本发明涉及大熊猫繁殖技术领域，具体涉及一种大熊猫雌酮峰值时间的预测方法及其应用。
背景技术：
雌激素峰值时间的确定是大熊猫适时配种时间选择的重要依据，但是目前尚缺乏简单、可靠预测方法，导致部分个体漏掉关键样品及检测结果，难以判断其真实峰值时刻，为后续适时配种时机的选择带来困难。大熊猫一年仅发情一次，排卵一次，一年仅有一次繁殖机会，及时预测雌激素峰值时间有助于及时发现并实施大熊猫适时配种，避免错漏样品及检测。在圈养大熊猫繁殖中，在雌性大熊猫尿液雌激素峰值出现后选择合适时机进行大熊猫配种繁殖，因此，寻找雌激素峰值出现时间对制定相应雌性大熊猫个体配种方案的实施具有重要意义；目前，在大熊猫雌激素峰值的判定上有采用大熊猫阴道细胞学检查和通过对大熊猫尿液雌激素水平实时检测雌激素峰值。
大熊猫阴道细胞学检查需将大熊猫驯化后自然坐于特殊制作的挤压笼中，取阴道表皮细胞，采用三色巴氏染色法，根据阴道细胞涂片染色结果，统计嗜碱细胞、嗜酸和角质化细胞数量变化，预测雌激素峰值出现时间。例如，(barbaras.durran，2006年.newtechnologiesforthestudyofcarnivorereproduction.报道了对3只雌性大熊猫使用阴道细胞学检查均出现细胞学特征，其中1只大熊猫细胞学检查与尿液雌激素峰值关系为：在雌激素峰值出现前的第9天，阴道细胞涂片嗜碱细胞下降50％，嗜酸数量成为优势细胞；在雌激素峰值出现前的第2天，角质化细胞数量成为优势细胞，其余两只未见报道)；然而，该方法无其他大熊猫饲养机构使用，且当大熊猫数量较多时不具备可行性，大熊猫训练难度大，大部分个体采集不到细胞样品；此外，从大熊猫阴道取样，增大大熊猫应激反应，存在影响大熊猫发情繁殖的风险，而且对细胞种类的辨识和数量统计具有人为主观性，结果误差大，难以准确定量，操作复杂，预测雌激素峰值时间结果不准确。
雌激素实时检测方法需要进行密集采样和高频率雌激素水平测定，工作强度增大；对于尿液样品采集困难的雌性大熊猫个体，由于采样不足则可能造成雌激素峰值对应尿液样品未能采集到。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种大熊猫雌酮峰值时间的预测方法，该预测方法采样简单，利用正常监测雌激素、孕激素结果，不增加采样工作量和检测量，预测时间范围在较窄小范围内，并且准确率高。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明第一方面提供一种大熊猫雌酮峰值时间的预测方法，所述预测方法包括如下步骤：
(a)雌性大熊猫进入发情季节，当外阴颜色变红时，每天采集大熊猫尿液，并分别测定大熊猫尿液中肌酐、雌酮和孕酮的含量；
(b)当肌酐含量大于0.2mg/ml，计算肌酐校正后的雌酮含量；
(c)当肌酐校正后的雌酮含量首次大于20ng/mgcr时，指示大熊猫发情启动，将该次大熊猫尿液采集时间点记为发情启始时间,并从启示时间向后延伸4天后，对肌酐含量大于0.2mg/ml且孕酮含量大于2.5ng/ml的大熊猫尿液进行e/p值计算，并根据e/p值确定目标e/p值，其中，e/p值为雌酮含量与孕酮含量的比值；目标e/p值满足条件为：目标e/p值大于其对应大熊猫尿液采集时间点至启示时间向后延伸4天的对应时间点之间的所有大熊猫尿液的e/p值，同时大于其大熊猫尿液采集时间点向后延伸24h内所有大熊猫尿液的e/p值；
(d)以目标e/p值对应的大熊猫尿液采集时间点确定大熊猫雌酮峰值出现时间。
本发明上述预测方法利用大熊猫尿液样品，检测样品中肌酐、雌酮和孕酮的含量水平，分析经肌酐校正后的雌酮水平以及e/p值，准确预测大熊猫雌酮峰值出现的较窄时间段，该预测方法准确度高、操作简单、工作量较小、重复性好；此外，该预测方法不仅科学指导大熊猫雌激素峰值出现前尿样采集和激素测定频率，降低工作强度，还消除了驯化和阴道采样对大熊猫造成的应激影响及细胞检查人为主观性，并且能够及时掌握大熊猫发情所处阶段，提前改变大熊猫饲养管理方式和制定具体繁殖配种实施方案，对优化圈养大熊猫的繁殖管理，促进大熊猫保护具有重要意义。
通过肌酐含量大于0.2mg/ml,孕酮含量大于2.5ng/ml后再进行数据分析，能够更好的减少雌酮含量与孕酮含量的比值的工作量，并能够剔除污染样品，有利于提高预测的准确度。
优选地，所述以目标e/p值对应的大熊猫尿液采集时间点确定大熊猫雌酮峰值出现时间为：
以目标e/p值对应的大熊猫尿液采集时间点向后延伸17.2～41.2h为大熊猫雌酮峰值出现时间。
优选地，所述肌酐校正后的雌酮含量＝雌酮含量/肌酐含量。
优选地，所述雌性大熊猫进入发情季节，当外阴颜色变红时，每天采集大熊猫尿液的次数至少1次。
优选地，所述从启示时间向后延伸4天后的每天采集大熊猫尿液次数不低于2次。
与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：
本发明上述预测方法利用大熊猫尿液样品，检测样品中肌酐、雌酮和孕酮的含量水平，分析经肌酐校正后的雌酮水平以及e/p值，准确预测大熊猫雌酮峰值出现的较窄时间段，该预测方法准确度高、操作简单、工作量较小、重复性好；此外，该预测方法不仅科学指导大熊猫雌激素峰值出现前尿样采集和激素测定频率，降低工作强度，还消除了驯化和阴道采样对大熊猫造成的应激影响及细胞检查人为主观性，并且能够及时掌握大熊猫发情所处阶段，提前改变大熊猫饲养管理方式和制定具体繁殖配种实施方案，对优化圈养大熊猫的繁殖管理，促进大熊猫保护具有重要意义。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
实施例1
本实施例为一种大熊猫雌酮峰值时间的预测方法，该预测方法包括如下步骤：
(a)雌性大熊猫进入发情季节，当外阴颜色变红时，每天采集大熊猫尿液，并分别测定大熊猫尿液中肌酐、雌酮和孕酮的含量；
(b)当肌酐含量大于0.2mg/ml，计算肌酐校正后的雌酮含量，其中，肌酐校正后的雌酮含量＝雌酮含量/肌酐含量；
(c)当肌酐校正后的雌酮含量首次大于20ng/mgcr时，指示大熊猫发情启动，将该次大熊猫尿液采集时间点记为发情启始时间,并从启示时间向后延伸4天后，对肌酐含量大于0.2mg/ml且孕酮含量大于2.5ng/ml的大熊猫尿液进行e/p值计算，并根据e/p值确定目标e/p值，其中，e/p值为雌酮含量与孕酮含量的比值；目标e/p值满足条件为：目标e/p值大于其对应大熊猫尿液采集时间点至启示时间向后延伸4天的对应时间点之间的所有大熊猫尿液的e/p值，同时大于其大熊猫尿液采集时间点向后延伸24h内所有大熊猫尿液的e/p值；在启示时间向后延伸4天之后的每天采集大熊猫尿液次数不低于2次；
(d)以目标e/p值对应的大熊猫尿液采集时间点向后延伸17.2～41.2h为大熊猫雌酮峰值出现时间。
实验例
本申请发明人通过对以往86次大熊猫尿液的雌酮、肌酐、孕酮含量数据按照实施例1中的大熊猫雌酮峰值时间的预测方法进行比对，其中，准确预测大熊猫雌酮峰值出现时间的有81次，其准确率可达94.1％。
其中，2018年某只大熊猫发情期间尿液雌酮、肌酐、孕酮、e/p值的变化数据，如表1所示：
表1
按照本发明实施例1中的大熊猫雌酮峰值时间的预测方法可以得知，在2018-2-177:50:00尿液样品对应的肌酐校正后的雌酮含量首次大于20ng/mgcr，该时间点为发情启示时间；
从启示时间向后延伸4天对应的时间点为2018-2-217:50:00，在该时间点之后以及肌酐含量大于0.2mg/ml且孕酮含量大于2.5ng/ml的大熊猫尿液进行e/p值计算，并根据e/p值确定2018-2-227:55采集的大熊猫尿液样本的e/p值为目标e/p值；
通过确定的目标e/p值，预测雌激素峰值出现时间分布于2018-2-227:55:00后17.2-41.2h内；经实际检测，2018-2-2310:00:00该大熊猫尿液雌激素出现峰值，距离目标e/p后26.08小时。
2019年另外一只大熊猫发情期间尿液雌酮、肌酐、孕酮、e/p值的变化数据，如表2所示：
表2
按照本发明实施例1中的大熊猫雌酮峰值时间的预测方法可以得知，在2019-3-1912:30:00尿液样品对应的肌酐校正后的雌酮含量首次大于20ng/mgcr，该时间点为发情启示时间；
从启示时间向后延伸4天对应的时间点为2019-3-2312:30:00，在该时间点之后以及肌酐含量大于0.2mg/ml且孕酮含量大于2.5ng/ml的大熊猫尿液进行e/p值计算，并根据e/p值确定2019-3-249:40采集的大熊猫尿液样本的e/p值为目标e/p值；
通过确定的目标e/p值，预测雌激素峰值出现时间分布于2019-3-249:40:00后17.2-41.2h内；经实际检测，2019-3-257:28:00该大熊猫尿液雌激素出现峰值，距离目标e/p后21.8h。
2014年一只大熊猫发情期间尿液雌酮、肌酐、孕酮、e/p值的变化数据，如表3所示：
表3
按照本发明实施例1中的大熊猫雌酮峰值时间的预测方法可以得知，在2014-3-209:30:00肌酐校正后的雌酮含量首次大于20ng/mgcr，该时间点为发情启示时间；
从启示时间向后延伸4天对应的时间点为2014-3-249:30:00，在该时间点之后以及肌酐含量大于0.2mg/ml且孕酮含量大于2.5ng/ml的大熊猫尿液进行e/p值计算，并根据e/p值确定2014-3-2510:00采集的大熊猫尿液样本的e/p值为目标e/p值；
通过确定的目标e/p值，预测雌激素峰值出现时间分布于2014-3-2510:00后17.2-41.2h内；经实际检测，2019-3-2620:30:00该大熊猫尿液雌激素出现峰值，距离目标e/p后34.5h。
综上，本发明预测方法利用大熊猫尿液样品，检测样品中肌酐、雌酮和孕酮的含量水平，分析经肌酐校正后的雌酮水平以及e/p值，准确预测大熊猫雌酮峰值出现的较窄时间段，该预测方法准确度高、操作简单、工作量较小、重复性好，准确率较高。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。