匀器(hyq-2231，crystaltechnolog)
ts-2000a多用途脱色摇床，(ts-2000a，kylin-belllabinstrumentsco.，ltd.)
ibright智能成像系统(cl1000，invitrogen)
二、方法
1.样品制备
(1)取lovo(人结肠癌细胞)蛋白裂解液样品，加入6×sds样品缓冲液。煮沸样品5-10分钟。
(2)sds-page配置：按照碧云天生物技术sds-page凝胶超快速配制试剂盒说明书，在sds-page下层胶预混液中，按相应比例加入10％凝胶聚合催化剂溶液和temed。混匀，倒入制胶模具，异丙醇封住液面。下层胶充分凝固后，在sds-page上层胶预混液中，按相应比例加10％凝胶聚合催化剂溶液和temed，混匀。去除下层胶上面覆盖液体，倒入sds-page上层胶预混液，插入梳子，待凝固。
2.电泳分离
将制样蛋白样品上样至sds-page胶，进行电泳，浓缩胶电压80v，分离胶电压120v。
3.转膜(槽式湿转)
(1)放入剪取的6片滤纸至转移缓冲液中。
(2)初步对pvdf膜正反面，pvdf膜编号等信息标记。实验组采用无墨中性笔标记pvdf膜，对照组采用有墨的圆珠笔、有墨的中性笔或铅笔标记pvdf膜。采用无墨中性笔标记pvdf膜时，准备一只一次性pe手套，将pvdf膜放入pe手套，用无墨中性笔隔pe手套对pvdf膜进行标记(本发明的标记方法)。
(3)将pvdf膜经纯甲醇浸泡活化3-5秒。
(4)“三明治”方式依次放入海绵，3层滤纸，page胶，pvdf膜，3层滤纸，海绵，赶去气泡。将“三明治”转移至冰浴槽中，加入转膜缓冲液，100v电压转膜30min。
(5)转膜结束，切断电源，取出杂交膜。
4.转膜后标记pvdf膜
采用无墨中性笔标记pvdf膜，圆珠笔，中性笔，铅笔，标记pvdf膜目的蛋白名称，蛋白marker等信息。采用无墨中性笔标记pvdf膜时，准备一只一次性pe手套，pe手套内加入数滴tbs缓冲液，将pvdf膜放入pe手套，用无墨中性笔隔pe手套对pvdf膜进行标记(本发明的标记方法)。
5.封闭
(1)摇床上用tbs室温洗pvdf膜10min(第一次洗脱)。
(2)摇床上用封闭缓冲液室温孵育pvdf膜2h。
(3)tbs/t洗3次，每次10min(第二次洗脱)。
6.孵育抗体
(1)15mlbd管中加入10ml，或50mlbd管中加入20ml1：1000稀释比例一抗(smad3rabbitmab，9523，cellsignalingtechnology)，放置crystal试管旋转混匀器，4℃过夜，缓慢转动(本发明的一抗孵育方法)；另外设置一组，在4℃下不转动，静置过夜(一抗孵育对照)。
(2)tbs/t洗3次，每次15min(第三次洗脱)。
(3)摇床上用1：10000稀释的二抗(辣根酶标记山羊抗兔igg，zb-2301，中杉金桥)室温孵育1h。
(4)tbs/t洗3次，每次15min(第四次洗脱)。
在前述第5、6节中所述的第一、二、三、四次洗脱中，pvdf膜样品面朝上(本发明的洗脱方法)或朝下(对照洗脱方法)。所述样品面，即载有蛋白样品的一面，即转膜时直接接触page胶的面。
7.显色
按照说明书配置显色液(immobilonwestem化学发光hrp底物，wbkls0500，millipore)，将pvdf膜浸泡在显色液中约30秒，之后将pvdf膜样品面朝上(本发明的显色方法)或朝下(对照显色方法)放入ibright智能成像系统自动曝光。
三、结果
1.转膜前的标记
在方法部分第3节步骤(3)的甲醇浸泡后，发现圆珠笔标记和中性笔标记的pvdf膜均有一定程度的弥散，铅笔标记不清晰，无墨中性笔笔标记清晰(图1)。
2.转膜后的标记
在方法部分第5节步骤(3)tbs/t洗涤后，发现圆珠笔标记和中性笔标记的pvdf膜均有一定程度的弥散，铅笔标记不清晰，无墨中性笔笔标记清晰(图2)。
3.显色后膜背景观察
在方法部分第7节后，观察pvdf膜，发现圆珠笔和中性笔标记的膜背景有一定污染，且圆珠笔和中性笔标记处有荧光干扰；无墨中性笔标记的膜背景干净，且未发现荧光干扰(图3，一抗孵育方式均为旋转混匀器内转动孵育，洗脱和显色时样品面均朝上)。
4.一抗孵育方法结果比较
如图4所示，旋转混匀器孵育所得条带清晰，条带颜色深；静止孵育所得条带稍模糊，条带颜色较浅。
5.洗脱方法结果比较
如图5所示，本发明的洗脱、显色方法所得条带清晰，膜背景低；对照洗脱、显色方法所得条带稍浅，膜背景高。
综上，本发明的pvdf膜标记方法留下的笔迹不受甲醇和缓冲液的影响，长时间保持清晰，且不会干扰蛋白产生的印迹信号。本发明的一抗孵育方法能提高一抗孵育效率，提升显色质量。本发明的pvdf膜洗脱、显色方法能提高洗脱、显色效率。
结合了前述pvdf膜标记方法、一抗孵育方法和pvdf膜洗脱、显色方法的免疫印迹方法，其蛋白条带清晰，背景低，显色质量优良。
本发明的免疫印迹方法，整合了前述的pvdf膜标记方法、一抗孵育方法以及洗脱、显色方法，集成了前述方法的优势，可提高蛋白检测信号的可辨识度，应用价值较高。