新型冠状病毒中和性抗体滴度检测ELISA试剂盒的制作方法

本发明涉及免疫检验技术领域，具体地说，涉及一种新型冠状病毒中和性抗体滴度检测elisa试剂盒。

背景技术：

新型冠状病毒sars-cov-2(即2019-ncov)是2019年新发现的一种病毒，可导致人类病毒性肺炎或肺部感染。冠状病毒基因组依次编码为棘突蛋白、包膜蛋白、膜蛋白和核衣壳蛋白。其中棘突蛋白是冠状病毒最重要的表面膜蛋白，含有两个亚基，s1亚基与s2亚基。其中s1主要包含有受体结合区（receptorbindingdomain，rbd），负责识别细胞的受体。sars-cov-2的刺突蛋白与人血管紧张素转化酶2（angiotensin-convertingenzyme2，ace2）蛋白互作来感染人的呼吸道上皮细胞。棘突蛋白负责新冠病毒与宿主细胞膜受体结合及膜融合，是新冠中和抗体的重要作用位点以及疫苗设计的关键靶点。

新冠中和性抗体，可以阻断病毒刺突蛋白与人ace2蛋白的结合，从而阻止病毒侵染人的呼吸道上皮细胞。在实际研发过程中，需要筛选具有中和能力的抗体，以达到治疗的目的。另外，新冠疫苗研制中也必须以能够成功诱导中和抗体（保护性抗体）作为有效预防新冠感染的前提。因此，亟需开发有效且便捷的方法来检测新冠病毒中和抗体。

目前检测新型冠状病毒中和抗体的方法主要为活病毒或假病毒中和试验。由于复杂的细胞实验过程，并受限于安全与试剂耗材等因素，现有方法不适合高通量大规模的新冠病毒中和抗体筛选工作。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种具有成本低，操作简单，高灵敏度、高特异性、高准确度的酶联免疫吸附（elisa）检测试剂盒，用于新型冠状病毒中和抗体的批量、快速检测。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种新型冠状病毒中和性抗体滴度检测elisa试剂盒，所述试剂盒包括：包被有链霉亲和素和生物素标记的人ace2蛋白的酶标板、辣根过氧化酶标记的新型冠状病毒rbd蛋白、新型冠状病毒中和性抗体阳性对照（即新冠病毒中和抗体参考品）、包被液、洗涤液、稀释液、封闭液、显色液和终止液等。

优选地，酶标板上包被的链霉亲和素的浓度为5ug/ml，生物素标记的人ace2蛋白的浓度为2ug/ml，链霉亲和素与生物素标记的人ace2蛋白的摩尔比为1:4。

包被方法如下：酶标板先经过链霉亲和素(streptavidin，缩写sa)溶液包被过夜，用洗涤液洗板后，加入生物素标记的人ace2蛋白，用封闭液进行封闭并洗涤后密封保存。

优选地，所述辣根过氧化酶标记的新型冠状病毒rbd蛋白中，辣根过氧化酶与rbd蛋白的摩尔比为4:1。

辣根过氧化酶标记的新型冠状病毒rbd蛋白的使用浓度为50ng/ml。

本发明中，不局限于使用辣根过氧化酶（hrp）标记新冠病毒刺突蛋白rbd，还可以用fitc、pe等标记rbd蛋白。

本发明中，所述新型冠状病毒中和性抗体阳性对照来自于新冠康复患者，测定其可变区序列并通过重组形成的，该阳性对照购自上海祥耀生物科技有限公司。

优选地，所述包被液为碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，具体成分为：15mmna2co3，35mmnahco3，ph9.6。

优选地，所述洗涤液为：20mmtris，150mmnacl，0.5%v/vtween-20，ph7.4。

优选地，所述稀释液为含0.5％牛血清白蛋白的洗涤液。

优选地，所述显色液为：50mmna2hpo4·12h2o+25mm柠檬酸（c6h8o7）+40mg/mltmb+3%v/vh2o2，ph5.5。

优选地，所述终止液为1m硫酸溶液。

本发明中，所述酶标板可以是96孔板。

辣根过氧化酶标记的新型冠状病毒rbd蛋白和新型冠状病毒中和性抗体阳性对照，在试剂盒中优选为冻干粉形式。冻干粉中含有10%海藻糖（冻干保护剂）。

第二方面，本发明提供新型冠状病毒中和性抗体的elisa检测方法。

本发明试剂盒的检测原理为：酶标板上的每个实验孔与阳性对照孔均包被有等量的生物素-链霉亲和素标记的人ace2蛋白，设置阴性孔（不含有生物素标记的人ace2蛋白），加入待测样本和新冠病毒中和抗体阳性对照以及恒定量hrp标记的新冠刺突蛋白rbd，hrp标记的新冠刺突蛋白rbd与待测新冠中和抗体相互竞争与固相抗原（人ace2蛋白）反应，由于每个孔中的固相抗原和加入的hrp标记的新冠刺突蛋白rbd含量均恒定，所以当待测的新冠中和抗体浓度高时，则被结合在固相抗原上的hrp标记的新冠刺突蛋白rbd含量少，用洗涤液洗涤后加入显色液，显色反应浅，用酶标仪检测的od值低，表明抑制率高；反之，当待测新冠中和抗体浓度低时，则所测的od值高，抑制率低。通过用已知的新冠中和抗体（阳性对照）浓度检测所绘制的标准曲线，可以推算出待测新冠病毒中和抗体的中和能力以及给予疫苗后，是否产生了保护性抗体及滴度。

中和性抗体的判定标准如下：

中和活性：当待测样本od值低于阳性孔时，判定为中和性抗体，用“+”表示。

非中和活性：当待测样本od值等于阳性孔时，判定为非中和性抗体，用“-”表示。

无效：当阳性对照孔不显色或显色但od值低于2.0时，该次实验判为无效。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

（一）本发明以生物素-链霉亲和素标记的人ace2蛋白为包被抗原，以康复病人体内的抗体为阳性中和抗体作为试剂盒参照品，通过与新冠刺突蛋白rbd竞争结合生物素标记的人ace2蛋白，从而筛选出具有中和能力的中和抗体以及疫苗给药后产生保护性抗体的滴度。

（二）本发明提供的检测试剂盒能准确灵敏地检测不同基质，如血清中的新冠中和抗体的中和能力以及抗体滴度，样品的前处理过程简单，耗时少，能同时检测大量的样品，样品检测成本远低于传统活病毒或假病毒检测方法。本发明对于大批量样品的新冠病毒中和抗体检测具有重要意义。

（三）本发明蛋白试剂为冻干成分保存时间长，液体无放射性污染。

（四）本发明中，生物素标记的人ace2蛋白是采用体内酶标方式得到的，为生物素单点定点标记，具有批间差异小，重复性好的特点，与酶标板中的sa定点结合后，具有良好的空间结构，灵敏度更高。

（五）本发明中，新冠病毒刺突蛋白rbd优选用辣根过氧化酶标记，操作简单。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中绘制的新冠病毒中和抗体检测标准抑制曲线。

具体实施方式

本发明中所用的蛋白组分，如sa、hrp标记的新冠刺突蛋白rbd和生物素标记的人ace2蛋白均利用人hek293细胞表达，可维持天然蛋白结构。sa，生物素标记的人ace2蛋白的包被量采用棋盘法依照灵敏度，检测范围为指标进行选择。

hrp标记的新冠刺突蛋白rbd使用量的优化：在酶标板中加入不同浓度的hrp标记的新冠刺突蛋白rbd，选择hrp标记的新冠刺突蛋白rbd使用量为其与包被抗原结合恰好饱和的量。

本发明采用竞争elisa方法，新冠病毒中和性抗体可阻断新冠刺突蛋白rbd与人ace2蛋白的结合，并进行灵敏度、特异性、准确性和精密度的优化。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册（sambrookj&russelldw，molecularcloning:alaboratorymanual，2001），或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1新冠病毒中和抗体检测酶联免疫吸附试剂盒的构建

本实施例提供的新型冠状病毒中和性抗体滴度检测elisa试剂盒，包括如下组分：

（1）预包被生物素-链霉亲和素标记的人ace2蛋白的酶标板，规格为96孔板；

（2）辣根过氧化酶（hrp）标记的新冠刺突蛋白rbd，为冻干粉形式，规格为10ug；

（3）新冠病毒中和抗体参考品购自上海祥耀生物科技有限公司，为冻干粉形式，规格为20ug；

（4）浓缩（10×）洗涤液：20mmtris，150mmnacl，0.5%v/vtween-20，ph7.4，规格为60ml；

（6）tmb显色液：50mmna2hpo4·12h2o+25mm柠檬酸+40mg/mltmb+3%v/vh2o2，ph5.5，规格为12ml；

（7）终止液：1mol/l硫酸溶液，规格为7ml。

实施例2试剂盒操作方法

拆开真空包装袋并取出酶标板，在室温下平衡5分钟备用。配制0μg/ml，0.16μg/ml，0.31μg/ml，0.63μg/ml，1.25μg/ml，2.5μg/ml，5μg/ml，10μg/ml的新冠病毒中和抗体标准液，加入50μl处理好的样品到各孔中，标样和样品各做3个重复，加入50μl稀释到0.12ug/ml的辣根过氧化酶（hrp）标记的新冠刺突蛋白rbd，37℃孵育60分钟；倒出孔中的液体，用稀释好的洗剂液洗3次，将酶标板倒置在吸水纸上拍干；取单组份tmb显得液，每孔加100μl，在暗处显色10~15分钟，每孔加入50μl的终止液终止反应，酶标仪上测定各孔在波长为450nm处的od值。实验周期为2h。

将含0μg/ml阳性孔的od值-空白孔记为b0，其余孔减去空白孔后的od值记为b；以b/b0值的百分比作为纵坐标，相应参考品浓度值作为横坐标，用四参数拟合方程：y=(a-d)/[1+(x/c)^b]+d，其中，a：曲线上渐近线估值；d：曲线下渐近线估值；b：曲线的斜率；c：最大结合一半时对应的剂量。

绘制的新冠病毒中和抗体检测标准抑制曲线见图1。测得曲线的四参数分别为：a=14.38，b=-2.114，c=1.742，d=104.1，r²=0.9993。

实施例3试剂盒加速实验

将实施例2的试剂盒置于37⁰c保存，分别取放置0、7、14、21、28天的试剂盒，以新冠病毒中和抗体参考品作为拟合曲线，计算不同时间曲线的ic50值。不同时间测定结果见表1：

从以上结果可以看出，ic50值变化不大，试剂盒在-20℃下至少可保存12个月以上。

实施例4试剂盒组分冻融实验

将实施例2的试剂盒中冻干组分重构后（hrp标记的新冠刺突蛋白rbd用去离子水重构到100ug/ml，将新型冠状病毒中和性抗体阳性对照用去离子水稀释到200ug/ml），按大于5ug每管进行分装，置于-20℃保存，分别冻融1、2、3次（于-70℃冻融，然后恢复至室温），以新冠病毒中和抗体参考品作为拟合曲线，计算不同时间曲线的ic50值。不同时间测定结果见表2：

从以上结果可以看出，ic50值变化不大，试剂盒中冻干粉组分在-20℃下冻融三次内对活性成分无影响。

实施例5试剂盒基质影响实验

实施例2的试剂盒可以检测血清中新冠病毒中和抗体，验证不同血清基质（buffer、10%、20%、50%，100%人血清）中对ic50的干扰。以新冠病毒中和抗体参考品作为拟合曲线，计算不同基质中曲线的ic50值。不同基质测定结果见表3：

从以上结果可以看出，ic50值变化不大，试剂盒在不同基质中检测无影响。

实施例6试剂盒精密度实验

将实施例2试剂盒中的新冠病毒中和抗体按照试剂盒操作方法，连续6个分析批次，每个分析批次至少2个重复。以新冠病毒中和抗体参考品作为拟合曲线，计算不同基质中曲线的ic50值。不同基质测定结果见表4：

从以上结果可以看出，不同天数抑制率与ic50值变化不大，说明试剂盒精密度良好。

实施例7试剂盒准确度实验

将实施例2试剂盒中的新冠病毒中和抗体按照试剂盒操作方法，分别设置5ug/ml、2.5ug/ml、0.6ug/ml高、中、低三个浓度，以新冠病毒中和抗体参考品作为拟合标准曲线，计算不同质控浓度的值。不同质控值结果见表5：

从以上结果可以看出，试剂盒准确度良好。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。