绒毛膜促性腺激素预包被酶标板、其制备方法、定量检测人尿液中HCG的方法和试剂盒与流程

绒毛膜促性腺激素预包被酶标板、其制备方法、定量检测人尿液中hcg的方法和试剂盒
技术领域
1.本发明涉及酶联免疫分析技术领域，具体而言，涉及一种绒毛膜促性腺激素预包被酶标板、其制备方法、定量检测人尿液中hcg的方法和试剂盒。


背景技术：

2.hcg定量检测是许多生物药企生产该种药物的一个重要环节，当前对于尿液中hcg的检测的技术有胶体金法、酶联免疫分析法、放射免疫分析法、化学发光免疫分析法、荧光磁微粒酶联免疫分析法和时间分辨荧光免疫分析法等。但对于药企常用的手段有胶体金法、酶联免疫分析法和荧光磁微粒酶联免疫分析法(日本东曹株式会社的全自动荧光磁微粒酶联免疫分析仪aia-360)3种：胶体金法可以大量并快速检测，成本低，但无法定量、灵敏度低、稳定性差、检测范围受限和可重复性不高；酶联免疫法可以快速大规模检测，成本低，但准确度不够，有偏差；荧光磁微粒酶联免疫分析法准确度和重复性高，但设备和耗材成本高，且无法进行大规模检测。
3.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种绒毛膜促性腺激素预包被酶标板的制备方法，其能够大批量的制备稳定性佳、保质期长的绒毛膜促性腺激素预包被酶标板，便于后续实验和检测使用，大大的节约了时间和操作成本，提升了分析效率。
5.本发明的目的在于提供一种定量检测人尿液中hcg的方法，其可以对尿液中的hcg的含量进行大规模的检测，快速且成本低，灵敏度、准确度和重复性高。
6.本发明的目的在于提供一种定量检测人尿液中hcg的试剂盒，其包含了本技术的方法中涉及到的各种试剂，从而简化了人尿液中hcg的定量检测。
7.本发明是这样实现的：
8.第一方面，本发明实施例提供一种绒毛膜促性腺激素预包被酶标板的制备方法，其包括：
9.将加有hcg单克隆抗体的酶标板置于2-8℃下保温8-12h，随后置于36-38℃孵育1-2h，接着用洗涤液对孵育后的酶标板洗板，加入封闭液进行封闭并于36-38℃孵育1-2h，随后将酶标板中所述封闭液去除；
10.其中，所述hcg单克隆抗体中hcg抗体的浓度为2-3μg/ml。
11.在可选的实施方式中，所述hcg单克隆抗体是将所述hcg抗体采用包被缓冲液进行稀释后获得的；
12.优选地，所述包被缓冲液为含有无水磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾和防腐剂的混合水溶液；其中，所述包被缓冲液中无水磷酸氢二钠的浓度为1-2g/l，氯化钠的浓度为7.5-8.5g/l，氯化钾的浓度为0.1-0.3g/l、磷酸二氢钾的浓度为0.2-0.3g/l和防腐
剂的浓度为0.4-0.6ml/l。
13.在可选的实施方式中，所述封闭液是通过将蔗糖、牛血清白蛋白与封闭缓冲液混合后制得，其中，所述蔗糖的浓度为8-12g/ml、所述牛血清白蛋白的浓度为0.4-0.6g/ml；
14.所述封闭缓冲液是无水磷酸氢二钠、二水磷酸二氢钠和防腐剂的混合水溶液，其中，所述封闭缓冲液中所述无水磷酸氢二钠的浓度为5-6g/l，二水磷酸二氢钠的浓度为1-2g/l，所述防腐剂的浓度为0.4-0.6ml/l。
15.在可选的实施方式中，将酶标板中所述封闭液去除包括：先倒扣所述酶标板使所述封闭液排出，随后将所述酶标板置于36-38℃烘干2-3h；
16.优选地，在将所述酶标板烘干后，还包括对所述酶标板进行包装和保存：将烘干后的所述酶标板每块和2-3袋干燥剂一起用保鲜膜包裹4-6层，随后置于2～8℃保存1个月或置于-10℃以下保存6个月。
17.在可选的实施方式中，将所述酶标板进行烘干包括：于36-38℃烘干2-3h。
18.第二方面，本发明实施例提供一种绒毛膜促性腺激素预包被酶标板，其是由前述实施方式任一项所述的绒毛膜促性腺激素预包被酶标板的制备方法制备而成。
19.第三方面，本发明实施例提供一种定量检测人尿液中hcg的方法，其包括：采用如前述实施方式任一项所述的绒毛膜促性腺激素预包被酶标板进行分析；
20.优选地，向所述绒毛膜促性腺激素预包被酶标板的制备方法制备获得的绒毛膜促性腺激素预包被酶标板中加入hrp标记的hcg抗体稀释液；
21.将加有不同浓度的hcg标准品溶液和不同浓度的尿液样品稀释液分别加入至所述绒毛膜促性腺激素预包被酶标板进行孵育、洗板、显色和终止，随后测定吸光度值；
22.接着将读取结果进行处理：将读取的结果按照od值从小到大排序，选出6个od数值有梯度的尿液样品用荧光磁微粒酶联免疫分析仪检测hcg的免疫效价，随后以尿液样品的od值为横坐标、免疫效价为纵坐标作标准曲线，并计算出曲线方程式；
23.其中，所述hrp标记的hcg抗体稀释液是通过将hrp标记的hcg抗体溶液用标记抗体稀释液以1:1400-1600的比例进行稀释；所述尿液样品稀释液中尿液样品的浓度为8-12μl/ml。
24.在可选的实施方式中，所述hcg标准品溶液是将hcg标准品稀释至不同梯度的浓度获得的，其中，所述hcg标准品是采用已知效价的产品稀释成hcg效价为9000-11000miu/ml的溶液。
25.在可选的实施方式中，所述尿液样品稀释液中还加入有浓度为1-3
‰
的着色剂；
26.优选地，所述着色剂为蓝色食品着色剂。
27.在可选的实施方式中，对所述酶标板进行显色包括：向所述酶标板中加入显色液并于36-38℃孵育10-15min；
28.优选地，所述显色液包括底物溶液a 0.4-0.6ml、底物溶液b 9.4-9.6ml、底物溶液c 40-45μl；
29.其中，所述底物溶液a为3,3,5,5-四甲基联苯胺和无水乙醇的混合溶液，其中，所述3,3,5,5-四甲基联苯胺的浓度为1-3mg/ml；
30.所述底物溶液b为无水磷酸氢二钠和柠檬酸的混合水溶液，所述底物溶液b中无水磷酸氢二钠的浓度为7-8g/l，柠檬酸4-6g/l；
31.所述底物溶液c为体积浓度为25-35％h2o2与水按照1：35-45比例进行稀释的水溶液。
32.第四方法，本发明实施例提供一种定量检测人尿液中hcg的试剂盒，其包括如前述实施方式任一项所述绒毛膜促性腺激素预包被酶标板；
33.优选地，所述试剂盒还包括hrp标记hcg抗体、洗涤液、显色液和终止液组成。
34.本发明具有以下有益效果：
35.本技术提供的绒毛膜促性腺激素预包被酶标板的制备方法可以制备获得保质期长，产品稳定的绒毛膜促性腺激素预包被酶标板，通过一次制作大量的绒毛膜促性腺激素预包被酶标板，便于后续实验和检测使用，大大的节约了时间和操作成本，提升了分析效率。由于尿液中绒毛膜促性腺激素的效价低，本技术提供的绒毛膜促性腺激素预包被酶标板在hcg抗体低浓度(2-3μg/ml)的情况即可进行检测，证明本技术的绒毛膜促性腺激素预包被酶标板的灵敏性高。进一步的，本技术提供的定量检测人尿液中hcg的方法通过将荧光磁微粒酶联免疫分析方法和双抗夹心酶联免疫分析方法进行结合，相对于胶体金法解决了无法定量、灵敏度低、稳定性差、检测范围受限和可重复性不高的问题；相对于单独的酶联免疫法解决了准确度不够，有偏差的问题；相对于单独的荧光磁微粒酶联免疫分析法以及其他的尖端检测技术解决了成本高和无法大规模检测的问题；综合以上情况，本技术提供的方法可以对尿液中的hcg的含量进行大规模的检测，快速且成本低(以96板为例，平均每孔成本约0.434元)，灵敏度、准确度和重复性高。优势十分明显。此外，对许多医疗卫生部门检在诊断、监控和治疗人体各种疾病等方面有着重要意义。本技术提供的定量检测人尿液中hcg的试剂盒，其包含了本技术的方法中涉及到的各种试剂，从而简化了人尿液中hcg的定量检测。
具体实施方式
36.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
37.本技术提供了一种绒毛膜促性腺激素预包被酶标板、其制备方法、定量检测人尿液中hcg的方法和试剂盒。
38.其中，绒毛膜促性腺激素预包被酶标板的制备方法包括：将加有hcg单克隆抗体的酶标板置于2-8℃下保温8-12h，随后置于36-38℃孵育1-2h，接着用洗涤液对孵育后的酶标板洗板，加入封闭液进行封闭并于36-38℃孵育1-2h，随后将酶标板中封闭液去除；其中，hcg单克隆抗体中hcg抗体的浓度为2-3μg/ml。
39.具体地，绒毛膜促性腺激素预包被酶标板的制备方法包括如下步骤：
40.s101、试剂配制
41.hcg包被抗体分装：新采购的hcg抗体(abbest；anti-h hcg mcab，郑州佰尔曼生物科技有限公司，商品编号031047001)，室温融解后，依据其标示浓度按照240μg/支(包被8块酶标板/支)的浓度计算分装体积，并进行分装，分装完后作好标记，于-10℃以下保存，在有效期内使用。
42.包被缓冲液：包被缓冲液为含有无水磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾和防腐剂的混合水溶液；其中，包被缓冲液中无水磷酸氢二钠的浓度为1-2g/l，氯化钠的浓度为7.5-8.5g/l，氯化钾的浓度为0.1-0.3g/l、磷酸二氢钾的浓度为0.2-0.3g/l和防腐剂的浓度为0.4-0.6ml/l。
43.作为典型但非限制性示例，该包被缓冲液的制备方法为：准确称量无水磷酸氢二钠1.44g，氯化钠7.9g，氯化钾0.2g，磷酸二氢钾0.24g，加纯化水800ml，搅拌至完全溶解，加入proclin 300防腐剂(闪晶生物，货号：zb116)0.5ml(浓度0.05％)，定容至1000ml，摇匀，于2～8℃保存，有效期1个月。
44.封闭缓冲液：是无水磷酸氢二钠、二水磷酸二氢钠和防腐剂的混合水溶液，其中，所述封闭缓冲液中无水磷酸氢二钠的浓度为5-6g/l，二水磷酸二氢钠的浓度为1-2g/l，防腐剂的浓度为0.4-0.6ml/l。
45.作为典型但非限制性示例，该封闭缓冲液的制备方法为：准确称量无水磷酸氢二钠5.75g，二水磷酸二氢钠1.3g，加纯化水800ml，搅拌至完全溶解，加入proclin 300防腐剂(闪晶生物，货号：zb116)0.5ml(浓度0.05％)，定容至1000ml，摇匀，于2～8℃保存，有效期1个月。
46.封闭液：是通过将蔗糖、牛血清白蛋白与封闭缓冲液混合后制得，其中，蔗糖的浓度为8-12g/ml、牛血清白蛋白的浓度为0.4-0.6g/ml。
47.作为典型但非限制性示例，该封闭液的制备方法为：准确称量蔗糖30g(浓度10％)，牛血清白蛋白(bsa)1.5g(浓度0.5％)，加入封闭缓冲液300ml，搅拌至完全溶解，即得，现配现用。
48.磷酸盐缓冲液母液(10
×
pbs)：作为典型但非限制性示例，准确称量无水磷酸氢二钠14.38g，氯化钠79g，氯化钾2g，磷酸二氢钾2.4g，加纯化水800ml，搅拌至完全溶解，定容至1000ml，摇匀，于室温保存，有效期3天。
49.洗涤液(pbst)：作为典型但非限制性示例，量取磷酸盐缓冲液母液400ml，纯化水3600ml，吐温-20 4ml(0.1％)，混合搅拌均匀，即得，现配现用。
50.应理解，上述试剂的用量可以按照上述比例进行改变或在一定范围内进行调整。
51.s102、预包被酶标板制备
52.准备：取新的酶标板16块(高吸附透明酶标板，无锡国盛生物工程有限公司，cih-f8t)，对每一块都作好标记(类别、日期及编号)，备用；
53.稀释hcg单克隆抗体：按照每块酶标板10ml取包被缓冲液(16块共需160ml)，加入烧杯中。取出分装好的hcg抗体(coating)2支，室温融解，然后全部加入包被缓冲液中，并用包被缓冲液将其润洗2遍，保证其完全转移，无残留，搅拌均匀即可。稀释好的抗体即为hcg单克隆抗体，包被用hcg单克隆抗体中hcg抗体的浓度为2-3μg/ml(优选为3μg/ml)。
54.加hcg单克隆抗体：取已稀释好的hcg抗体溶液，用8通道移液枪按100μl/孔依次加入准备好的16块空白酶标板中，其中8块为一组，共分为2组；每加完一组，检查有无漏加或多加，确认无误后即用保鲜膜包好，放入冰箱中，温度2～8℃，过夜(应至少8小时以上，优选为8-12h)。
55.孵育：次日，取出在2～8℃过夜的酶标板放入已恒温至36～38℃的恒温培养箱中，孵育1-2h。每8块为一组，共2组，先放入第1组，间隔30-50min后将第2组放入。
56.洗板：孵育时间到后，取出酶标板，用洗板机洗涤酶标板，400μl洗涤液/孔，洗涤2遍/板。洗完后将酶标板倒扣于干净的吸水滤纸上，手握酶标板用力拍打在滤纸上，拍打2～3次，观察酶标板中无残留液体即可。
57.封闭：取已配制好的封闭液，用8通道移液枪按180μl/孔依次加入洗涤好的酶标板中，其中8块为一组，共分为2组，每加完一组，检查一遍，确认无误后即用保鲜膜包好，放入恒温培养箱中，温度36～38℃，孵育2-3h。
58.干燥：孵育时间到后将酶标板取出，用力将其中的封闭液甩掉，而后将酶标板倒扣于干净的吸水滤纸上，手握酶标板用力拍打在滤纸上，观察酶标板中无残留液体即可。然后将酶标板倒扣于恒温培养箱中，一字摆开，温度36～38℃烘干，约2h左右，观察酶标板的孔中无可见液体即可。
59.s103、包装及保存
60.取已烘干的酶标板，每块和2袋干燥剂一起，用保鲜膜包裹5层，确保包裹严实，不漏气。短期保存(1个月内使用完毕)置于2～8℃；长期保存置于-10℃以下，有效期6个月。
61.通过上述制备方法制备获得的绒毛膜促性腺激素预包被酶标板可以预先进行制备，减少了定量检测人尿液中hcg的分析时间，大大节约资源，并且该绒毛膜促性腺激素预包被酶标板在较长时间内得到有效稳定的保存，取用方便。
62.此外，本技术还提供了一种定量检测人尿液中hcg的试剂盒，其包括上述绒毛膜促性腺激素预包被酶标板、hrp标记hcg抗体、洗涤液、显色液和终止液。
63.下面具体介绍试剂盒中涉及到的各种试剂的原料及其制备方法。
64.hrp标记hcg抗体分装：新采购辣根过氧化物酶(hrp)标记的hcg抗体(abbest；anti-h beta hcg mcab，labeling hrp，郑州佰尔曼生物科技有限公司，商品编号03104700201)，室温融解后，按56μl每支进行分装，分装完后作好标记，于-10℃以下保存，在有效期内使用。
65.洗涤液(pbst)：量取磷酸盐缓冲液母液400ml，纯化水3600ml，吐温-20 4ml(0.1％)，混合搅拌均匀，即得，现配现用。其中，磷酸盐缓冲液母液(10
×
pbs)：准确称量无水磷酸氢二钠14.38g，氯化钠79g，氯化钾2g，磷酸二氢钾2.4g，加纯化水800ml，搅拌至完全溶解，定容至1000ml，摇匀，室温保存，有效期1个月。
66.hcg标准品制备：取上海丽珠生物科技有限公司焦作分公司车间已知效价的产品，用样品稀释液稀释成hcg效价为9000-11000miu/ml(优选为10000miu/ml)的溶液，按0.5ml每支进行分装，分装完后作好标记，于-10℃以下保存，有效期2年。其中，样品稀释液：量取磷酸盐缓冲液母液10ml，加纯化水90ml，称量bsa 0.2g(浓度0.2％)溶解，混匀后放置冰箱2～8℃保存，有效期2天。
67.显色液：显色液包括底物溶液a0.4-0.6ml、底物溶液b 9.4-9.6ml、底物溶液c 40-45μl。作为典型但非限制性示例，准确量取底物溶液a 0.5ml、底物溶液b 9.5ml、底物溶液c 42μl，混匀即得，现用现配。(其中，显色底物a液：显色底物a液为3,3,5,5-四甲基联苯胺和无水乙醇的混合溶液，其中，3,3,5,5-四甲基联苯胺的浓度为1-3mg/ml。具体的，取50mg tmb粉末(3,3,5,5-四甲基联苯胺，艾科试剂，cas：54827-17-7)溶解于25ml无水乙醇中，混匀后放置冰箱2～8℃保存制得显色底物a液，有效期3个月。显色底物b液：为无水磷酸氢二钠和柠檬酸的混合水溶液，显色底物b液中无水磷酸氢二钠的浓度为7-8g/l，柠檬酸4-6g/
l。具体的，作为一个典型非限制性示例，取无水磷酸氢二钠3.73g，柠檬酸2.35g，加纯化水至500ml，混匀后放置冰箱2～8℃保存制得显色底物b液，有效期1个月。显色底物c液：为体积浓度为25-35％h2o2与水按照1：35-45比例进行稀释的水溶液。具体的，作为一个典型非限制性示例：取1.25ml 30％h2o2，加纯化水至50ml，混匀后放置冰箱2～8℃保存制得显色底物c液，有效期3个月)。
68.终止液：将10ml浓硫酸缓慢加入80ml纯化水中，混匀即可，室温保存，有效期3个月。
69.本技术还提供了一种定量检测人尿液中hcg的方法，其是通过将荧光磁微粒酶联免疫分析法和双抗夹心酶联免疫分析方法进行结合来定量检测人尿液中hcg。
70.具体地，其包括如下步骤：
71.向上述绒毛膜促性腺激素预包被酶标板中加入hrp标记的hcg抗体稀释液；
72.将加有不同浓度的hcg标准品溶液和不同浓度的尿液样品稀释液分别加入至绒毛膜促性腺激素预包被酶标板进行孵育、洗板、显色和终止，随后使用酶标仪在450nm/630nm双波长处测定吸光度值；
73.接着将读取结果进行处理：将读取的结果按照od值从小到大排序，选出6个od数值有梯度的尿液样品用荧光磁微粒酶联免疫分析仪检测hcg的免疫效价，随后以样品的od值为横坐标、免疫效价为纵坐标作标准曲线，并计算出曲线方程式；
74.其中，hrp标记的hcg抗体稀释液是通过将hrp标记的hcg抗体溶液用酶标记抗体稀释液以1:1400-1600的比例进行稀释；其中尿液样品稀释液中尿液样品的浓度为8-12μl/ml。
75.更具体地，包括如下步骤：
76.s201、准备
77.至少提前30min将检测所需使用的hcg酶标板、酶标记抗体稀释液、显色底物a液、显色底物b液、显色底物c液、终止液从冰箱冷藏室中取出，放置在室温环境下平衡。
78.s202、按照上述试剂盒中的试剂进行配制。
79.s203、配制hcg标准溶液
80.取分装好的hcg标准品(10000miu/ml)一支，室温融解。取一支10ml离心管准确量取样品稀释液9.9ml，加入0.1ml的hcg标准品，震荡10～30s混匀，得到效价为100miu/ml的hcg溶液。另取1.5ml的离心管5支，按照下表分别加入效价为100miu/ml的hcg溶液，用样品稀释液配成效价为0miu/ml、8-12miu/ml、18-22miu/ml、38-42miu/ml、58-62miu/ml、78-82miu/ml的hcg标准溶液。
81.标准溶液浓度100miu/ml的hcg溶液加入量样品稀释液加入量0miu/ml0μl1000μl8-12miu/ml80-120μl880-920μl18-22miu/ml180-220μl780-820μl38-42miu/ml380-420μl580-620μl58-62miu/ml580-620μl380-420μl78-82miu/ml780-820μl180-220μl
82.hcg标准溶液作为酶联免疫反应的外标(同时作为阴性和阳性对照)，在酶标结束
读数后，分别以标准溶液的od值为横坐标，标准溶液浓度(即标准溶液的梯度效价)为纵坐标作标准曲线，并计算曲线方程式，根据标准溶液的od值及标准曲线方程的r2值监控整个酶联免疫反应。
83.应理解，hcg标准溶液的浓度梯度还可以有其他选择。
84.s204、稀释尿液样品：
85.取1.5ml离心管，加入990μl样品稀释液(样品稀释液提前加入0.2
‰
顶好复配食品着色剂，蓝色，水油两用色素，东莞市金佳禾食品有限公司)，再加入10μl样品，涡旋混匀即得尿液样品稀释液。
86.s205、稀释hrp标记hcg抗体
87.取酶标记抗体稀释液5.5ml、hrp标记的hcg抗体溶液3.5μl，即约1:1500比例稀释，混匀。使用当天配制，其中，酶标记抗体稀释液为市售购买获得，商品名为：hrp藕联物稳定剂/稀释剂ii，购买厂家为：湖州英创生物科技有限公司，产品编号：hrp-sd-002。
88.s206、加hrp标记hcg抗体
89.取已提前室温平衡好的酶标板，用8通道排枪每孔加入50μl已稀释好的hrp标记hcg抗体。
90.s207、加尿液稀释样品和标准溶液
91.将浓度0miu/ml、8-12miu/ml、18-22miu/ml、38-42miu/ml、58-62miu/ml、78-82miu/ml的hcg标准品溶液，每孔50μl，每个梯度重复2-3孔，然后加入稀释好的多个尿液样品(大于6个尿液样品)，每孔50μl。每个尿液样品重复2-3孔。加样结束，将酶标板放进36～38℃的恒温培养箱中孵育30min。
92.s208、洗板
93.按照洗板机使用规程使用洗板机洗板3次，末次将酶标板在吸水纸上拍干。
94.s209、显色
95.每孔加入100μl显色液(现配现用)，36～38℃的恒温培养箱孵育10-15min。
96.s210、终止
97.每孔加入50μl终止液，终止反应。
98.s211、读数
99.将加完终止液的酶标板在桌面上轻轻晃动混匀，然后放入酶标仪中，按照酶标仪操作规程操作，于波长450/630nm双波长处，酶标仪测定吸光度值。
100.s212、结果换算
101.将读取的结果按照od值从小到大排序，选出6个od数值有梯度(可参考6个hcg标准溶液点的位置)的不同尿液样品用东曹株式会社的全自动荧光磁微粒酶联免疫分析仪aia-360检测hcg免疫效价。以尿液样品的od值为横坐标、aia-360全自动分析仪检测出的免疫效价为纵坐标作标准曲线，并计算出曲线方程式。
102.在进行尿液样品的免疫效价检测时，只需要将各尿液样品按照上述方法测定的od值代入方程式中即可计算出各尿液样品的免疫效价。
103.本技术提供的定量检测人尿液中hcg的方法通过将荧光磁微粒酶联免疫分析方法和双抗夹心酶联免疫分析方法进行结合，相对于胶体金法解决了无法定量、灵敏度低、稳定性差、检测范围受限和可重复性不高的问题；相对于单独的酶联免疫法解决了准确度不够，
有偏差的问题；相对于单独的荧光磁微粒酶联免疫分析法以及其他的尖端检测技术解决了成本高和无法大规模检测的问题；综合以上情况，本技术提供的方法可以对尿液中的hcg的含量进行大规模的检测，快速且成本低(以96板为例，平均每孔成本约0.434元)，灵敏度、准确度和重复性高。优势十分明显。此外，对许多医疗卫生部门在诊断、监控和治疗人体各种疾病等方面有着重要意义。
104.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
105.实施例1
106.s1、孕尿中hcg免疫效价酶标法测定用预包被酶标板制备
107.s101、试剂配制
108.hcg包被抗体分装：新采购的hcg抗体(abbest；anti-h hcg mcab，郑州佰尔曼生物科技有限公司，商品编号031047001)，室温融解后，依据其标示浓度按照240μg/支(包被8块酶标板/支)的浓度计算分装体积，并进行分装，分装完后作好标记，于-10℃以下保存，在有效期内使用。
109.包被缓冲液：准确称量无水磷酸氢二钠1.44g，氯化钠7.9g，氯化钾0.2g，磷酸二氢钾0.24g，加纯化水800ml，搅拌至完全溶解，加入proclin 300防腐剂(闪晶生物，货号：zb116)0.5ml(浓度0.05％)，定容至1000ml，摇匀，于2～8℃保存，有效期1个月。
110.封闭缓冲液：准确称量无水磷酸氢二钠5.75g，二水磷酸二氢钠1.3g，加纯化水800ml，搅拌至完全溶解，加入proclin 300防腐剂(闪晶生物，货号：zb116)0.5ml(浓度0.05％)，定容至1000ml，摇匀，于2～8℃保存，有效期1个月。
111.封闭液：准确称量蔗糖30g(浓度10％)，bsa 1.5g(浓度0.5％)，加入封闭缓冲液300ml，搅拌至完全溶解，即得，现配现用。
112.磷酸盐缓冲液母液(10
×
pbs)：准确称量无水磷酸氢二钠14.38g，氯化钠79g，氯化钾2g，磷酸二氢钾2.4g，加纯化水800ml，搅拌至完全溶解，定容至1000ml，摇匀，于室温保存，有效期3天。
113.洗涤液(pbst)：量取磷酸盐缓冲液母液400ml，纯化水3600ml，吐温-20 4ml(0.1％)，混合搅拌均匀，即得，现配现用。
114.s102、预包被酶标板制备
115.准备：取新的酶标板16块(高吸附透明酶标板，无锡国盛生物工程有限公司，cih-f8t)，对每一块都作好标记(类别、日期及编号)，备用；
116.稀释hcg单克隆抗体：按照每块酶标板10ml取包被缓冲液(16块共需160ml)，加入烧杯中。取出分装好的hcg抗体(coating)2支，室温融解，然后全部加入包被缓冲液中，并用包被缓冲液将其润洗2遍，保证其完全转移，无残留，搅拌均匀即可。稀释好的抗体终浓度为3μg/ml。
117.加hcg单克隆抗体：取已稀释好的hcg抗体溶液，用8通道移液枪按100μl/孔依次加入准备好的16块空白酶标板中。其中8块为一组，共分为2组；每加完一组，检查有无漏加或多加，确认无误后即用保鲜膜包好，放入冰箱中，温度2～8℃，过夜(应至少8小时以上)。
118.孵育：次日，取出在2～8℃过夜的酶标板放入已恒温至36～38℃的恒温培养箱中，孵育1h。每8块为一组，共2组，先放入第1组，间隔40min后将第2组放入。
119.洗板：孵育时间到后，取出酶标板，用洗板机洗涤酶标板，400μl洗涤液/孔，洗涤2
遍/板。洗完后将酶标板倒扣于干净的吸水滤纸上，右手握酶标板用力拍打在滤纸上，拍打2～3次，观察酶标板中无残留液体即可。
120.封闭：取已配制好的封闭液，用8通道移液枪按180μl/孔依次加入洗涤好的酶标板中。其中8块为一组，共分为2组，每加完一组，检查一遍，确认无误后即用保鲜膜包好，放入恒温培养箱中，温度36～38℃，孵育2h。
121.干燥：孵育时间到后将酶标板取出，用力将其中的封闭液甩掉，而后将酶标板倒扣于干净的吸水滤纸上，手握酶标板用力拍打在滤纸上，拍打2～3次，观察酶标板中无残留液体即可。然后将酶标板倒扣于恒温培养箱中，一字摆开，温度36～38℃烘干，约2h左右，观察酶标板的孔中无可见液体即可。
122.s103、包装及保存
123.取已烘干的酶标板，每块和2袋干燥剂一起，用保鲜膜包裹5层，确保包裹严实，不漏气。短期保存(1个月内使用完毕)置于2～8℃；长期保存置于-10℃以下，有效期6个月。
124.s2、孕尿中hcg免疫效价检测
125.s201、准备
126.至少提前30min将检测所需使用的hcg酶标板、酶标记抗体稀释液、显色底物a液、显色底物b液、显色底物c液、终止液从冰箱冷藏室中取出，放置在室温环境下平衡。
127.s202、试剂配制
128.hrp标记hcg抗体分装：新采购hrp标记的hcg抗体(abbest；anti-h beta hcg mcab，labeling hrp，郑州佰尔曼生物科技有限公司，商品编号03104700201)，室温融解后分装，作好标记，于-10℃以下保存，在有效期内使用。
129.磷酸盐缓冲液母液(10
×
pbs)：准确称量无水磷酸氢二钠14.38g，氯化钠79g，氯化钾2g，磷酸二氢钾2.4g，加纯化水800ml，搅拌至完全溶解，定容至1000ml，摇匀，室温保存，有效期1个月。
130.洗涤液(pbst)：量取磷酸盐缓冲液母液400ml，纯化水3600ml，吐温-20 4ml(0.1％)，混合搅拌均匀，即得，现配现用。
131.样品稀释液：量取磷酸盐缓冲液母液10ml，加纯化水90ml，称量bsa0.2g(浓度0.2％)溶解，混匀后放置冰箱2～8℃保存，有效期2天。
132.hcg标准品制备：取上海丽珠生物科技有限公司焦作分公司车间已知效价的产品，用样品稀释液稀释成hcg效价为10000miu/ml的溶液，按0.5ml每支进行分装，分装完后作好标记，于-10℃以下保存，有效期2年。
133.显色底物a液：取50mg tmb粉末(3,3,5,5-四甲基联苯胺，艾科试剂，cas：54827-17-7)溶解于25ml无水乙醇中，混匀后放置冰箱2～8℃保存，有效期3个月。
134.显色底物b液：取无水磷酸氢二钠3.73g，柠檬酸2.35g，加纯化水至500ml，混匀后放置冰箱2～8℃保存，有效期1个月。
135.显色底物c液：取1.25ml 30％h2o2，加纯化水至50ml，混匀后放置冰箱2～8℃保存，有效期3个月。
136.显色液：准确量取底物溶液a0.5ml、底物溶液b 9.5ml、底物溶液c 42μl，混匀即得，现用现配。
137.终止液：将10ml浓硫酸缓慢加入80ml纯化水中，混匀即可，室温保存，有效期3个
月。
138.s203、配制hcg标准溶液
139.取分装好的hcg标准品(10000miu/ml)一支，室温融解。取一支10ml离心管准确量取样品稀释液9.9ml，加入0.1ml的hcg标准品，震荡10～30s混匀，得到100miu/ml的hcg溶液。另取1.5ml的离心管5支，按照下表分别加入100miu/ml的hcg溶液和样品稀释液配成0miu/ml、10miu/ml、20miu/ml、40miu/ml、60miu/ml、80miu/ml的hcg标准溶液。
140.标准溶液浓度100miu/ml的hcg溶液加入量样品稀释液加入量0miu/ml0μl1000μl10miu/ml100μl900μl20miu/ml200μl800μl40miu/ml400μl600μl60miu/ml600μl400μl80miu/ml800μl200μl
141.hcg标准溶液作为酶联免疫反应的外标(同时作为阴性和阳性对照)，在酶标结束读数后，分别以标准溶液的od值为横坐标，0miu/ml、10miu/ml、20miu/ml、40miu/ml、60miu/ml、80miu/ml为纵坐标作标准曲线，并计算曲线方程式，根据标准溶液的od值及标准曲线方程的r2值监控整个酶联免疫反应。
142.s204、稀释尿液样品：
143.取1.5ml离心管，加入990μl样品稀释液(样品稀释液提前加入0.2
‰
顶好复配食品着色剂，蓝色，水油两用色素，东莞市金佳禾食品有限公司)，再加入10μl样品，涡旋混匀。
144.s205、稀释hrp标记hcg抗体
145.取样品稀释液5.5ml、hrp标记的hcg抗体溶液3.5μl，即约1:1500比例稀释，混匀。使用当天配制。
146.s206、加hrp标记hcg抗体
147.取已提前室温平衡好的酶标板，用8通道排枪每孔加入50μl已稀释好的hrp标记hcg抗体。
148.s207、加尿液稀释样品和标准溶液(一步孵育，hrp标记hcg抗体和样品同时加入酶标板孵育)
149.将浓度0miu/ml、10miu/ml、20miu/ml、40miu/ml、60miu/ml、80miu/ml的hcg标准品溶液加入酶标板，每孔50μl，每个浓度重复2孔，然后加入稀释好的不同的尿液样品，每孔50μl，每个尿液样品重复2孔。加样结束，将酶标板放进36～38℃的恒温培养箱中孵育30min。
150.s208、洗板
151.按照洗板机使用规程使用洗板机洗板3次，末次将酶标板在吸水纸上拍干。
152.s209、显色
153.每孔加入100μl显色液(现配现用)，36～38℃的恒温培养箱孵育10-15min。
154.s210、终止
155.每孔加入50μl终止液，终止反应。
156.s211、读数
157.将加完终止剂的酶标板在桌面上轻轻晃动混匀，然后放入酶标仪中，按照酶标仪
操作规程操作，于波长450/630nm双波长处，酶标仪测定吸光度值。
158.s212、结果换算
159.将读取的结果按照od值从小到大排序，选出6个od数值有梯度(可参考6个hcg标准溶液点的位置)的尿液样品用东曹株式会社的全自动荧光磁微粒酶联免疫分析仪aia-360检测hcg免疫效价。以样品的od值为横坐标、aia-360全自动分析仪检测出的免疫效价为纵坐标作标准曲线，并计算出曲线方程式。
160.在进行尿液样品的免疫效价检测时，只需要将各尿液样品按照上述方法测定的od值带入方程式中即可计算出各尿液样品的免疫效价。
161.实施例2
162.本实施例基本与实施例1相同，区别在于，实施例1中是采用hrp标记hcg抗体和样品同时加入酶标板后进行一步孵育。
163.而本实施例中进行两步孵育：先加入样品，将酶标板放进36～38℃的恒温培养箱中孵育30min，随后再向酶标板中加入hrp标记hcg抗体，再将酶标板放进36～38℃的恒温培养箱中孵育30min。
164.实施例3
165.本实施例基本与实施例1相同，区别在于，本实施例中显色液中显色底物a液、显色底物b液和显色底物c液用量和实施例1不同。
166.本实施例中，显色液包括显色底物a液0.4ml、显色底物b液9.6ml、显色底物c液45μl；
167.其中，显色底物a液：取50mg tmb粉末溶解于50ml无水乙醇中，混匀后放置冰箱2～8℃保存，有效期3个月。
168.显色底物b液：取无水磷酸氢二钠4g，柠檬酸6g，加纯化水至500ml，混匀后放置冰箱2～8℃保存，有效期1个月。
169.显色底物c液：取1.35ml 30％h2o2，加纯化水至50ml，混匀后放置冰箱2～8℃保存，有效期3个月。
170.对比例1
171.对比例1仅采用荧光磁微粒酶联免疫分析法进行分析。
172.具体地，将选取的尿液样品直接置于东曹株式会社的全自动荧光磁微粒酶联免疫分析仪aia-360，直接检测获得hcg免疫效价。
173.对比例2
174.对比例2仅采用双抗夹心酶联免疫分析方法进行分析。
175.具体地：将选取的尿液样品按照实施例1的操作条件(s201-s211步骤)操作，检测尿液样品的吸光度值，将尿液样品的吸光光度值代入步骤s203获得的标准曲线(以标准溶液的od值为横坐标，标准溶液的免疫效价梯度0miu/ml、10miu/ml、20miu/ml、40miu/ml、60miu/ml、80miu/ml为纵坐标)中，计算尿液样品的免疫效价。
176.对比例3
177.其与实施例1基本相同，区别在于：对比例3中省略“取出在2～8℃过夜的酶标板放入已恒温至36～38℃的恒温培养箱中，孵育1h”的步骤，仅仅进行温度2～8℃、过夜的操作。
178.对比例4
179.对比例4与实施例1基本相同，区别在于，对比例4中的封闭液与实施例1不同：
180.对比例4中的封闭液为：20％新生牛血清，0.01mol/l pbs溶液。
181.对比例5
182.对比例5与实施例1基本相同，区别在于，对比例5中的包被缓冲液与实施例1不同：
183.对比例5中的包被缓冲液为：ph9.6碳酸盐，分别称量na2co
3 1.59g、nahco
3 2.93g，用去离子水溶解后补加水至1l。
184.一、对比实验分析
185.将上述实施例1-3以及对比例1-5提供的分析方法对3个尿液样品分别进行5次平行实验以测定3个尿液样品的免疫效价，结果如表1；各实验5次平行结果的标准偏差(sd)、平均值(m)、变异系数(c.v)，结果见表2，其中c.v＝sd/m
×
100％：
186.表1：实施例1-3、对比例1-5测定获得的样品1-3的免疫效价
[0187][0188][0189]
表2：实施例1-3、对比例1-5的结果分析
[0190][0191]
实施例1-3与对比例1-5结果分析：实施例1-3与对比例1、2、4的c.v值均低于5％，说明方法的重复性较好，对比例3、5的c.v值较高，说明重复性较差，而从实施例1-3与对比例1的平均值(m)显示的结果可以看出，实施例1-3获得的免疫效价与对比例1几乎一致，说明本技术的方法结果准确，由于本技术提供的方法只需要利用东曹株式会社的全自动荧光磁微粒酶联免疫分析仪aia-360检测6个尿液样品的免疫效价，后续的尿液样品直接测定吸光度，通过步骤s121的标准曲线即可获得该尿液样品的免疫效价，针对96孔酶标板而言，相较于将所有的尿液样品均利用东曹株式会社的全自动荧光磁微粒酶联免疫分析仪aia-360检测免疫效价而言，本技术的方法比对比例1的成本低了约42倍(具体地，以96板为例，平均每孔成本约0.434元)，对比例2的检测结果与对比例1比较有较大的误差，说明仅采用双抗夹心酶联免疫分析方法的结果不稳定；对比例3的结果与对比例1的结果具有较大的误差，说明仅仅进行温度2～8℃、过夜的操作会导致孵育不完全，制备获得的绒毛膜促性腺激素预包被酶标板产品质量欠佳，对后续的分析产生影响，且重复性不佳。对比例4与对比例1结果几乎一致且c.v值较低，但实施例1中选用牛血清白蛋白作为封闭液的时，其成本约为0.26元/96孔，对比例4选用新生牛血清作为封闭液的时，其成本约为7元/96孔，可以看出，对比例4中包被用的新生牛血清增加了检测成本，且液态的新生牛血清开封后易长菌，不如牛白蛋白易保存；对比例5的实验结果与对比例1具有较大的差异，并且c.v值较高，重复性较差，说明本技术实施例1选择的包被缓冲液可以提高结果的准确性。
[0192]
二、稳定性实验分析
[0193]
将实施例1制备获得的绒毛膜促性腺激素预包被酶标板存放于-10℃冰箱中保存，于7天、14天、30天、60天、120天、180天时检测酶标板的稳定性，检测结果请参阅表3。
[0194]
表3：稳定性实验结果
[0195][0196]
稳定性实验结果分析：绒毛膜促性腺激素预包被酶标板于-10℃存放180天后，其各标准品的od值没有明显降低，且r2值≥0.99，说明本技术提供的绒毛膜促性腺激素预包被酶标板的制备方法制备获得的绒毛膜促性腺激素预包被酶标板稳定性较好。
[0197]
综上所述，本技术提供的绒毛膜促性腺激素预包被酶标板的制备方法可以制备获得保质期长，产品稳定的绒毛膜促性腺激素预包被酶标板，通过一次制作大量的绒毛膜促性腺激素预包被酶标板，便于后续实验和检测使用，大大的节约了时间和操作成本，提升了分析效率。进一步的，本技术提供的定量检测人尿液中hcg的方法通过将荧光磁微粒酶联免疫分析方法和双抗夹心酶联免疫分析方法进行结合，相对于胶体金法解决了无法定量、灵敏度低、稳定性差、检测范围受限和可重复性不高的问题；相对于单独的酶联免疫法解决了准确度不够，有偏差的问题；相对于单独的荧光磁微粒酶联免疫分析法以及其他的尖端检测技术解决了成本高和无法大规模检测的问题；综合以上情况，本技术提供的方法可以对尿液中的hcg的含量进行大规模的检测，快速且成本低(以96板为例，平均每孔成本约0.434元)，灵敏度、准确度和重复性高。优势十分明显。此外，对许多医疗卫生部门检在诊断、监控和治疗人体各种疾病等方面有着重要意义。本技术提供的定量检测人尿液中hcg的试剂盒，其包含了本技术的方法中涉及到的各种试剂，从而简化了人尿液中hcg的定量检测。
[0198]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。