一种汞离子和铜离子同步检测方法与流程

本发明属于纳米技术及分析化学领域，尤其是涉及一种汞离子和铜离子同步检测方法。

背景技术：

汞是重要的有毒重金属之一，在自然灾难以及人类工业活动过程中被释放到环境当中，对水、土壤和食物造成严重污染。汞离子是最稳定的无机汞的存在形式，主要存在于地表水中，由于其水溶性高，易被水生生物吸收且不可生物降解，通过食物链富集进入人体，可能导致严重的长期损害。即使在很低的浓度也很容易在人体内积聚，可能导致中枢神经系统、内分泌系统、胃肠道功能损害，甚至会导致肾脏或呼吸衰竭。

在汞离子的检测过程中，同为二价阳离子的铜离子常常给检测带来干扰。而在电镀废水和工业废水等实际样品中，铜离子和汞离子共存的概率很高，很难将两者分开。铜离子在高浓度下生成活性氧，会破坏生物系统，在水介质中通过食物链进入人体，被过量积累的铜离子可致细胞内稳态紊乱，导致严重的神经退行性疾病。因此，检测水中的铜离子和汞离子水平在废物管理、环境分析、毒理学、水安全、水质等方面具有明显的意义。

现有技术中大多针对一种重金属离子进行检测，达到定性显色或定量检测的目的。或通过显影剂络合重金属离子达到多金属离子同时监测，却很难分清金属离子种类，不能实现分别定量。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明提供一种汞离子和铜离子同步检测方法。

本发明采用的技术方案是：一种汞离子和铜离子同步检测方法，将待测溶液与双金属纳米团簇荧光纳米探针进行淬灭反应和恢复反应，检测其荧光值变化度，与标准淬灭曲线和标准恢复曲线比较后计算得到待测溶液中汞离子浓度与铜离子浓度。

计算方法如式1：

f/f0＝(f汞/f0)×(f铜/f0)式1；

其中，f0为初始金银纳米团簇荧光纳米探针溶液的荧光值，f为待测溶液检测荧光值，f汞为相应浓度汞离子检测荧光值，f铜为相应浓度铜离子检测荧光值。

优选地，将已知浓度的铜离子溶液或汞离子溶液与金银纳米团簇荧光纳米探针进行淬灭反应和恢复反应，分别得到铜离子溶液或汞离子溶液标准淬灭曲线和标准恢复曲线。

优选地，双金属纳米团簇荧光纳米探针为金离子和银离子被壳聚糖衍生物还原形成的金银纳米团簇进而组装而成的荧光纳米探针。

优选地，金银纳米团簇荧光纳米探针制备方法为：

将活化后的乙酰半胱氨酸溶液加入到壳聚糖溶液中得到乙酰半胱氨酸-壳聚糖溶液；

向乙酰半胱氨酸-壳聚糖溶液中加入四氯金酸和硝酸银溶液，用截留分子量为8-14kda的透析袋透析即可得到金银纳米团簇荧光纳米探针。

其中，检测步骤为：

取金银纳米团簇荧光纳米探针溶液，分别加入汞离子溶液或铜离子溶液，制得梯度浓度的反应体系，避光静止反应后，检测最大激发波长处的荧光值，绘制得到汞离子标准淬灭曲线hgi和铜离子标准淬灭曲线cui；

取金银纳米团簇荧光纳米探针溶液，分别加入汞离子溶液或铜离子溶液，制得梯度浓度的反应体系，避光一段时间后加入n-乙酰-l-半胱氨酸，避光静止反应，检测最大激发波长处的荧光值，绘制得到汞离子标准恢复曲线hgii和铜离子标准恢复曲线cuii；

取金银纳米团簇荧光纳米探针溶液，加入包含有铜离子和/或汞离子的待测溶液，避光静止后，检测最大激发波长处的荧光值为fa；再取金银纳米团簇荧光纳米探针溶液，加入待测溶液，避光静止后加入n-乙酰-l-半胱氨酸，避光静止后检测最大激发波长处的荧光值为fb；

根据荧光值fa和fb，曲线hgi，hgii，cui以及cuii计算待测溶液中铜离子和汞离子的溶液浓度。

优选地，曲线hgi，hgii，cui和cuii均为汞离子/铜离子浓度与f/f0的关系曲线，其中f0为初始金银纳米团簇荧光纳米探针溶液的荧光值，f为淬灭反应或恢复反应完成后溶液体系的荧光值。

优选地，

当fa/f0和fb/f0中的一个或两个小于0.1时，铜离子和/或汞离子超出检测线性范围，需将待测溶液按比例稀释后再次进行检测；

当fa/f0和fb/f0均大于0.1时，直接将fb/f0对应cuii曲线计算铜离子浓度，再计算得到汞离子浓度。

本发明具有的优点和积极效果是：本发明解决了样品中铜离子和汞离子同时存在时的离子定量检测问题，可以实现在不经过分离纯化的情况下分别定量检测铜离子和汞离子，检测过程操作简单，数据准确，能够用于水体系中汞离子和铜离子的同步检测。

附图说明

图1是本发明一个实施例检测流程图；

图2是本发明一个实施例中nac-cs红外光谱图；

图3是本发明一个实施例中荧光纳米探针透射电镜图；

图4是本发明一个实施例中荧光纳米探针荧光谱图；

图5是本发明一个实施例中汞离子荧光曲线；

图6是本发明一个实施例中铜离子荧光曲线。

具体实施方式

重金属离子检测通常采用原子吸收光谱法(aas)、等离子体质谱法、比色法、电化学传感法、荧光检测法等检测技术，这些方法或设备昂贵，或前处理繁琐，荧光检测方法以灵敏度高、简单、响应时间短等优点成为理想的检测方法。传统的荧光探针是在有机染料(荧光体或显色体)的基础上发展起来的，存在着stokes位移小、寿命短、发射波长短、光稳定性差等问题，使得这些检测方法存在灵敏度低、选择性差、与水环境不相容等局限性，限制了它们的实际应用。随着纳米技术的快速发展，荧光无机纳米材料(包括量子点和金属纳米材料)因其发光强烈、光化学稳定性高、斯托克斯位移大、谱线宽等特点，特别是在传感和生物成像领域获得了广泛的研究。

本发明提供一种通过双金属纳米团簇荧光纳米探针对汞离子和铜离子同步检测方法，将待测溶液与金银纳米团簇荧光纳米探针分别进行淬灭反应和恢复反应，检测其荧光值变化度，即为f/f0，其中f0为初始金银纳米团簇荧光纳米探针溶液的荧光值，f为淬灭反应或恢复反应完成后溶液体系的荧光值。再与标准淬灭曲线和标准恢复曲线比较后得到待测溶液中汞离子浓度与铜离子浓度。其中，待测溶液检测荧光值与初始荧光值比值为相应浓度汞离子检测荧光值与初始荧光值比值和相应浓度铜离子检测荧光值与初始荧光值比值的乘积，分别对淬灭反应中测得数据和恢复反应中测得数据进行计算，最终计算得到待测溶液中汞离子和铜离子浓度。

f/f0＝(f汞/f0)×(f铜/f0)；

其中，f0为初始金银纳米团簇荧光纳米探针溶液的荧光值，f为待测溶液检测荧光值，f汞为相应浓度汞离子检测荧光值，f铜为相应浓度铜离子检测荧光值。

将已知的梯度体系浓度的铜离子溶液或汞离子溶液与金银纳米团簇荧光纳米探针进行淬灭反应和恢复反应，计算f/f0，分别绘制铜离子溶液或汞离子溶液标准淬灭曲线和标准恢复曲线。

本方案中所使用的荧光探针为双金属纳米团簇荧光纳米探针，双金属纳米团簇材料具有尺寸超小，毒性低，荧光性强，合成条件温和，发光颜色随团簇尺寸可调等特点，改善了荧光染料分子容易产生光熄灭的问题，克服了半导体纳米颗粒(量子点)制备成本高，条件苛刻，合成先驱物有高毒性等缺点，同时比单金属纳米团簇具有更好的电子、化学和等离子体性质，拥有更强的稳定性和量子效率。这种以多金属掺杂纳米团簇为基础的荧光纳米探针，对荧光检测方法的发展有重要意义。本发明某些实施例中，金银纳米团簇荧光纳米探针为金离子和银离子被壳聚糖衍生物还原形成的金银纳米团簇进而组装而成的荧光纳米探针。

金银纳米团簇荧光纳米探针制备方法为：将活化后的乙酰半胱氨酸溶液加入到壳聚糖溶液中得到乙酰半胱氨酸-壳聚糖溶液；再向乙酰半胱氨酸-壳聚糖溶液中加入四氯金酸和硝酸银溶液，用截留分子量为8-14kda的透析袋透析即可得到金银纳米团簇荧光纳米探针。具体可按如下步骤：

壳聚糖衍生物制备：壳聚糖(分子量50-1000kda)溶于0.1m的盐酸溶液中，加入1m的氢氧化钠溶液调节ph至5；将一定量的n-乙酰-l-半胱氨酸(nac)溶于蒸馏水中，随后加入edc、nhs活化20min，将活化后的nac溶液缓慢加入壳聚糖溶液中，反应12h；反应结束后过滤除去乙酰半胱氨酸-壳聚糖溶液(nac-cs)中的不溶物，用截留分子量为8-14kda的透析袋透析48h，得到nac-cs冻干备用。整个反应过程完全避光。

金银纳米团簇荧光纳米探针制备：取冻干后的nac-cs溶于0.2m的醋酸溶液，加入一定量的四氯金酸和硝酸银溶液，60℃空气浴避光震荡6h，反应后的产物用截留分子量为8-14kda的透析袋透析48h，即可得到金银纳米团簇荧光纳米探针，溶液储于4℃冰箱备用。

检测同时包含铜离子和汞离子的水体系时，具体步骤如下：

步骤一：淬灭曲线的绘制

取金银纳米团簇荧光纳米探针溶液，分别加入不同体积的汞离子溶液或铜离子溶液，避光静止1h后，用荧光分光光度计检测最大激发波长处的荧光值，以其与初始荧光值比值绘制得到汞离子标准淬灭曲线hgi；铜离子标准淬灭曲线cui。

步骤二：恢复曲线的绘制

取金银纳米团簇荧光纳米探针溶液，分别加入不同体积的汞离子溶液和铜离子溶液，避光静止1h后加入n-乙酰-l-半胱氨酸(nac)，避光静止1h后，用荧光分光光度计检测最大激发波长处的荧光值，以其与初始荧光值比值绘制得到汞离子标准恢复曲线hgii；铜离子标准恢复曲线cuii。

步骤三：同时定量检测汞离子和铜离子

取金银纳米团簇荧光纳米探针溶液，加入包含有汞离子和/或铜离子的待测溶液，避光静止后，检测最大激发波长处的荧光值为fa；再取金银纳米团簇荧光纳米探针溶液，加入待测溶液，避光静止后加入n-乙酰-l-半胱氨酸，避光静止后检测最大激发波长处的荧光值为fb；根据荧光值fa和fb，hgi，hgii，cui以及cuii计算待测溶液中铜离子和汞离子的溶液浓度。其中，hgi，hgii，cui和cuii均为汞离子/铜离子浓度与f/f0的关系曲线。

在淬灭反应中，汞离子可与团簇的金属核结合，诱导荧光淬灭，汞离子浓度在0-800nm范围内浓度与f/f0呈现良好的线性关系，得到汞离子浓度与f/f0曲线：hgi；汞离子浓度高于检测线性范围时荧光基本完全淬灭，f/f0低于10％。铜离子可与团簇表面的壳聚糖衍生物中的巯基基团结合，诱导荧光淬灭，铜离子浓度在0-400nm范围内浓度与f/f0呈现良好的线性关系，得到铜离子浓度与f/f0曲线：cui。

相应的，在恢复反应中，n-乙酰-l-半胱氨酸中的巯基基团可与汞离子结合，使汞离子与金属核分开，汞离子浓度在0-1000nm范围内荧光完全恢复，f/f0约等于100％。n-乙酰-l-半胱氨酸还原铜离子为亚铜离子或铜单质，在不同铜离子浓度时，可结合为nac-cu、nac-cu⁺或nac-cu²⁺，在铜离子浓度在0-800nm范围内浓度与f/f0呈现良好的线性关系，得到铜离子浓度与f/f0曲线：cuii；在铜离子浓度高于检测线性范围时荧光基本完全淬灭，f/f0低于10％。

因此，本发明方案中，汞离子浓度为0-800nm，铜离子浓度为0-400nm时可直接计算得到汞离子和铜离子的浓度，当汞离子和/或铜离子超过上述范围时，则需要对待测液进行稀释后再进行测定，可通过多次稀释，直到获得均小于0.1的fa/f0和fb/f0值。

如图1所示，具体计算方式为：

当fa/f0和fb/f0中的一个或两个小于0.1时，铜离子和/或汞离子超出检测线性范围，需将待测溶液按比例稀释后再次进行检测；

当fa/f0和fb/f0均大于0.1时，直接将fb/f0对应cuii曲线计算铜离子浓度，再计算得到汞离子浓度。

下面结合具体实施例对本发明方案做出进一步说明，其中，未具体说明操作步骤的实验方法，均按照相应商品说明书进行，实施例中所用到的仪器、试剂、耗材如无特殊说明，均可从商业公司购买得到。

实施例1：金银纳米团簇荧光纳米探针的制备

1.1壳聚糖衍生物的制备

100mg壳聚糖(分子量200kda，脱乙酰度为90.6％)溶于0.1m的盐酸溶液中，加入1m的氢氧化钠水溶液调节ph至5。将200mg的n-乙酰-l-半胱氨酸(nac)溶于蒸馏水中，随后加入120mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc·hcl)和24mgn-羟基琥珀酰亚胺(nhs)活化20min，将活化后的nac溶液缓慢加入壳聚糖溶液中，反应12h。反应结束后过滤除去不溶物，用截留分子量为8-14kda的透析袋透析48h，得到乙酰半胱氨酸-壳聚糖衍生物(nac-cs)，冻干备用，整个反应过程完全避光。制得nac-cs的红外光谱如图2所示。

1.2金银纳米团簇荧光纳米探针的制备

取1mg冻干后的nac-cs溶于0.2m的醋酸溶液，加入5μl，2％四氯金酸和5μl，2％硝酸银溶液，60℃空气浴避光震荡6h，反应后的产物用截留分子量为8-14kda的透析袋透析48h，得到金银纳米团簇荧光纳米探针储于4℃冰箱备用。图3为制得的荧光纳米探针微观形貌，图4为荧光纳米探针荧光谱图。

实施例2：离子定量曲线的绘制

2.1淬灭曲线

取20μl荧光纳米探针溶液，加入蒸馏水，分别加入汞离子或铜离子溶液使溶液总体积为2ml，避光静置1h。用荧光分光光度计检测混合液最大发射波长处的荧光值，分别绘制汞离子和铜离子荧光淬灭时浓度与f/f0关系曲线hgi，cui。

2.2恢复曲线

取20μl荧光纳米探针溶液，加入蒸馏水，分别加入汞离子或铜离子溶液使溶液总体积为1.9ml，避光静置1h。加入0.1ml，0.05m的nac。避光静置1h。用荧光分光光度计检测混合液最大发射波长处的荧光值，分别绘制汞离子和铜离子荧光恢复时浓度与f/f0关系曲线hgii，cuii。

如图5-6分别为汞离子/汞离子淬灭曲线和恢复曲线。

图5中，hgi曲线：f/f0＝-0.0008671×chg+0.99995，r²＝0.9952，线性范围：0-800nm；

hgii曲线：f/f0≈1；

图6中，cui曲线：f/f0＝-0.00144×ccu+0.98271，r²＝0.96937，线性范围：0-400nm；

cuii曲线：f/f0＝-0.0006997×ccu+1.00401，r²＝0.99848，线性范围：0-800nm。

其中，chg和ccu分别为汞离子和铜离子的浓度，单位为nm。

实施例3：铜汞离子混合荧光检测可计算性验证实验

3.1淬灭反应

将含有已知浓度的铜离子和汞离子溶液混合，加入到20μl荧光纳米探针溶液，加入蒸馏水总体积为2ml，使铜离子浓度为200nm，汞离子浓度为50nm，避光静置1h。用荧光分光光度计检测混合液最大发射波长处的荧光值fa，计算fa/f0为0.6156。

3.2恢复反应

将与3.1相同浓度和体积的铜离子和汞离子溶液混合，加入20μl荧光纳米探针溶液，加入蒸馏水总体积为1.9ml，避光静置1h。加入0.1ml，0.05m的nac。避光静置1h。用荧光分光光度计检测混合液最大发射波长处的荧光值fb，计算fb/f0为0.8245。

3.3验证计算

已知铜离子浓度为200nm，汞离子浓度为50nm，代入hgi、cui和cuii曲线公式计算f/f0理论值，结果为f/f0(hgi)＝0.9566、f/f0(cui)＝0.6947和f/f0(cuii)＝0.8641，另外f/f0(hgii)＝1。fa/f0(理论)＝f/f0(hgi)×f/f0(cui)＝0.6645；fb/f0(理论)＝f/f0(hgii)×f/f0(cuii)＝0.8641。

fa/f0与fa/f0(理论)，fb/f0与fb/f0(理论)误差分别为7.9％和4.8％，由此可见铜汞离子混合液引起的荧光纳米探针荧光变化，与铜、汞离子溶液分别引起的荧光纳米探针荧光变化之积相符。在本发明其他实施例中，还针对其他浓度的铜离子和汞离子混合液进行验证，均符合上述规律，说明本发明方案能够用于铜、汞离子混合体系的定量检测。

实施例4：含有未知浓度汞离子和铜离子溶液的同步定量检测

将同时含有铜离子和汞离子的待测溶液，按照实施例2中步骤进行淬灭反应和恢复反应，测定淬灭时的荧光值fa，恢复时的荧光值fb，计算其fa/f0和fb/f0。

当fa/f0和fb/f0中的一个或两个小于0.1时，铜离子和/或汞离子超出检测线性范围，需将待测溶液按比例稀释后再次进行检测；

当fa/f0和fb/f0均包含于0.1-1范围内，fb/f0直接通过cuii曲线公式进行计算得到铜离子浓度；fa/f0通过cui、hgi曲线公式以及计算得到的铜离子浓度，计算得到汞离子浓度。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。