本发明属于生物技术和医疗检测
技术领域：
，具体涉及通过人体外周血中循环肿瘤细胞(ctc)的检测评估恶性肿瘤复发/转移风险。
背景技术：
：恶性肿瘤又称为癌症，其发病率和死亡率仍呈迅速上升趋势。癌症导致患者死亡的首要原因是复发与转移。传统的影像学检测技术(ct、mri、pet等)，对恶性肿瘤的检出直径有一定要求(至少为1-2mm)；同时，肿瘤的大小有时与肿瘤的恶性程度和浸润转移能力不完全一致，且因辐射等原因，影像学检测技术并不适宜作为恶性肿瘤的实时监测手段。因此影像学检测技术常常无法及时的发现恶性肿瘤的发生、转移及复发，也使得对于恶性肿瘤复发与转移的预测具有滞后性。血清肿瘤标志物，如癌胚抗原(cea)、甲胎蛋白(afp)等的筛查特异性不足，容易出现假阳性结果，并且不是所有组织来源的肿瘤均具有可用于肿瘤筛查的特异标志物。ashworth发现了癌症患者血液中的形态大小与肿瘤细胞相似的上皮样细胞，并第一个报道了循环肿瘤细胞(circulatingtumorcells，ctc)的存在。血液传播是癌症转移的重要途径，绝大多数循环肿瘤细胞在血液循环中很快发生凋亡或被吞噬，而有极少部分的循环肿瘤细胞可形成微小转移病灶，增加癌症患者死亡风险。循环肿瘤细胞的数量代表恶性肿瘤发生血液转移的能力和程度，对于治疗后的癌症患者，如果循环肿瘤细胞持续增多，则可能是肿瘤复发的前兆或复发的过程。通过早期发现微转移灶的趋势，及时变更治疗方案，可改善患者恶性肿瘤的复发与转移风险。外周血中循环肿瘤细胞数量稀少，大部分是白细胞和红细胞(每10ml血液中，含有约1亿个白细胞和500亿个红细胞，而循环肿瘤细胞的数目可能仅有几个到几十个)。因此，利用循环肿瘤细胞进行分析的前提是对血液样本中的循环肿瘤细胞进行富集。循环肿瘤细胞经外周血循环向转移灶迁移时可能会经历上皮质间质转化，导致丢失上皮特异性标志物，同时，上皮特异性标志物不仅表达于上皮来源肿瘤细胞，还可表达于非肿瘤上皮细胞，从而使分析结果的假阴性、假阳性升高，且难以兼顾敏感性和特异性要求。目前亟需建立敏感性高和特异性强的复发/转移风险评估方案，以期为癌症复发/转移风险评估提供更加科学有效的途径。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种基于循环肿瘤细胞检测的恶性肿瘤复发转移风险评估系统。为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：该恶性肿瘤复发转移风险评估系统包括循环肿瘤细胞富集模块、免疫荧光计数模块和风险判定模块；所述循环肿瘤细胞富集模块用于将血液样本中的循环肿瘤细胞与该样本中的大部分血细胞(例如，红细胞、白细胞)等非循环肿瘤细胞分离，从而获得富集有循环肿瘤细胞的细胞体系，以便用于免疫荧光实验与分析(染色、鉴定和计数)；所述免疫荧光计数模块用于借助免疫荧光染色对分离获得的细胞体系中的循环肿瘤细胞进行鉴定，并确定血液样本中的循环肿瘤细胞数目；所述风险判定模块用于对恶性肿瘤治疗干预(例如，手术)前后采集的血液样本中的循环肿瘤细胞数目分别进行阈值比较，从而对恶性肿瘤复发或转移风险进行预测。优选的，所述循环肿瘤细胞富集模块包括可以利用基于细胞大小和惯性的微流体原理从恶性肿瘤患者手术前、后分别采集的外周血中分离循环肿瘤细胞的设备(例如，clearcellfx系统)。优选的，所述外周血的采样体积数为7.5-10ml/人。优选的，所述外周血于手术前的1天-1个月，及手术后的1天-1个月进行采集。优选的，所述免疫荧光计数模块包括荧光显微镜以及用于对荧光显微镜采集的细胞免疫荧光染色结果进行分析的计算机平台；其中，免疫荧光染色包括以下步骤：将分离获得的细胞体系转移到载玻片上，并利用可以结合至循环肿瘤细胞的ck及dapi荧光抗体及可以结合至血细胞的cd45荧光抗体进行处理；所述计算机平台可以对载玻片上经免疫荧光染色后呈现为dapi+/ck+/cd45－的细胞(细胞核dapi染色阳性、ck染色阳性，且cd45染色阴性的细胞)进行鉴定和计数，即所述循环肿瘤细胞的免疫荧光染色结果为dapi+/ck+/cd45－。优选的，所述循环肿瘤细胞的免疫荧光染色判定标准为(荧光强度阈值)：1500<gfp≤5000且cy5<3800；或5000<gfp且cy5<19000。优选的，所述风险判定模块将手术前、后采集的外周血中循环肿瘤细胞数目均大于10个的恶行肿瘤患者判定为肿瘤复发或转移风险较高，并建议针对该恶行肿瘤患者介入进一步诊疗；反之，则将恶行肿瘤患者判定为肿瘤复发或转移风险较低(例如，不会发生复发或转移)。优选的，所述恶性肿瘤选自肺癌、乳腺癌、消化系统肿瘤(例如，胃癌、结直肠癌)中的任意一种。对于这些癌症(特别是消化系统肿瘤)，其肿瘤细胞的远处转移与血液中存在的循环肿瘤细胞密切相关，相应的肿瘤复发或转移风险预测具有更高的敏感性及特异性。本发明的有益效果体现在：本发明通过循环肿瘤细胞富集及免疫荧光计数，并结合对恶性肿瘤治疗干预前后血液样本中的循环肿瘤细胞数目进行独立的阈值比较，实现了对基于循环肿瘤细胞检测的恶性肿瘤复发或转移风险评估，对治疗干预后肿瘤复发、转移风险的预测具有敏感性高和特异性强的优势，可以及时为临床决策和治疗提供辅助信息，并且无需复杂的实验设备、成本低。进一步的，本发明不依赖于细胞表面表达的蛋白，例如epcam蛋白(上皮细胞粘附分子)，而是基于细胞力学性质差异分选循环肿瘤细胞，血液样品无需标记，不影响循环肿瘤细胞分子特性和表面标志物，只需要简单的样品处理即可自动化、快速、高通量的对样本中的循环肿瘤细胞进行富集。并且细胞在微流体环境中损伤小，分选后细胞的存活率更高，可继续培养和做后续分析，具有较高的敏感性，通过治疗前后对于循环肿瘤细胞的准确监测还可一定程度上对治疗方案和治疗效果进行评估。进一步的，本发明确定了用于风险评估的循环肿瘤细胞数目阈值(在一定体积数的恶性肿瘤患者血液样本中存在10个以上的循环肿瘤细胞)，提高了对恶性肿瘤复发或转移风险的预测能力，有效的控制了假阳性和假阴性。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步详细说明，所述实施例仅用于解释本发明，而非对本发明保护范围的限制。1.人体外周血样本中循环肿瘤细胞鉴定1.1对源自于人体外周血样本中的循环肿瘤细胞进行有效富集使用fx1system，基于细胞大小和惯性利用微流体富集原理从患者血液中富集循环肿瘤细胞(ctcs)，该微流体原理不依赖于细胞表面表达的蛋白，如epcam蛋白(上皮细胞粘附分子)。通过富集可将循环肿瘤细胞与白细胞、红细胞等非循环肿瘤细胞分离，进而可将富集获得的循环肿瘤细胞用于染色分析。1.2对所富集的循环肿瘤细胞染色将富集的细胞样品转移到载玻片上，根据循环肿瘤细胞与ck及dapi荧光抗体结合，血细胞与cd45荧光抗体结合，对细胞样品进行免疫荧光染色。1.3通过荧光显微镜及软件分析确定满足标准的循环肿瘤细胞循环肿瘤细胞染色满足dapi+/cd45－/ck+(用于判定的荧光强度范围为：1500<gfp≤5000且cy5<3800，或5000<gfp且cy5<19000)。循环肿瘤细胞直径>4μm×4μm，有一定形态(圆形、椭圆形和/或集群胞)，并且ck和dapi表达均匀。2.检测人体外周血样本中的循环肿瘤细胞数目1)选用标准的含有edta抗凝剂和专用细胞稳定剂的streck无创管采集人体外周血液7.5ml。2)将streck无创管轻轻倒置数次，以确保血液样本均一。3)用移液吸管从streck无创管中吸取血液样本到新的离心管中(即clearcellfx运行试剂中提供的50ml离心管)。4)将4倍体积的红细胞裂解缓冲液加到含有血液样本的离心管中。5)将离心管轻轻倒置5次，并在室温下孵育10分钟。6)将裂解的样品在500xg离心10分钟，温度为15℃-25℃，离心机含有离心制动器(或最高的减速度)。7)使用巴斯德吸管或血清移液管轻轻地移除上清液，直至上清液体积剩下4-5ml。然后，使用带过滤尖端的微量移液管枪头除去剩余的上清液，剩下约100μl上清液。8)使用带过滤尖端的1000μl移液管枪头，将1.0mlclearcellfx重悬缓冲液(rsb)加入离心管的壁上，避免在混合液中引入气泡。轻轻地上下吹打，重悬细胞沉淀。9)将另外3mlclearcellfx重悬缓冲液加入离心管的壁上(总体积4ml)，避免将气泡引入混合液中。轻轻地上下吹打，充分混合细胞悬液。10)在clearcellfx上处理样品，分离并富集循环肿瘤细胞。11)完成clearcellfx上的运行后，立即从样品输出端口收集含有富集的循环肿瘤细胞(ctcs)的样品于clearclellfx运行试剂中提供的15ml离心管中，在室温下以500xg离心10分钟，并进行离心机制动。12)用巴斯德吸管或血清移液管移除上清，直至离心管中的液体显示为1ml。13)使用带过滤尖端的1000μl移液管枪头移除离心管中的上清，在离心管中保留100μl上清液。剩余的这100μl上清液将在步骤15中作为重悬浮缓冲液。14)使100μl移液管枪头覆盖0.2％普朗尼克(枪头在0.2％的普朗尼克溶液中上下吹打数次)。在步骤15之前，一定要完全排出0.2％普朗尼克溶液。15)使用涂覆0.2％普朗尼克的移液管枪头，通过轻轻地上下吹打溶液5-6次，使细胞沉淀重悬于剩余的100μl上清液中。16)使用微量移液管枪头，以螺旋运动的方式将细胞悬液(100μl)轻轻分配到富有硅酮的隔离器孔中，使样品均匀分布在多聚体载玻片样品区域。17)使载玻片在生物安全柜中室温干燥至少12小时，并打开通风，最多保存14天。18)向样品区域添加100μl新鲜制备的3.7％甲醛，并确保覆盖整个样品区域。19)在室温下孵育10分钟。20)倾斜载玻片并轻轻地从底部角落移除所有甲醛溶液，注意不要碰到样品。21)加入200μl1×pbs进行洗涤(总共进行2次洗涤，每次浸泡2分钟，每次洗涤后移除1×pbs)，以去除甲醛溶液。22)在样品区域加入200μl的渗透阻隔缓冲液，室温下孵育30分钟。23)使用200μl移液管枪头，倾斜载玻片从样品区域的右下角去除渗透阻隔缓冲液，小心不要触碰到样品。24)轻轻加入100μl的一抗到样品区域中，在室温下孵育30分钟。其中，一抗混合液(100μl)组分为：anti-cytokeratin(1:500)、anti-cd45(1:200)、anti-pan角蛋白(1:500)、anti-epcam(1:1000)和皮尔斯免疫增强剂。25)加入200μl1×pbs进行洗涤(总共进行3次洗涤，每次浸泡3分钟，每次洗涤后移除1×pbs)，以去除一抗。26)轻轻加入100μl的二抗，室温孵育30分钟，避光。从这一步开始尽量减少载玻片曝光。用1×pbs洗涤4次，每次浸泡3分钟，每次洗涤后移除1×pbs。其中，二抗混合液(100μl)组分为：羊抗小鼠alexafluor488(1:1000)、羊抗兔alexafluor647(1:500)、dapi工作液(1:200)和皮尔斯免疫增强剂。27)使用记号笔来标记载玻片底部样品位置的四个角。28)用镊子轻轻将隔离器从载玻片上取出，注意不要破坏样品。29)用无尘擦拭纸去除多余的液体，注意不要触摸样品区域。30)在盖玻片中间添加一滴mounting溶液。31)将载玻片翻转，使样品区域朝下，轻轻放在mounting溶液和盖玻片上。载玻片的重量会使mounting溶液扩散到整个样品区域。如有必要，轻轻按压载玻片边缘，使mounting溶液均匀地分散。32)一旦mounting溶液均匀地分布在样品区域上，在盖玻片的四周加指甲油封片。33)在四角的指甲油干后(2-3分钟)，用指甲油封住盖玻片的整个边缘。34)盖玻片完全覆盖密封15分钟后，在lionheartlx(biotek)荧光显微镜下观察载玻片，并利用配套的分析软件gene5对循环肿瘤细胞数目进行统计。3.人体恶性肿瘤复发/转移风险评估选择2017年1月至2017年6月在湖南省长沙市三级医院进行手术治疗的胃肠道恶性肿瘤患者83例，所有患者均经影像、病理检查确诊，其中，胃癌患者35例，结肠癌患者48例，患者均经根治手术治疗。取所有患者术前、术后一月左右静脉血7.5ml进行ctc计数，所有患者手术前后ctc的数目经过阈值比较，从而验证基于ctc计数预测恶性肿瘤患者术后复发/转移风险的效能。3.1实验例表1.实验例复发/转移与ctc数目统计复发与转移情况n术前术后ctc数目≥10个(例)术前或术后ctc数目＜10个(例)随访3年复发/转移37298未复发/转移46442参见表1，83例患者随访三年中出现复发/转移患者37例，未复发/转移患者46例；37例复发/转移患者中，29例的术前术后ctc数目≥10个，8例术前或术后ctc数目＜10个；46未复发/转移患者中，4例术前术后ctc数目≥10个，42例术前或术后ctc数目＜10个。应用术前术后ctc数目≥10个预测复发/转移高风险的敏感性：敏感性＝术前术后ctc数目≥10个且复发或转移例数/总复发转移例数＝78.3％；即存在21.7％的假阴性。应用术前术后ctc数目≥10个预测复发/转移高风险的特异性：特异性＝术前或术后ctc数目＜10个且未复发或转移例数/总未复发转移例数＝91.3％；即存在8.7％的假阳性。3.2对照例表2.对照例复发/转移与ctc数目统计复发与转移情况n术前术后ctc数目≥5个(例)术后ctc数目≥10个(例)术后ctc数目≥5个(例)随访3年复发/转移37302932未复发/转移46101116根据表2统计结果，计算得到三种对照例中，预测复发/转移高风险的敏感性及特异性。1)应用术前术后ctc数目≥5个预测复发/转移风险应用术前术后ctc数目≥5个预测复发/转移高风险的敏感性：敏感性＝术前术后ctc数目≥5个且复发或转移例数/总复发转移例数＝81.0％。应用术前术后ctc数目≥5个预测复发/转移高风险的特异性：特异性＝术前或术后ctc数目＜5个且未复发或转移例数/总未复发转移例数＝78.2％。2)应用术后ctc数目≥10个预测复发/转移风险应用术后ctc数目≥10个预测复发/转移高风险的敏感性：敏感性＝术后ctc数目≥10个且复发或转移例数/总复发转移例数＝78.3％。应用术后ctc数目≥10个预测复发/转移高风险的特异性：特异性＝术后ctc数目＜10个且未复发或转移例数/总未复发转移例数＝76.1％。3)应用术后ctc数目≥5个预测复发/转移风险应用术后ctc数目≥5个预测复发/转移高风险的敏感性：敏感性＝术后ctc数目≥5个且复发或转移例数/总复发转移例数＝86.4％。应用术后ctc数目≥5个预测复发/转移高风险的特异性：特异性＝术后ctc数目＜5个且未复发或转移例数/总未复发转移例数＝65.2％。总之，本发明基于外周血样本进行的ctc数目检测和评估，相对于传统的影像学检查、组织样本生物学指标鉴定，可以更方便、更及时的反映患者肿瘤复发/转移风险。同时，本发明具有样本采集方便、无副作用、敏感性高、特异性强，及可以实时检测，且易于被患者接受等优势。当前第1页12