一种联合型代谢标志物的应用及其产品的制作方法

[0001]
本发明属于检验医学技术领域，尤其涉及一种联合型代谢标志物的应用及其产品。


背景技术：

[0002]
肝癌是常见的消化道恶性肿瘤，在全球范围的发病率居第6位，死亡率居第3位；在我国的发病率高居第4位，死亡率更是高居第2位。我国的肝癌病例数量是全球肝癌发病和死亡数量总和的一半，情况严重。肝癌不仅具有高发病率、高死亡率的特点，在治疗方面还存在早期诊断困难、早期发生转移、对放化疗不敏感以及术后极易复发的难题。
[0003]
传统诊断方法为检测血清中的甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，afp)，afp的检测方法一般为采集静脉血后分离出血浆，于自动elisa仪中检测。观察afp指标升高与否，常用于肝癌的辅助诊断，但存在一定局限性，如：需要先排除活动性肝炎、妊娠、生殖细胞肿瘤等情况，且研究表明，肝癌患者afp阳性率在70-90％之间，afp诊断肝癌的敏感度不高，存在一定假阳性率、假阴性率。所以开发新型肝癌诊断标志物对肝癌患者早期诊断、治疗、降低肝癌患者死亡率有着极其重要的意义。


技术实现要素：

[0004]
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种联合型代谢标志物在制备检测、诊断或治疗肝癌产品中的应用，具有诊断效能更佳、检测方法简单易操作、灵敏度高的特点。
[0005]
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
[0006]
本发明提供了一种联合型代谢标志物在制备检测、诊断或治疗肝癌产品中的应用，所述联合型代谢标志物包括2-羟基-丁酸和2e-二十碳烯酸。
[0007]
优选的，所述产品为用于肝癌检测的芯片、试纸或试剂盒。
[0008]
优选的，所述检测为根据检测对象生物样本中2-羟基-丁酸和2e-二十碳烯酸的表达水平来判断检测对象中肝癌的疾病状况。
[0009]
优选的，所述生物样本为血清。
[0010]
优选的，所述的产品用于区分肝癌患者、健康人和肝硬化患者。
[0011]
本发明还提供了一种检测、诊断或治疗肝癌的产品，所述的产品包含特异性检测血清2-羟基-丁酸和2e-二十碳烯酸的试剂。
[0012]
优选的，所述产品为芯片、试纸或试剂盒。
[0013]
与现有技术相比，本发明技术方案具有如下有益效果：
[0014]
本发明所述含有检测2-羟基-丁酸和2e-二十碳烯酸试剂的产品在检测、诊断或治疗肝癌时，无需先排除活动性肝炎、妊娠、生殖细胞肿瘤等情况，简化了检测方法且易操作。与本领域常规肝癌诊断血清标记物甲胎蛋白(afp)相比，本发明所述2-羟基-丁酸联合2e-二十碳烯酸具有更佳的诊断效能。用于区分肝癌和非肝癌、肝癌和肝硬化患者时，本发明所述2-羟基-丁酸联合2e-二十碳烯酸的曲线下面积均比afp高，诊断效能更佳。具体的，2-羟
基-丁酸联合2e-二十碳烯酸区分肝癌及非肝癌的roc曲线下面积为0.987；用于区分肝癌及肝硬化时，2-羟基-丁酸联合2e-二十碳烯酸曲线下面积为0.982，而此时afp的曲线下面积仅为0.904。
附图说明
[0015]
图1为3组志愿者外周血血清中2-羟基-丁酸、2e-二十碳烯酸的含量比较(*表示p＜0.05，ns表示无统计学意义)；
[0016]
图2为肝癌患者血清中2-羟基-丁酸、2e-二十碳烯酸与afp相关性；
[0017]
图3为肝癌患者血清中2-羟基-丁酸、2e-二十碳烯酸与肝功能指标相关性；
[0018]
图4为afp区分肝癌、肝硬化的roc曲线；
[0019]
图5为2-羟基-丁酸联合2e-二十碳烯酸区分肝癌、肝硬化的roc曲线；
[0020]
图6为2-羟基-丁酸联合2e-二十碳烯酸区分肝癌、非肝癌的roc曲线。
具体实施方式
[0021]
本发明提供了一种联合型代谢标志物在制备检测、诊断或治疗肝癌产品中的应用，所述联合型代谢标志物包括2-羟基-丁酸和2e-二十碳烯酸。本发明具体的为根据检测对象生物样本中2-羟基-丁酸和2e-二十碳烯酸的表达水平来判断检测对象中肝癌的疾病状况。本发明对于生物样本的种类没有特殊限定，优选的为血清。本发明对于所述产品的种类没有特殊限定，采用本领域常规用于检测或诊断肝癌的产品均可，优选的为芯片、试纸或试剂盒。本发明所述的产品优选的用于区分肝癌患者、健康人和肝硬化患者。
[0022]
本发明还提供了一种检测、诊断或治疗肝癌的产品，所述的产品包含特异性检测血清2-羟基-丁酸和2e-二十碳烯酸的试剂。本发明对于所述产品的种类没有特殊限定，采用本领域常规用于检测或诊断肝癌的产品均可，优选的为芯片、试纸或试剂盒。本发明对于芯片、试纸或试剂盒中的组分没有特殊限制，含有本领域常规能够特异性检测血清2-羟基-丁酸和2e-二十碳烯酸的试剂均可。
[0023]
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0024]
实施例1
[0025]
志愿者分为肝癌患者、肝硬化患者和健康志愿者三组，三组志愿者的外周血样本收集于广东省广州市中山大学附属第一医院2016年12月至2018年12月。肝癌患者外周血27例，平均年龄52.78
±
9.42，男女比例20:7；肝硬化患者外周血23例，平均年龄47.83
±
15.10，男女比例20:3；健康志愿者外周血30例。志愿者均获得知情同意书，其中肝癌患者组的肝癌结果均经组织病理结果确认，肝硬化患者组的肝硬化结果均经磁共振成像或者b超确认。研究方案根据1975年赫尔辛基宣言伦理准则实行。
[0026]
收集三组志愿者的外周血后，置低温离心机中3000rpm，4℃离心10分钟，分离出血浆，随后进行预处理：取100ul血浆，加入400ul甲醇乙腈溶液(1:1，v/v)，涡旋60s，-20℃放置1h沉淀蛋白，14000rcf，4℃离心20min，取上清待用。使用ab triple tof 5600/6600质谱仪(ab sciex)以及agilent 1290infinity lc超高压液相色谱仪，基于超高效液相串联四极杆飞行时间二级质谱(uhplc-q-tof ms)技术，对预处理后获得的血清进行全谱分析，同
时获得一级质谱和二级质谱数据，并采用xcms对数据进行峰提取和代谢物鉴定，随后进行统计学分析，包括正交偏最小二乘判别分析(opls-da)，得到变量权重值(variable importance forthe projection,vip)衡量各代谢物的表达模式对各组样本分类判别的影响强度和解释能力，vip＞1分，同时具有统计学意义(p值＜0.05)的显著性差异代谢物，且较正常人血清质子峰差异倍数＞1.5，视为可诊断肝癌的血清代谢物，即肝癌患者血清特异性标志物。
[0027]
3组志愿者外周血血清中2-羟基-丁酸、2e-二十碳烯酸的含量结果如图1所示。由图1可以看出，在肝癌组血清中2-羟基-丁酸或2e-二十碳烯酸含量的平均值均较正常组以及肝硬化组明显升高，差异具有统计学意义，并且在正常组以及肝硬化组之间无明显差异。
[0028]
2-羟基-丁酸、2e-二十碳烯酸在正常组与肝癌组、在肝硬化组与肝癌组的检测及分析结果分别如表1、表2所示。
[0029]
表1 2-羟基-丁酸、2e-二十碳烯酸在正常组与肝癌组的检测及分析结果
[0030][0031]
由表1可知，在区分正常组与肝癌组时，2-羟基-丁酸和2e-二十碳烯酸变量权重值(vip)均＞1分，同时具有统计学意义(p值＜0.05)，且较正常人血清质子峰差异倍数也均＞1.5，所以2-羟基-丁酸和2e-二十碳烯酸均视为可诊断肝癌的血清代谢物，即肝癌患者血清特异性标志物。
[0032]
表2 2-羟基-丁酸、2e-二十碳烯酸在肝硬化组与肝癌组的检测及分析结果
[0033][0034]
由表2可知，在区分肝硬化组与肝癌组时，2e-二十碳烯酸变量权重值(vip)＞1分，同时具有统计学意义(p值＜0.05)，且较正常人血清质子峰差异倍数也＞1.5，所以2e-二十碳烯酸均视为可诊断肝癌的血清代谢物，即肝癌患者血清特异性标志物。
[0035]
经过上述内容可知，2-羟基-丁酸和2e-二十碳烯酸均可作为肝癌血清标记物。
[0036]
实施例2
[0037]
采用自动生化分析仪测定肝功能指标谷草(ast)及谷丙转氨酶(alt)，采用microlab fame酶标仪的电化学发光免疫法测定afp，采用spearman相关分析比较血清中2-羟基-丁酸、2e-二十碳烯酸表达水平和afp、经典肝功能指标(ast、alt)的相关性。结果如图2-3所示。由图2可知，我们发现2-羟基-丁酸、2e-二十碳烯酸表达与afp存在正相关关系，相关系数r分别为0.597(p＝0.001)、0.43(p＝0.028)。由图3可知，2-羟基-丁酸与肝功能指标谷丙转氨酶alt存在正相关(r＝0.412，p＝0.036)，2e-二十碳烯酸与肝功能指标谷草转氨酶ast存在正相关(r＝0.446，p＝0.022)。
[0038]
实施例3
[0039]
构建受试者工作特征(receiver operating characteristic,roc)曲线分析获取roc曲线下面积(area underthe curve,auc)值，根据约登指数最大时所对应的点确定诊断肝癌的最佳临界值，然后得到诊断肝癌的敏感度和特异性，比较血清中2-羟基-丁酸联合2e-二十碳烯酸与afp对于肝癌的诊断效能。结果如图4-6所示。
[0040]
由图4和图5可知，2-羟基-丁酸联合2e-二十碳烯酸区分肝癌及肝硬化的roc曲线下面积(0.987)高于afp的roc曲线下面积(0.904)，所以2-羟基-丁酸联合2e-二十碳烯酸区分肝癌及肝硬化的效能高于afp，且由图5可看出，2-羟基-丁酸和2e-二十碳烯酸的联合诊断效能优于2-羟基-丁酸的诊断效能。由图6可知，2-羟基-丁酸联合2e-二十碳烯酸区分肝癌及非肝癌的roc曲线下面积(0.982)高于2-羟基-丁酸的roc曲线下面积，所以2-羟基-丁酸和2e-二十碳烯酸的联合诊断效能优于2-羟基-丁酸的诊断效能。
[0041]
本发明所述2-羟基-丁酸联合2e-二十碳烯酸诊断肝癌的的敏感度、特异性分别与afp的相应数据比较，结果如表3所示：
[0042]
表3 2-羟基-丁酸联合2e-二十碳烯酸、afp对肝癌的诊断效果
[0043][0044][0045]
由表3可得，血清中2-羟基-丁酸联合2e-二十碳烯酸的诊断效能优于afp，2-羟基-丁酸联合2e-二十碳烯酸可视为一个辅助诊断肝癌的新方法。
[0046]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。